馬守正 汪 亮 李忠秋 王文濤 劉 娣, 張冬杰*

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，哈爾濱 150038； 2.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧研究所，哈爾濱 150086)

豬是對環(huán)境溫度較為敏感的一種大型家養(yǎng)動物，尤其新生仔豬?，F(xiàn)代化集約飼養(yǎng)模式的興起，雖然提供了一個穩(wěn)定的環(huán)境，但也導(dǎo)致豬對溫度的敏感性提高。冷應(yīng)激會對機體的神經(jīng)、心血管和免疫系統(tǒng)造成損害，因此突降的災(zāi)害性天氣會導(dǎo)致巨大的經(jīng)濟損失。在人和小鼠上的研究顯示，骨骼肌和棕色脂肪組織是機體遭受冷應(yīng)激后的主要產(chǎn)熱部位。骨骼肌在室溫環(huán)境下，它的產(chǎn)熱占比在20%左右，但在寒冷環(huán)境下，它的產(chǎn)熱占比可升到40%。它同時以戰(zhàn)栗性產(chǎn)熱和非戰(zhàn)栗性產(chǎn)熱兩種方式為機體提供熱量，這對棕色脂肪較少的大型哺乳動物或沒有棕色脂肪的鳥類和家豬格外重要。骨骼肌的戰(zhàn)栗性產(chǎn)熱主要是通過骨骼肌不隨意的節(jié)律性收縮，增加代謝率和產(chǎn)熱量。骨骼肌的非戰(zhàn)栗性產(chǎn)熱獨立于戰(zhàn)栗性產(chǎn)熱，目前已知線粒體質(zhì)子泄漏和肌漿網(wǎng)鈣循環(huán)是其主要產(chǎn)熱機理。

1954年，Sellers等首次提出在寒冷環(huán)境下，小鼠的骨骼肌會通過電活動(Electrical acticity)產(chǎn)熱維持體溫。Davis在對狗的骨骼肌研究中發(fā)現(xiàn)，低溫環(huán)境會導(dǎo)致骨骼肌的耗氧量增加，切除肌肉內(nèi)的神經(jīng)不會影響肌肉產(chǎn)熱，提出肌肉的非戰(zhàn)栗性產(chǎn)熱可能是體液介導(dǎo)的。1997年，de Mei等研究發(fā)現(xiàn)，肌質(zhì)網(wǎng)膜上的Ca-ATP酶(Sarcoplasmic reticulum Ca-ATPase,

SERCA

)可介導(dǎo)Ca由細胞基質(zhì)中泵入肌質(zhì)網(wǎng)中儲存起來，使肌質(zhì)網(wǎng)內(nèi)Ca濃度比胞質(zhì)中高出許多。當(dāng)機體受到神經(jīng)沖動或環(huán)境變化刺激后，Ca由濃度高的肌質(zhì)網(wǎng)腔中釋放入胞質(zhì)中，在這一過程中，部分Ca與ATP的合成相耦合，還有一部分Ca泄露，偏離ATP合成，并導(dǎo)致熱量散失，被認(rèn)為是肌肉產(chǎn)熱的主要來源。其中起關(guān)鍵作用的SERCA酶受小分子蛋白受磷蛋白(Phospholamban，PLB)和肌質(zhì)蛋白(Sarcolipin，SLN)調(diào)控，尤其是

SLN

。2017年Bal等發(fā)現(xiàn)在輕度和重度冷適應(yīng)期間，肌肉的非戰(zhàn)栗性產(chǎn)熱與棕色脂肪的代謝產(chǎn)熱同時被啟動，如果一條途徑被阻斷，另一條途徑會增加產(chǎn)熱以維持核心溫度，2個途徑彼此間存在相互作用。此外，肌質(zhì)網(wǎng)上的線粒體串?dāng)_、線粒體生物合成的增加、解偶聯(lián)蛋白3(Uncoupling protein 3，UCP3)誘導(dǎo)產(chǎn)熱以及糖異生的關(guān)鍵酶-果糖-1,6-二磷酸酶(Fructose 1,6-bisphosphatase 2,FBP2)的變化等都會改變骨骼肌的非戰(zhàn)栗性產(chǎn)熱。由此可知，低溫誘導(dǎo)下的骨骼肌非戰(zhàn)栗性產(chǎn)熱機理非常復(fù)雜。但受實驗條件所限，目前對大型家養(yǎng)動物的相關(guān)研究報道很少。

