孔梓安 宋想勝 程如楠 甄思慧 吳竹青 吳清民 王 真*

(1.北京農(nóng)學(xué)院 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院/獸醫(yī)學(xué)(中獸醫(yī))北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102206； 2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,北京 100193)

牛病毒性腹瀉-黏膜病(Bovine viral diarrhea，BVD)，是由牛病毒性腹瀉病毒引起的一種以發(fā)熱、黏膜糜爛、潰瘍、腹瀉、咳嗽及懷孕母牛流產(chǎn)或產(chǎn)出畸形胎兒為主要特征的傳染病。目前該病在全世界均有報(bào)道，許多養(yǎng)牛發(fā)達(dá)國(guó)家都是該病的重災(zāi)區(qū)。美國(guó)的養(yǎng)牛場(chǎng)有一半檢測(cè)出牛病毒性腹瀉-黏膜病病毒(Bovine viral diarrhea virus，BVDV)；加拿大部分地區(qū)陽(yáng)性率達(dá)83%；甚至在澳大利亞以及新西蘭的BVDV感染率高達(dá)近90%。隨著我國(guó)畜牧養(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展，已經(jīng)成為養(yǎng)牛大國(guó)，根據(jù)我國(guó)各地BVD的血清學(xué)調(diào)查與統(tǒng)計(jì)，陽(yáng)性率遠(yuǎn)高于過(guò)去，牛病毒性腹瀉病流行呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，并在全國(guó)范圍內(nèi)流行，給養(yǎng)牛業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。BVDV為正鏈RNA病毒，蛋白在基因組的順序依次為5’-P20-P14-gP48-gP25-gP53-gP125(P54/P80)-P10-P30-P133(P58/P75)-3’。其中，gP48基因編碼蛋白是重要的結(jié)構(gòu)蛋白，既是構(gòu)成病毒粒子的一種外殼蛋白，又是病毒僅有的兩種保護(hù)性抗原之一，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，并且有較高的保守性，是診斷試劑開(kāi)發(fā)和亞單位基因工程疫苗研究的候選抗原之一。

目前BVDV主要通過(guò)血清中和試驗(yàn)、瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)、ELISA和RT-PCR等技術(shù)進(jìn)行診斷，其中病毒分離鑒定、熒光免疫以及血清中和試驗(yàn)等方法非常耗時(shí)，且需專業(yè)人員操作，不利于臨床疾病的快速診斷；ELISA方法操作相對(duì)簡(jiǎn)單，且可以進(jìn)行批量檢測(cè)，是目前臨床疾病診斷的首選方法之一，然而B(niǎo)VDV ELISA檢測(cè)試劑盒基本上被國(guó)外公司壟斷，價(jià)格昂貴，購(gòu)買周期太長(zhǎng)，不適用于我國(guó)牛群的早期、快速診斷。因此，有必要建立一種敏感性高，檢測(cè)成本低且適合大規(guī)模檢測(cè)的ELISA 方法為國(guó)產(chǎn)試劑盒做技術(shù)儲(chǔ)備。ELISA方法核心材料的選擇和準(zhǔn)備是診斷試劑研發(fā)的關(guān)鍵。單鏈抗體(Single-chain Fv，ScFv)是一種通過(guò)15～20個(gè)氨基端殘基短肽將抗體的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)連接起來(lái)的新型基因工程抗體。與傳統(tǒng)抗體相比，更易于在原核細(xì)胞表達(dá)和在基因水平進(jìn)行改造。此外，單鏈抗體不僅可大量生產(chǎn)且成本較低，其分子量與免疫原性也很低，是一種理想的ELISA新型原材料。目前單鏈抗體技術(shù)在疾病治療、預(yù)防以及腫瘤影像分析上都有應(yīng)用。王麗娟等構(gòu)建了抗非洲豬瘟病毒(ASFV)的豬源噬菌體單鏈抗體文庫(kù)，從中篩選出可以穩(wěn)定表達(dá)的豬源ScFv。經(jīng)ELISA方法測(cè)定結(jié)果顯示，純化后的單鏈抗體蛋白存在良好的 ASFV 反應(yīng)活性。該抗體的成功制備填補(bǔ)了目前市場(chǎng)上 ASFV ScFv的空白，為 ASFV 診斷與防控提供了新型原材料。謝崇等利用大腸桿菌表達(dá)了具有中和活性的重組穿梭肽-狂犬病單鏈抗體，經(jīng)ELISA檢測(cè)重組抗體具有較高的親和力，該重組單鏈抗體可用于狂犬病治療的特異性和靶向性抗病毒藥物載體。Sengupta等利用噬菌體展示系統(tǒng)制備了針對(duì)禽流感病毒(AIV)核蛋白(NP)的ScFv, 以單鏈抗體為基礎(chǔ)建立的CI-ELISA方法對(duì)850多份血清進(jìn)行血凝抑制(HI)試驗(yàn)敏感性為100%，特異性為98.7%，進(jìn)行瓊脂免疫擴(kuò)散(AGID)試驗(yàn)敏感性和特異性均為100%。

