曹曉萌 王怡心 李子雄 沈火林 孫 亮

(中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院/設(shè)施蔬菜生長發(fā)育調(diào)控北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193)

辣椒(

Capsicum

annuum

L.)原產(chǎn)于南美洲，是一種重要的世界性蔬菜。我國是辣椒生產(chǎn)與消費(fèi)大國，2019年辣椒播種面積達(dá)226萬hm，占全國蔬菜總播種面積的8%～10%，年產(chǎn)值約2 500億元。與許多園藝作物類似，辣椒果實(shí)的相關(guān)性狀，尤其是果形的變異十分豐富。不同地區(qū)消費(fèi)者對不同果形的辣椒喜愛程度不同，例如，東北與華北地區(qū)消費(fèi)者偏愛果形順直的牛角與羊角椒，華中、云、貴和川等地區(qū)的消費(fèi)者更喜愛指形的朝天椒與細(xì)長形的線椒，而西北地區(qū)及越來越多的東部地區(qū)消費(fèi)者則對螺絲椒青睞有加。螺絲椒因形似“螺絲”而得名，其果實(shí)呈長羊角形，基部有褶皺，整體呈右螺旋生長。與一般長羊角椒相比，螺絲椒的辣味更濃，皮更薄且肉更脆，因此深受消費(fèi)者喜愛。螺絲椒起初在甘肅、青海、新疆和陜西等西北地區(qū)大規(guī)模種植，其在新疆鮮食辣椒種植面積中占比超85%；而后螺絲椒在我國東南部地區(qū)也逐漸發(fā)展起來，近年來在全國各地內(nèi)均有大面積種植。雖然螺絲椒在辣椒產(chǎn)業(yè)中的地位逐年提高，然而有關(guān)其形成機(jī)理的研究卻相對較少。

在自然界中，螺旋狀生長是一種常見發(fā)育模式，多見于植物的根、莖、纏繞的卷須、葉片以及呈螺旋狀排列的花瓣中。植物器官的螺旋生長對增強(qiáng)植物卷須的攀援能力、根系的侵徹力、種子的散播能力以及植物器官的機(jī)械強(qiáng)度等均有重要作用。在機(jī)理方面，有學(xué)者用植物力學(xué)模型與線性彈性理論來解釋多細(xì)胞器官徑向的扭曲，并認(rèn)為這種螺旋生長主要源于幾何學(xué)與力學(xué)的約束。然而更多的研究發(fā)現(xiàn)，植物的螺旋生長與生理、亞細(xì)胞、細(xì)胞和分子層面的改變有關(guān)。在生理學(xué)方面，有研究發(fā)現(xiàn)植物器官不同的旋轉(zhuǎn)方向(左旋或右旋)是由南北半球的引力、磁場與植物激素共同作用的結(jié)果，北半球的植物左側(cè)生長素分布較多，生長較快，右側(cè)生長素分布較少，生長較慢，使植物向左彎曲；而南半球的情況恰好相反。在亞細(xì)胞與細(xì)胞層面，植物器官的螺旋生長被認(rèn)為與細(xì)胞壁中的纖維素微纖絲以及細(xì)胞骨架的排布有直接關(guān)系，細(xì)胞的伸長和擴(kuò)張受到細(xì)胞壁中纖維素微纖絲沉積方向的調(diào)控，通常來說纖維素微纖絲的排列方向與細(xì)胞伸長的方向垂直。然而，在螺旋生長的植物中，微纖絲往往呈斜螺旋狀排列，并且有研究表明細(xì)胞的縱向擴(kuò)張與螺旋節(jié)距的增加有關(guān)。因此，在不增加纖維素微纖絲長度或減少細(xì)胞直徑的情況下，為了適應(yīng)細(xì)胞長度的增加，細(xì)胞必然會扭曲。在植物細(xì)胞中，纖維素微纖絲的排列受細(xì)胞骨架尤其是微管排布的調(diào)控。纖維素微纖絲由纖維素合成酶A六聚體復(fù)合物(Hexameric CesA rosette)合成，而這一結(jié)構(gòu)在纖維素合成互作蛋白(CELLULOSE SYNTHASE INTERACTING，CSI)與纖維素合成伴侶蛋白(COMPANION OF CELLULOSE SYNTHASE，CC)的輔助下沿微管移動。很多研究表明，微管排列方向的改變會直接影響纖維素微纖絲的排布方向。

很多植物的螺旋生長突變體也都與細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白的突變有關(guān)。水稻中