豬既是一種大型的模式動物，同時也是一種重要的經(jīng)濟動物。研究低溫環(huán)境對豬骨骼肌產(chǎn)熱的影響，一方面可為人類的相關(guān)研究提供借鑒，另一方面也可為生豬健康養(yǎng)殖提供理論幫助。本研究所選擇的民豬是東北地區(qū)唯一一個受到國家級保護的地方豬種，因長期生活在較為寒冷的環(huán)境中，使其具有明顯的耐寒特性。在-30 ℃的低溫環(huán)境中，也不會出現(xiàn)任何凍傷。本研究通過對遭受重度冷應(yīng)激后民豬背最長肌進行轉(zhuǎn)錄組測序，從全基因組水平上篩選和分析了受低溫誘導(dǎo)的基因及l(fā)ncRNA的表達情況，旨在為豬的骨骼肌非戰(zhàn)栗性產(chǎn)熱研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

本研究在黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所民豬養(yǎng)殖場進行。2021年1月3日，將6頭6月齡體重相近的雌性民豬隨機分成2組，每組3頭豬。試驗開始前，6頭民豬全部在室內(nèi)有供暖的豬舍內(nèi)飼養(yǎng)，溫度控制在(18±2) ℃，試驗開始后，一組置于室外的半敞篷舍內(nèi)飼養(yǎng)，溫度隨外界環(huán)境溫度變化而變化，白天氣溫平均-17 ℃，夜間氣溫平均-26 ℃，一組仍留在溫暖的舍內(nèi)飼養(yǎng)，兩組均保證自由采食和飲水，共處理3 d。試驗結(jié)束后，屠宰6頭民豬，取100 mg背最長肌置于液氮中保存。

1.2 RNA的提取

采用酚/氯仿法提取RNA，使用NanoDrop 2000&8000微量分光光度計對所提取的RNA進行純度檢測，使用安捷倫2100 Bioanalyzer進行質(zhì)量濃度與完整性檢測。

1.3 文庫構(gòu)建和上機測序

每個樣品取1 μg總RNA作為起始量構(gòu)建lncRNA文庫。首先使用Ribo-off rRNA Depletion試劑盒去除rRNA，向反應(yīng)體系中加入 Fragmentation Buffer使RNA片段化成為短片段，再以片段后的RNA為模板，利用隨機引物進行逆轉(zhuǎn)錄，實現(xiàn)cDNA第一鏈合成，并加入2nd Strand Marking Buffer、2nd Strand/End Repair Enzyme Mix合成cDNA第二鏈，后經(jīng)末端修復(fù)、加堿基A，加測序接頭，通過磁珠篩選回收目的片段，加UNG酶消化cDNA二鏈，并進行PCR擴增，最后通過磁珠純化回收目的片段，從而完成整個文庫制備工作。使用NovaSeq 6000 S4對構(gòu)建好的文庫進行測序。

1.4 原始數(shù)據(jù)的處理

測序得到的原始下機序列，含有測序接頭序列以及低質(zhì)量序列，為了保證信息分析數(shù)據(jù)的質(zhì)量，需要對原始下機數(shù)據(jù)序列進行過濾，包括去除接頭污染的Reads，低質(zhì)量的Reads，含N比例大于5%的Reads，以及與核糖體RNA匹配的Reads，得到高質(zhì)量的Clean reads后再進行后續(xù)分析。