為探討單鏈抗體在BVD診斷試劑研發(fā)中的應(yīng)用前景，本研究用BVDV gP48蛋白對(duì)小鼠進(jìn)行免疫，利用噬菌體展示技術(shù)構(gòu)建gP48蛋白鼠源噬菌體單鏈抗體克隆庫(kù)，進(jìn)行富集，篩選與gP48蛋白具有高結(jié)合活性的特異性單鏈抗體，為基于單鏈抗體的BVD疾病ELISA檢測(cè)方法的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

6～8周齡BALB/c小鼠(雌)，購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。

1.2 主要試劑

HRP m13抗體購(gòu)自北京義翹神州科技有限公司；顯色液TMB A和TMB B購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；PCR master mix，弗氏佐劑、瓊脂糖、DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)等試劑購(gòu)自生工生物工程股份有限公司；普通SU5aLpha F`細(xì)胞、長(zhǎng)鏈?zhǔn)删w載體、輔助噬菌體M13K07購(gòu)自盛世君聯(lián)生物技術(shù)有限公司；Trizol試劑購(gòu)自普洛麥格生物技術(shù)有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自康為世紀(jì)生物科技有限公司；膠回收試劑盒購(gòu)自百泰克生物技術(shù)有限公司。

1.3 gP48蛋白的原核表達(dá)

gP48蛋白原核表達(dá)載體由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建，誘導(dǎo)表達(dá)和純化的gP48蛋白保存于-80 ℃低溫冰柜，質(zhì)量濃度為2 mg/mL。

1.4 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)NCBI中登錄的BVDV序列(Genbank：MW732738.1)，利用Primer Premier 5軟件設(shè)計(jì)ScFv擴(kuò)增引物，序列詳情見(jiàn)表1，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 本研究的引物序列信息
Table 1 Information of primer sequences in the study

引物名稱Primer name引物序列(5'- 3')Primer sequence (5'-3')ScFv-1CTACAAATGCCTATGCATCTAGAGACTACAAAGScFv-2CAGCATTGACAGGAGGTTGGAATTCG

1.5 小鼠免疫

為建立免疫文庫(kù)擴(kuò)增單鏈抗體基因，對(duì)小鼠進(jìn)行3次免疫。首次免疫將gP48蛋白抗原(100 μg/只)用弗氏完全佐劑乳化后頸背部皮下多點(diǎn)注射小鼠，第二次和第三次免疫將gP48蛋白抗原(50 μg/只)用弗氏不完全佐劑乳化，頸背部皮下多點(diǎn)注射。首免與二免間隔 18 d，二免與三免間隔 15 d。經(jīng)3次免疫的小鼠用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.6 單鏈抗體基因的擴(kuò)增