1.5 lncRNA的鑒定

lncRNA的篩選條件如下：轉(zhuǎn)錄本長度≥200 bp，外顯子個數(shù)≥2；計算每條轉(zhuǎn)錄本的reads覆蓋度，篩去所有樣本中均小于5的轉(zhuǎn)錄本；利用gffcompare(http:∥ccb.jhu.edu/software/stringtie/gff.shtml)同豬的注釋文件進行比較，篩除豬中已知的mRNA及其他非編碼RNA(rRNA，tRNA，snoRNA，snRNA等)；根據(jù)比較結(jié)果中的class_code信息(“u”,“i”,“x”)篩選潛在的lincRNA、intronic lncRNA和anti-sense lncRNA。將篩選所得的lncRNA作為最終的候選lncRNA進行后續(xù)分析。綜合4種分析軟件進行是否具有編碼潛能的篩選，主要有CNCI分析、CPC分析、PFAM蛋白結(jié)構(gòu)域分析和CPAT分析。這4種分析方法均判別為non-coding的轉(zhuǎn)錄本為最終的lncRNA數(shù)據(jù)集。

1.6 民豬背最長肌受冷應(yīng)激誘導(dǎo)的基因表達量分析

使用FPKM定量估計基因表達值，采用DEseq2進行試驗組和對照組間差異表達基因分析，滿足|logFC|≥1和

q

<0.05的差異基因被認(rèn)為達到顯著水平。根據(jù)兩組間上下調(diào)基因情況繪制差異表達基因的火山圖。

1.7 民豬背最長肌受冷應(yīng)激誘導(dǎo)的基因功能分析

GO富集分析。針對GO數(shù)據(jù)庫中的二級條目，計算每個條目的基因數(shù)目，應(yīng)用超幾何檢驗，找出與整個基因組背景相比，差異表達基因顯著富集的GO條目。對KEGG中每個Pathway應(yīng)用超幾何檢驗進行富集分析，找出差異表達基因顯著性富集的Pathway。

1.8 民豬背最長肌受冷應(yīng)激誘導(dǎo)的lncRNA與mRNA的聯(lián)合分析

對于差異表達的lncRNA的靶基因，分別進行Cis和Trans靶標(biāo)分析，通過靶基因間接預(yù)測其功能。Cis作用靶基因預(yù)測主要是通過lncRNA的功能與其在基因組座位上臨近的蛋白編碼基因的相關(guān)性進行的。將lncRNA相鄰位置(上下游50 kb)的蛋白編碼基因篩選出來作為靶基因。Trans靶基因預(yù)測主要是通過lncRNA的功能不依賴于和編碼基因的位置關(guān)系，而是與共表達的基因相關(guān)性進行的。根據(jù)lncRNA同mRNA的表達量相關(guān)性系數(shù)(斯皮爾曼相關(guān)系數(shù)，corr≥0.9)進行篩選。篩選后獲得的靶基因開展同mRNA相似的功能分析。根據(jù)識別出的差異表達lncRNA基因與mRNA基因及l(fā)ncRNA的順式、反式靶標(biāo)預(yù)測的基因的關(guān)系，繪制差異lncRNA與靶基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析。

1.9 民豬背最長肌差異表達基因的Real-time PCR驗證

利用Roche實時熒光定量PCR儀LightCycler480Ⅱ?qū)μ幚斫M存在顯著差異的高表達8個基因和2個lncRNA進行SYBR Green實時定量檢測，引物信息見表1。反應(yīng)體系為：cDNA樣品0.5 μL，2×SYBR Green PCR Mixture 10 μL，特異性引物上下游各0.5 μL，滅菌水補充至20 μL。反應(yīng)程序為：95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40個循環(huán)。檢測結(jié)果根據(jù)2法計算各模板中目的基因相對于內(nèi)參基因

β

-

actin

的表達量。

2 結(jié)果與分析

2.1 民豬遭受冷應(yīng)激后背最長肌轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果

原始下機數(shù)據(jù)經(jīng)過濾處理后，每個樣品平均獲得98 M的Clean reads，與基因組的比對效率為96.12%，其中，38.94%的序列比對到外顯子區(qū)域，30.50%的序列比對到內(nèi)含子區(qū)域，30.56%的序列比對到基因間區(qū), 篩選出的lncRNA經(jīng)CNCI分析、CPC分析、PFAM蛋白結(jié)構(gòu)域分析和CPAT分析后，取四者間的交集，共獲得10 220個lncRNA。

表1 qRT-PCR檢測用引物信息
Table 1 Primer information for qRT-PCR

基因或長鏈非編碼RNAGene or lncRNA引物序列(5'-3')Primer sequence (5'-3')SRXN11F: TCCACTCGGGTTGTATCGC1R: TGTCCACGAGGCTCTGCACSF12F: TTGCCTTTGAGTTTGTAGACC2R: TTGGCATTGGGAGTGTTGGPRC5A3F: GTGGATTGCCCTGCTCTT3R: ATGGTGTTCCGTTGCTTGIL1R14F: CGGGTCCACCTCTAACTC4R: GTAGTCGTCCCTGCCACACD2095F: TCTTCGTCTCATTGGGTTTC5R: TGGGTCTCCTGCTGGTCTARID5B7F: GGGCAACCCAGGTATCAT7R: TCATCCCTCGCAATCAGTMMP198F: CCCCAAGAGGCTGAATAG8R: GGTAGCTGCTGAAGTCCATITGA59F: CTCGCCAGGCTAGTTCCA9R: AAGGATGGTGACATAACCGTAGlncRNA13646010F: AGGAGGGAACAGATGGATTG10R: GTGAGGGCTGGCTTGTATTTlncRNA7596311F: TAGACAGAGGCTCCCTTCAT11R: CTGGGTTGCACAACTTCCβ-actin12F: CGGGACCTGACCGACTACCT12R: GGGCCGTGA TCTCCTTCTG

2.2 民豬遭受冷應(yīng)激后背最長肌差異表達基因的篩選與分析

按照|logFC|≥1和

q

<0.05的條件篩選后，民豬在遭受急性重度冷應(yīng)激后，背最長肌共有88個基因表達發(fā)生了顯著變化，其中53個基因表達發(fā)生了顯著上調(diào)，35個基因表達發(fā)生了顯著下調(diào)。91個lncRNA表達發(fā)生了顯著變化，其中53個lncRNA表達發(fā)生了顯著上調(diào)，38個lncRNA表達發(fā)生了顯著下調(diào)。由于豬的lncRNA數(shù)據(jù)庫還不完善，因此這91個lncRNA均顯示為novel lncRNA。表達發(fā)生顯著變化的前10個基因列表見表2。上調(diào)變化倍數(shù)最大的基因是肝細胞生長因子激活因子(Hepatocyte growth factor activator,

HGFAC

)，上調(diào)了9.55倍；下調(diào)變化倍數(shù)最大的基因是多亮氨酸重復(fù)區(qū)和跨膜域1(Leucine rich rRepeats and transmembrane domains 1，

LRTM1

)，下調(diào)了7.04倍。

2.3 民豬遭受冷應(yīng)激后背最長肌差異表達基因的功能分析

對差異表達的基因進行GO功能注釋，發(fā)現(xiàn)在分子功能(Molecular function)中不存在顯著富集的條目，在生物過程(Biological process)中，有21個條目存在顯著富集，其中富集程度最高的是膠原分解代謝過程(Collagen catabolic process)，在細胞組分(Cellular component)中，有5個條目存在顯著富集，其中4個是位于細胞外區(qū)間(圖1)。

表2 重度冷應(yīng)激后民豬背最長肌表達發(fā)生顯著變化的前10個基因
Table 2 The top 10 genes with significant changes in the longissimus dorsi muscle of Min pigs after acute cold stress

基因Genelog2差異倍數(shù)log2 Fold change變化Change基因Genelog2差異倍數(shù)log2 Fold change變化ChangeHGFAC9.55UpLRTM1-7.04DownTREH5.59UpKCTD4-3.06DownFOSL14.87UpPCSK1N-2.82DownAREG4.53UpTMEM139-2.80DownMMP254.52UpCSRNP3-2.71DownHAS14.26UpLRRN3-2.63DownSLC11A13.72UpNCBP2-AS2-2.49DownTRIB33.67UpCOL8A2-2.41DownSLCO4A13.47UpENHO-2.25DownPRSS363.44UpNPPC-1.91Down