無(wú)菌分離3次免疫后的小鼠脾臟，通過(guò)TRIZol方法提取脾RNA，并檢測(cè)RNA濃度和純度。用cDNA合成試劑盒進(jìn)行小鼠cDNA的合成，以此為模板，擴(kuò)增抗體的輕鏈(VL)和重鏈(VH)可變區(qū)。以單鏈抗體的形式組裝VH和VL中的多肽接頭核苷酸序列。PCR完成后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳、膠回收純化目的片段。制備VH的DNA模板 50 ng和VL的DNA模版 50 ng，作為單鏈抗體擴(kuò)增的模板，進(jìn)行重疊延伸PCR，瓊脂糖凝膠電泳和膠回收純化單鏈抗體基因序列。PCR反應(yīng)體系50 μL(10×Pfu Buffer 5 μL、dNTP 4 μL、Pfu DNA聚合酶 0.5 μL、VH DNA 2 μL、VL DNA 2 μL、引物各1.5 μL、5×GC Buffer 10 μL、ddHO 23.5 μL)；PCR 反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，循環(huán)35次，72 ℃終延伸5 min。

1.7 構(gòu)建重組噬菌粒

將長(zhǎng)鏈?zhǔn)删w載體用

Xba

I和

EcoR

I進(jìn)行雙酶切，獲得線性化載體。與上述擴(kuò)增的單鏈抗體基因通過(guò)Gibson assembly反應(yīng)：50 ℃，15 min，得到重組噬菌粒。37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜，之后接種于2 L的2YT/carb/kan培養(yǎng)液中，37 ℃ 200 r/min震蕩培養(yǎng)，計(jì)算庫(kù)容。計(jì)算公式：抗體克隆庫(kù)容量(抗體個(gè)數(shù)/mL)=單菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)÷10(計(jì)數(shù)時(shí)取10 μL)×1 000，其中由于取10 μL克隆庫(kù)進(jìn)行鑒定，故÷10可以得到抗體個(gè)數(shù)/μL，再×1 000可以得到抗體個(gè)數(shù)/mL。

1.8 噬菌體抗體庫(kù)的富集淘篩

取輔助噬菌體M13K07加入初級(jí)抗體庫(kù)菌液中，37 ℃振蕩1.5 h進(jìn)行噬菌體的侵染及重組質(zhì)粒的整合，然后利用PEG8 000/NaCl對(duì)重組噬菌體進(jìn)行沉降富集。以gP48蛋白包被酶聯(lián)免疫板，加入重組噬菌體孵育后，用PBST將非特異性的噬菌體洗去，再使用洗脫液(0.2 mol/LGly-HCl，pH 2.5)洗脫特異性噬菌體，把洗脫下來(lái)的噬菌體侵染處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SU5alpha F’細(xì)菌進(jìn)行選擇性富集。通過(guò)上述微孔板篩選法對(duì)抗體庫(kù)進(jìn)行3輪富集淘篩。

1.9 ELISA檢測(cè)條件的優(yōu)化

以gP48蛋白為包被抗原，建立篩選針對(duì)gP48蛋白的陽(yáng)性噬菌體單鏈抗體的間接 ELISA 方法，分別對(duì)蛋白包被濃度、包被條件、封閉液種類及封閉時(shí)間，一抗和二抗孵育時(shí)間等基本條件進(jìn)行確定，以期篩選到陽(yáng)性值較高的單鏈抗體。

1.10 單鏈抗體序列分析及抗體結(jié)合活性測(cè)定

從三輪淘選后的LB/carb平板上隨機(jī)挑取112個(gè)單菌落于含有輔助噬菌體M13K07的1 mL 2YT/carb的培養(yǎng)基中，37 ℃ 200 r/min過(guò)夜培養(yǎng)。第二天10 000 r/min離心15 min，利用優(yōu)化的ELISA篩選陽(yáng)性噬菌體單鏈抗體。吸取50 μL單克隆上清液至1.5 mL離心管中在沸水中煮10 min。使用ScFv的上、下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定后測(cè)序。

其中測(cè)序正確的克隆進(jìn)行ELISA檢測(cè)，根據(jù)ODnm值判定單鏈抗體結(jié)合活性，結(jié)合活性越好ODnm值越高。

2 結(jié)果與分析

2.1 單鏈抗體基因的擴(kuò)增

以小鼠cDNA作為模板分別擴(kuò)增VH和VL基因片段，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳如圖1(a)所示，分別擴(kuò)增出大小約400 bp的VH和VL序列，與預(yù)期長(zhǎng)度相符合。接著以VH和VL的DNA作為模板，進(jìn)行重疊PCR擴(kuò)增。如圖1(b)所示，成功獲得大小約800 bp的目的條帶，說(shuō)明VH和VL基因連接成功。

M, DNA標(biāo)記；1,VH擴(kuò)增片段;2,VL擴(kuò)增片段;N,陰性對(duì)照；3，擴(kuò)增條帶。 M, DNA marker; 1, VH fragment; 2, VL fragment; N, negative control; 3, amplified fragments.圖1 VH和VL片段的PCR擴(kuò)增(a)及重疊PCR擴(kuò)增(b)Fig.1 PCR amplification (a) and overlap PCR amplification (b) of VH and VL fragments

2.2 抗體克隆庫(kù)庫(kù)容量計(jì)算以及重組率的鑒定

根據(jù)抗體克隆庫(kù)庫(kù)容量計(jì)算公式，本研究構(gòu)建的抗體克隆庫(kù)庫(kù)容量為：4.3×10CFU/mL。隨機(jī)挑選18個(gè)單菌落培養(yǎng)并進(jìn)行PCR驗(yàn)證，結(jié)果如圖2 所示，重組率為83.3%。

M：marker; 1～18：樣品。 M: marker; 1-18: Strain samples.圖2 抗體克隆庫(kù)菌株的PCR鑒定Fig.2 PCR identification of antibody clone library strains

2.3 噬菌體抗體庫(kù)的富集

抗體克隆初始文庫(kù)經(jīng)調(diào)整噬菌體滴度為5×10CFU/mL，用96孔微孔板法對(duì)噬菌體抗體庫(kù)進(jìn)行了3輪“吸附-洗脫-富集”，對(duì)每一輪的輸入和輸出噬菌體進(jìn)行滴度測(cè)定，其中富集倍數(shù)用來(lái)衡量抗體庫(kù)分離并富集的效果，其數(shù)值越高效果越好。結(jié)果見(jiàn)表2，每輪經(jīng)過(guò)洗脫后的噬菌體回收比從4.6×10逐漸上升到6.6×10。富集倍數(shù)也由1上升至1.43×10，說(shuō)明噬菌體抗體庫(kù)得到了特異性的富集。

2.4 間接ELISA篩選特異性噬菌體單克隆株

從培養(yǎng)板上隨機(jī)挑出24個(gè)單菌落進(jìn)行篩選，檢測(cè)并選取OD數(shù)值最高的用作ELISA方法建立的抗體。結(jié)果如圖3所示，8個(gè)樣品的ODnm>0.3，本研究選擇其中數(shù)值最高的21號(hào)克隆株作為后續(xù)間接ELISA方法優(yōu)化用的抗體。

表2 噬菌體抗體庫(kù)的選擇性富集
Table 2 Selective enrichment of ScFv from the libraries during panning

項(xiàng)目Item第一輪First round第二輪Second round第三輪Third round噬菌體輸入量2×10122×10122×1012噬菌體輸出量9.2×1032.84×1061.32×108回收比(輸出/輸入量)4.6×10-91.42×10-66.6×10-5富集倍數(shù)(本輪回收比/第一輪回收比)1.00308.071.43×104

圖3 24個(gè)單克隆株初篩結(jié)果Fig.3 Preliminary screening results of 24 strains

2.5 ELISA最佳條件的確定

將gP48蛋白包被酶標(biāo)板，對(duì)最佳包被濃度、最佳封閉液、最佳封閉時(shí)間、最佳二抗稀釋度、一抗孵育時(shí)間和最佳顯色時(shí)間進(jìn)行確定。讀取ODnm值，計(jì)算P/N比值，選取P/N值較大的孔所對(duì)應(yīng)的條件作為最佳反應(yīng)條件(表3)。