每個點的顏色表示該GO條目的富集程度。每個點的大小表示富集到該GO條目的基因的個數(shù)。用于表示富集程度的rich ratio，其計算公式為：(該通路的差異基因/所有的差異基因)/(注釋到該通路的基因/所有能被注釋到的基因)。 The abscissa represents the degree of enrichment, and the ordinate represents the GO term. The color of each dot indicates the degree of enrichment of that GO term. The size of each point represents the number of genes enriched for that GO term. The rich ratio used to express the degree of enrichment is calculated as (differential genes of this pathway/all differential genes)/(genes annotated to this pathway/all genes that can be annotated).圖1 重度冷應(yīng)激下民豬背最長肌差異表達基因GO條目FDR值富集圖Fig.1 Enrichment map of Go terms FDR value of differentially expressed genes in longissimus dorsi of Min pig under acute cold stress

對差異表達的基因進行pathway富集分析，發(fā)現(xiàn)僅絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路存在顯著富集，該通路中7個基因白細胞介素1受體1型(Interleukin 1 receptor type 1，

IL1R1

)、雙調(diào)蛋白(Amphiregulin，

AREG

)、絲裂原活化蛋白激酶8(Mitogen-activated protein Kinase 8，

MAP3K8

)、70 ku熱休克蛋白1L(Heat Shock Protein Family A (Hsp70) Member 1 like，

HSPA1L

)、集落刺激因子1(Colony stimulating factor 1，

CSF1

)、RELB原癌基因NF-κβ亞基(RELB proto-oncogene, NF-kB subunit，

RELB

)的表達發(fā)生了顯著上調(diào)，2個基因成纖維細胞生長因子受體4(Fibroblast growth factor receptor 4，

FGFR4

)和p21活化激酶1(p21- activated Kinase 1，

PAK1

)的表達發(fā)生了顯著下調(diào)。

2.4 民豬遭受冷應(yīng)激后背最長肌差異表達lncRNA的靶基因預(yù)測

lncRNA不編碼蛋白，主要通過順式(Cis)或反式(Trans)方式作用于蛋白編碼基因來實現(xiàn)。本研究中表達發(fā)生顯著變化的91個lncRNA順式調(diào)控129個靶基因，反式調(diào)控750個靶基因。通過構(gòu)建lncRNA與mRNA之間的相互作用網(wǎng)絡(luò)(僅列出了發(fā)生顯著變化的前10個)，發(fā)現(xiàn)兩者間的調(diào)控關(guān)系錯綜復(fù)雜(圖2)。比如lncRNA122198同時調(diào)控39個基因，使它們的轉(zhuǎn)錄發(fā)生了向上或向下的變化，而基因

C11orf52

則同時受到9個lncRNA的調(diào)控。表3列出了表達發(fā)生顯著變化的前10個lncRNA及其靶基因表達變化和調(diào)控模式。

藍色代表lncRNA，紅色代表上調(diào)表達的基因，綠色代表下調(diào)表達的基因。 Blue represents lncRNA, red represents up-regulated genes, and green represents down-regulated genes.圖2 重度冷應(yīng)激下民豬背最長肌差異表達lncRNAs和mRNAs之間的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖Fig.2 Regulatory network between differentially expressed lncRNAs and mRNAs in the longissimus dorsi of Min pigs under acute cold stress

2.5 民豬遭受冷應(yīng)激后背最長肌差異表達lncRNA的靶基因功能分析

對差異表達的lncRNA靶基因進行GO功能注釋，發(fā)現(xiàn)在分子功能中有19個條目存在顯著富集，其中磷酸轉(zhuǎn)移酶活性(Phosphotransferase activity)富集程度最高；在生物過程中，有232個條目存在顯著富集，其中富集程度最高的是單核細胞活化(Monocyte activation),在細胞組分中，有20個條目存在顯著富集，其中富集程度最高的在核質(zhì)(Nucleoplasm)和核部分(Nuclear part)，每個本體中富集程度前10的條目情況見圖3。

對差異表達的lncRNA靶基因進行pathway富集分析，發(fā)現(xiàn)MAPK信號通路(MAPK signaling pathway)和TNF信號通路(TNF signaling pathway)存在顯著富集，MAPK通路中有21個基因的表達發(fā)生了顯著上調(diào)，6個基因的表達發(fā)生了顯著下調(diào)。TNF通路中，有11個基因的表達發(fā)生了顯著上調(diào)，3個基因的表達發(fā)生了顯著下調(diào)。

每個點的顏色表示該GO條目的富集程度。每個點的大小表示富集到該GO條目的基因的個數(shù)。用于表示富集程度的rich ratio，其計算公式為：(該通路的差異基因/所有的差異基因)/(注釋到該通路的基因/所有能被注釋到的基因)。 The abscissa represents the degree of enrichment, and the ordinate represents the GO term. The color of each dot indicates the degree of enrichment of that GO term. The size of each point represents the number of genes enriched for that GO term. The rich ratio used to express the degree of enrichment is calculated as (differential genes of this pathway/all differential genes)/(genes annotated to this pathway/all genes that can be annotated).圖3 重度冷應(yīng)激下民豬背最長肌差異表達lncRNA的靶基因GO條目FDR值富集圖Fig.3 Enrichment map of GO terms FDR value of target genes of differentially expressed lncRNAs in the longissimus dorsi of Min pig under acute cold stress

2.6 測序結(jié)果的實時定量PCR驗證

為了驗證RNA測序結(jié)果的準(zhǔn)確性，選擇了8個顯著上調(diào)表達的mRNA和2個顯著上調(diào)表達的lncRNA進行了 qRT-PCR驗證。結(jié)果顯示，qRT-PCR定量檢測值與測序值相比，變化趨勢基本一致(圖4)，表明測序結(jié)果可信。

圖4 測序結(jié)果的qRT-PCR驗證Fig.4 qRT-PCR validation of sequencing results

3 討 論

戰(zhàn)栗是肌肉收縮的一個重復(fù)過程，是產(chǎn)生熱量的一個重要機制，是急性寒冷暴露的第一道防線。各種轉(zhuǎn)基因小鼠模型的研究表明，單靠戰(zhàn)栗不足以維持機體核心溫度(Core body temperature，Tc)，必須激活非戰(zhàn)栗機制來維持熱量生產(chǎn)。對新生哺乳動物和成年嚙齒動物的研究表明，棕色脂肪組織(Brown adipose tissue，BAT)是非戰(zhàn)栗性產(chǎn)熱(Nonshivering thermogenesis，NST)的重要部位。因此，近二十年來對非戰(zhàn)栗性產(chǎn)熱的研究大多集中在棕色脂肪上。雖然BAT在許多哺乳動物中發(fā)揮重要作用，但它通常僅限于新生兒階段，在成年大型非冬眠哺乳動物(包括人類)中作用減弱。此外，還有一些恒溫動物，如鳥類、有袋類動物和豬，它們可以在沒有BAT的情況下依舊保持恒定的Tc，并在寒冷的氣候中正常生長。因此，有人提出骨骼肌是非戰(zhàn)栗性產(chǎn)熱的另一個重要部位。

二代測序技術(shù)的出現(xiàn)，使得研究人員可以在全轉(zhuǎn)錄組水平利用測序技術(shù)同時進行定量與定性分析，提高了分析的效率和準(zhǔn)確性。本研究采用該技術(shù)對遭受重度冷應(yīng)激后的民豬背最長肌進行分析，發(fā)現(xiàn)88個基因受到顯著影響(