表3 ELISA的最佳反應(yīng)條件
Table 3 Optimum reaction conditions of ELISA

ELISA相關(guān)條件ELISA related condition最佳值Optimumvalue抗原包被濃度Antigen coating concentration800 ng/mL封閉液種類Type of sealing fluid1%明膠封閉時(shí)間Closing time37 ℃ 1 h一抗孵育時(shí)間Incubation time of primary antibody37 ℃ 2 h二抗稀釋度Secondary antibody dilution1∶15 000顯色時(shí)間Color development time20 min

2.6 陽(yáng)性克隆株序列分析

從第三輪淘選后的培養(yǎng)板上挑取單菌落進(jìn)行培養(yǎng)，ELISA篩選出陽(yáng)性噬菌體單鏈抗體克隆株。對(duì)36株結(jié)合活性比較高的陽(yáng)性單鏈抗體克隆株進(jìn)行PCR鑒定。結(jié)果如圖4所示，共計(jì)12個(gè)成功檢測(cè)到目的條帶(只展示了部分電泳結(jié)果)。將PCR陽(yáng)性的12個(gè)克隆進(jìn)行測(cè)序，最終9株克隆測(cè)序成功。利用DNA star的Clustal W對(duì)測(cè)序成功的9株陽(yáng)性克隆進(jìn)行序列分析，結(jié)果顯示，抗體基因的linker序列全部正確。同源性比對(duì)結(jié)果如圖5所示，ScFv-004和ScFv-116，ScFv-017和ScFv-032，ScFv-021和ScFv-030，ScFv-049、ScFv-056和ScFv-091序列相同。利用IgBLAST分析，結(jié)果顯示9株陽(yáng)性克隆抗體均為鼠源IgG。

M：marker;1～15:克隆株擴(kuò)增條帶。 M: marker; 1-15: Amplified bands.圖4 PCR鑒定陽(yáng)性單鏈抗體克隆株Fig.4 PCR identification of positive ScFv clones

2.7 ELISA檢測(cè)單鏈抗體的結(jié)合活性

選取序列不同的3株陽(yáng)性單鏈抗體，利用建立的ELISA方法檢測(cè)其與gP48蛋白的結(jié)合活性。酶標(biāo)儀讀取ODnm值并分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)。結(jié)果如圖6所示，ScFv-017、ScFv-030、ScFv-116均可以與gP48蛋白特異性結(jié)合；其中，陽(yáng)性單鏈抗體ScFv-116與gP48蛋白的結(jié)合活性最高。

1～9分別表示9株陽(yáng)性克隆，ScFv-004和ScFv-116，ScFv-017和ScFv-032，ScFv-021和ScFv-030，ScFv-049、ScFv-056和ScFv-091。 1-9 represent nine positive clones, respectively. ScFv-004 and ScFv-116, ScFv-017 and ScFv-032, ScFv-021 and ScFv-030, ScFv-049, ScFv-056 and ScFv-091.圖5 9株陽(yáng)性ScFv序列同源性分析Fig.5 Identity analysis of nine positive ScFv genes

圖6 3株ScFv結(jié)合活性的測(cè)定Fig.6 Determination of binding activity of three ScFv strains