P

<0.05)，其中

HGFAC

上調(diào)倍數(shù)最大，HGFAC是活化單鏈前體肝細胞生長因子(HGF)成為有生物學(xué)功能的HGF的關(guān)鍵酶，在受損組織器官的修復(fù)和再生中發(fā)揮重要作用，HGFAC-HGF-PPARγ信號通路可參與調(diào)控全身的碳水化合物、葡萄糖和脂質(zhì)代謝。它的上調(diào)表達，推測是由于肌肉組織受低溫影響發(fā)生了損傷。海藻糖酶基因(Trehalase，

TREH

)在低溫刺激下也發(fā)生了5.59倍的上調(diào)表達。海藻糖酶是一種催化海藻糖水解的酶，在哺乳動物中鮮有報道，但在昆蟲和植物中已經(jīng)明確其可受低溫脅迫影響，該酶在能量代謝、生長和逆境恢復(fù)中起著重要作用。其他的，如雙調(diào)蛋白基因(Amphiregulin，

AREG

)、透明質(zhì)酸合成酶1基因(Hyaluronan synthase 1，

HAS1

)、Tribbles同源蛋白3基因(Tribbles pseudokinase 3，

TRIB3

)等都發(fā)生了顯著的上調(diào)。AREG是一種細胞因子，參與抵抗由蠕蟲引起的感染免疫、免疫調(diào)節(jié)和傷口修復(fù)，是炎癥環(huán)境下肌成纖維細胞分化的重要驅(qū)動因素。HAS1是負(fù)責(zé)透明質(zhì)酸合成的三種同工酶之一， 它的表達和活性由白細胞介素和細胞因子等促炎因子誘導(dǎo)，在許多炎癥反應(yīng)中如骨關(guān)節(jié)炎、感染性肺病中，HAS1的表達都增高，表明它參與了炎癥反應(yīng)。TRIB3屬于Tribbles信號調(diào)節(jié)蛋白家族，是關(guān)鍵的“壓力調(diào)節(jié)開關(guān)”，參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)、細胞生長分化等生物過程。此外，與先天性免疫相關(guān)的

MMP25

和天然抗性相關(guān)的

SLC11A1

也發(fā)生了顯著上調(diào)。被認(rèn)為在非戰(zhàn)栗性產(chǎn)熱中起重要作用的

SERCA1a

并未發(fā)生顯著變化，但其調(diào)節(jié)因子

SLN

的表達水平下降了一半。通過對發(fā)生顯著上調(diào)的基因分析發(fā)現(xiàn)，急性重度冷應(yīng)激下民豬的背最長肌發(fā)生了應(yīng)激和炎癥反應(yīng)。本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)急性重度冷應(yīng)激會造成民豬皮下脂肪與免疫、呼吸、氧化應(yīng)激、血液循環(huán)和脂類代謝等相關(guān)基因的表達水平顯著上調(diào)，而與神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)基因的表達水平發(fā)生顯著下調(diào)。小鼠骨骼肌中的催產(chǎn)素受體(Oxytocin receptor，

Oxtr

)、瞬時感受器電位香草酸受體1 (Transient receptor potential vanilloid 1，

TRPV1

)、冷誘導(dǎo)RNA結(jié)合蛋白(Cold-induced RNA-binding protein，

CIRP

)、鋅α2糖蛋白(Zinc-α2-glycoprotein，

ZAG

)等基因也會受到冷誘導(dǎo)而上調(diào)表達。本研究中篩選出的差異表達基因與前人的研究結(jié)果存在較大差異，推測這是由基因表達特性導(dǎo)致的?；虻谋磉_具有顯著的時間特異性和空間特異性，受外界環(huán)境因素影響。因此種屬、日齡、組織、環(huán)境溫度以及作用時間等因素都會導(dǎo)致篩選出的基因存在差異。