3 討 論

隨著規(guī)模化養(yǎng)殖業(yè)的不斷發(fā)展，BVD的流行在我國(guó)牛群中呈上升趨勢(shì)，給養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。因此建立快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法對(duì)該病的防控尤為重要。目前研究、應(yīng)用較多的是ELISA方法。傳統(tǒng)的ELISA以單克隆抗體為核心材料，而單抗制備過(guò)程繁瑣，價(jià)格昂貴，不利于ELISA試劑盒的快速研發(fā)和推廣。單鏈抗體免疫原性低、組織穿透力強(qiáng)、特異性高且能夠進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)，使其在科研、診斷及治療方面應(yīng)用廣泛?，F(xiàn)在較常用的單鏈抗體篩選技術(shù)為抗體噬菌體展示技術(shù)，通過(guò)該技術(shù)篩選得到的抗體不僅可以在標(biāo)簽蛋白的輔助下進(jìn)行選擇和純化，還可通過(guò)基因測(cè)序的方法得到單鏈抗體的完整基因序列，再根據(jù)需要對(duì)單鏈抗體進(jìn)行修飾和改造。與傳統(tǒng)的雜交瘤制備單克隆抗體技術(shù)相比，制備單鏈抗體更加便捷和有效，為臨床疾病檢測(cè)方法的建立提供了新型原材料。本研究旨在篩選與gP48蛋白具有高結(jié)合活性的特異性單鏈抗體，為基于單鏈抗體的BVDV疾病ELISA檢測(cè)方法的研究奠定基礎(chǔ)，彌補(bǔ)國(guó)產(chǎn)基于單鏈抗體BVDV檢測(cè)試劑盒的空白，為牛群BVD疾病的防控提供技術(shù)產(chǎn)品。

由于抗原刺激后，脾淋巴細(xì)胞分泌特異性抗體水平明顯高于未受到抗原刺激下機(jī)體產(chǎn)生的抗體水平，因此利用免疫后的動(dòng)物制備的抗體庫(kù)的特異性、抗體陽(yáng)性率明顯高于天然抗體庫(kù)。另外，免疫程序?qū)α馨图?xì)胞的分化及抗體的產(chǎn)生也有重要的影響，通過(guò)多次免疫誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生具有保護(hù)力的抗體。因此，本研究將gP48蛋白采用3次重復(fù)方式免疫小鼠，使其產(chǎn)生主動(dòng)免疫，從而達(dá)到對(duì)淋巴細(xì)胞的有效刺激，用于構(gòu)建BVDV抗體陽(yáng)性率高的噬菌體抗體庫(kù)。對(duì)噬菌體抗體庫(kù)進(jìn)行篩選，是獲得高親和力特異性抗體分子的關(guān)鍵步驟。本研究利用gP48蛋白對(duì)構(gòu)建的噬菌體抗體克隆庫(kù)進(jìn)行特異性的富集淘選，經(jīng)過(guò)三輪的“孵育-洗脫-一擴(kuò)增”直接包被固相篩選，將噬菌體克隆文庫(kù)富集了1.43×10倍。一般情況下，富集倍數(shù)超過(guò)100倍即合格，目前已報(bào)道的研究其富集倍數(shù)范圍一般是從100多到2 000以內(nèi)。從富集結(jié)果來(lái)看，本研究獲得了比較穩(wěn)定的噬菌體抗體文庫(kù)。

為獲得高親和力的陽(yáng)性噬菌體單鏈抗體，本研究以gP48蛋白作為抗原，分別對(duì)間接ELISA各項(xiàng)反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，建立了針對(duì)gP48蛋白陽(yáng)性噬菌體單鏈抗體篩選的間接ELISA方法，利用建立的ELISA方法最終成功篩選到多株陽(yáng)性值較高的噬菌體單克隆株。對(duì)陽(yáng)性ScFv基因進(jìn)行同源性比對(duì)，結(jié)果顯示其linker序列全部正確。通過(guò)IgBLAST分析ScFv基因，結(jié)果顯示均為鼠源IgG。綜上所述，本研究構(gòu)建了BVDV gP48蛋白的鼠源噬菌體單鏈抗體克隆庫(kù)，獲得了與gP48蛋白具有較高結(jié)合活性的特異性單鏈抗體，有望用于BVDV診斷方法的研制，同時(shí)也將為開(kāi)發(fā)BVDV抗體藥物提供必要材料，為預(yù)防和治療BVDV感染提供新的方法。