通過對差異表達基因的GO功能注釋分析和pathway富集分析后發(fā)現(xiàn)，這些差異表達基因所涉及的生物過程主要集中在膠原代謝、傷口愈合表皮細胞擴散和肌肉肥大調(diào)節(jié)過程等。這與人們在大鼠比目魚肌上發(fā)現(xiàn)的冰敷可促進膠原沉積增加、新生雛雞的急性冷暴露會導(dǎo)致心肌肥大等現(xiàn)象是一致的。差異表達基因在細胞組分(CC)的分析中發(fā)現(xiàn)，它們多位于細胞外區(qū)間，推測這可能與急性冷暴露下Ca、K等離子的轉(zhuǎn)運變化相關(guān)。重度冷刺激下，民豬肌肉組織中僅有1條生物學(xué)通路(MAPK信號通路)受到影響，說明低溫對民豬肌肉組織的正常生理功能影響較小。MAPK信號通路有三級的信號傳遞過程，可調(diào)節(jié)細胞的生長、分化、應(yīng)激、炎癥反應(yīng)等多種重要的生理/病理效應(yīng)，是將環(huán)境刺激轉(zhuǎn)化為細胞反應(yīng)的重要信號模塊。目前，在植物中已明確其對冷應(yīng)激的應(yīng)答反應(yīng)機制，但在哺乳動物中還未見其對冷應(yīng)激應(yīng)答的報道。

lncRNA是長度大于 200 個核苷酸的非編碼 RNA，在劑量補償效應(yīng)、表觀遺傳調(diào)控、細胞周期調(diào)控和細胞分化調(diào)控等眾多生命活動中發(fā)揮重要作用。民豬背最長肌遭受重度冷應(yīng)激后，91個lncRNA發(fā)生了顯著變化，因豬的lncRNA數(shù)據(jù)注釋有限，所以這些lncRNA均顯示為novel lncRNA，它們主要以反式調(diào)控的方式作用于靶基因。在對靶基因的功能注釋中發(fā)現(xiàn)，許多基因與單核細胞激活作用、鈣非依賴性細胞間粘附的調(diào)節(jié)、蛋白質(zhì)去甲基化、嘧啶脫氧核糖核苷代謝等生物過程相關(guān)。分子功能主要集中在醇基作為受體的磷酸轉(zhuǎn)移酶活性和RNA聚合酶Ⅱ調(diào)節(jié)區(qū)特異性 DNA 結(jié)合序列等。靶基因所富集的生物學(xué)通路，除了差異表達基因所富集的MAPK通路外，還有腫瘤壞死因子(TNF)信號通路。TNF是哺乳動物免疫反應(yīng)中的一個關(guān)鍵傳遞者和調(diào)節(jié)者，它的主要生化反應(yīng)是激活并調(diào)控NF-KB和AMPK途徑，在某些病理狀態(tài)下， 也能誘發(fā)細胞死亡。該通路的激活，也再次證明了冷應(yīng)激下，骨骼肌內(nèi)發(fā)生了炎癥反應(yīng)。通過以上分析可知，冷應(yīng)激影響了民豬背最長肌部分基因的表達，同時也影響了調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的部分lncRNA的表達。

本研究僅從全基因組水平探討了重度冷應(yīng)激對民豬骨骼肌基因和lncRNA表達模式的影響，未來應(yīng)從分子、細胞和個體水平深入研究冷應(yīng)激對家豬能量代謝及其他方面的影響，通過培育耐寒品種、改善飼料營養(yǎng)等多種方式提高家豬抗寒性。

4 結(jié) 論

民豬在遭受3 d的重度冷應(yīng)激后，背最長肌的88個基因受到顯著影響。與炎癥反應(yīng)、低溫脅迫、應(yīng)激反應(yīng)和營養(yǎng)物質(zhì)代謝相關(guān)的基因發(fā)生了顯著上調(diào)。差異表達基因所涉及的生物過程主要集中在膠原代謝、傷口愈合表皮細胞擴散和肌肉肥大調(diào)節(jié)過程等，且多位于細胞外區(qū)間。顯著富集的生物學(xué)通路僅MAPK通路1個。91個lncRNA的表達發(fā)生了顯著變化，這些lncRNA調(diào)控879個基因，且以反式調(diào)控為主。lncRNA調(diào)控的靶基因顯著富集到MAPK和TNF通路。