tid

1-1突變體的葉片和莖呈現(xiàn)右螺旋生長，

TID

基因編碼

α

-微管蛋白，

tid1-1

突變是

α

-微管蛋白第56個(gè)氨基酸由蘇氨酸突變?yōu)楫惲涟彼崴鶎?dǎo)致。擬南芥中與

TID

高度同源的

LEFTY

基因突變也會導(dǎo)致根系的螺旋生長，但其旋轉(zhuǎn)方向與水稻

tid1-1

突變體相反，為左旋生長。

lefty1

和

lefty2

突變分別由微管蛋白α-tubulin 6和α-tubulin 4顯性突變所導(dǎo)致。同時(shí)，擬南芥右螺旋生長突變體

tortifolia2

也是由

α

-微管蛋白突變所導(dǎo)致的。除微管結(jié)構(gòu)蛋白的突變外，一些微管相關(guān)蛋白(MAP)的突變也會導(dǎo)致植物的螺旋生長，例如擬南芥中CSI1、SPIRAL1、SPIRAL2和WAVE-DAMPENED蛋白的突變均會導(dǎo)致器官的右旋生長。其中，SPIRAL1是定位于微管的蛋白，過表達(dá)其編碼基因會增強(qiáng)微管對微管解聚藥物的抗性并促進(jìn)下胚軸的伸長；SPIRAL2主要參與微管負(fù)端的穩(wěn)定；WAVE-DAMPENED屬于TPX2-like家族，該家族成員均可與微管結(jié)合并參與細(xì)胞分裂、下胚軸伸長和維管束發(fā)育等過程。此外，番茄果形位點(diǎn)

sun

也會導(dǎo)致器官的旋轉(zhuǎn)。

sun

基因編碼IQ67家族蛋白-IQD12，在番茄中的過表達(dá)不但會引起果實(shí)的過度伸長，而且還會導(dǎo)致子葉與莖等器官的旋轉(zhuǎn)。擬南芥中研究發(fā)現(xiàn)很多IQ67家族成員均定位于微管并且與微管相關(guān)蛋白ROP以及KINESIN LIGHT CHAIN-RELATED互作。除上述MAP外，植物激素與重力等因素也會影響植物的螺旋生長。有研究表明激素可以通過改變周質(zhì)微管的排列，促進(jìn)或抑制微管的解聚，控制纖維素微纖絲在細(xì)胞壁上的排列方向和調(diào)控細(xì)胞的生長方式，引起植物的螺旋生長。在一些生長素相關(guān)基因的突變體中也發(fā)現(xiàn)了螺旋生長現(xiàn)象，例如

aux1

突變體的根呈左螺旋生長，而

rcn1

突變體的根則呈右螺旋卷曲。乙烯也被發(fā)現(xiàn)可以通過影響纖維素的定向沉積來改變微管的排列，并引起植物器官的螺旋生長。超重力也會造成植物的周質(zhì)微管從橫向排列轉(zhuǎn)變?yōu)榭v向排列并最終導(dǎo)致器官的旋轉(zhuǎn)生長。

辣椒是為數(shù)不多的能在果實(shí)上觀察到螺旋生長的園藝作物，這種性狀與辣椒的經(jīng)濟(jì)價(jià)值相關(guān)，然而目前人們對辣椒這一性狀形成機(jī)理的了解卻不夠深入。本研究以螺絲椒與牛角椒自交系為試材，利用徒手切片、石蠟切片和轉(zhuǎn)錄組測序等技術(shù)，旨在初步揭示辣椒螺旋果形的形成機(jī)理，為全面揭示植物器官形態(tài)建成理論奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)以本課題組選育的螺絲椒自交系19C705與牛角椒自交系19C961為試材。所有試材均于2021年春茬種植在中國農(nóng)業(yè)大學(xué)上莊試驗(yàn)站塑料大棚。

1.2 果實(shí)發(fā)育調(diào)查

于花后0、3、5、8和12 d觀察果實(shí)的旋轉(zhuǎn)情況，于破色期(花后38 d)用直尺測量果實(shí)的最大縱橫徑。以果實(shí)果肩至遠(yuǎn)軸端最大垂直距離作為果實(shí)縱徑，以平行于果肩的果實(shí)最寬處作為果實(shí)橫徑。果形指數(shù)為果實(shí)縱徑除以橫徑所得值。每個(gè)試材選取至少5個(gè)植株，每個(gè)植株至少調(diào)查3個(gè)果實(shí)。

1.3 花期子房和破色期果實(shí)徒手切片制作與組織學(xué)調(diào)查

分別從19C705和19C961植株上選擇發(fā)育良好的破色期果實(shí)，切取果實(shí)中段1/3部分，分別做橫切、縱切與剖切，每個(gè)試驗(yàn)材料至少調(diào)查5個(gè)果實(shí)，每個(gè)果實(shí)每個(gè)方向至少制作3個(gè)切片。取19C705和19C961的花期子房，去除萼片后分別制作橫切和縱切石蠟切片，每個(gè)試驗(yàn)材料至少取8個(gè)子房，每個(gè)方向至少制作4張石蠟切片；組織薄片用甲苯胺藍(lán)染色后置于OLYMPUS DP72體式顯微鏡下觀察并拍照。使用Image J軟件測量橫向、縱向細(xì)胞的平均大小、細(xì)胞數(shù)目以及縱剖面細(xì)胞排列方向上的細(xì)胞形狀指數(shù)、細(xì)胞排列方向與果實(shí)縱軸的夾角。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

上述試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用Microsoft Excel 2019與R軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.5 轉(zhuǎn)錄組測序與分析

在19C705和19C961開花當(dāng)天剝?nèi)∽臃坎⒂靡旱賰?，而后利用Invitrogen TRIzol試劑盒(Invitrogen，美國)提取子房RNA。轉(zhuǎn)錄組測序文庫構(gòu)建與測序均在百邁客公司(青島)完成。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析由百邁客云平臺(www.biocloud.net)完成，其中差異顯著基因利用DEseq2軟件包分析，錯(cuò)誤率設(shè)置為FDR=0.05，差異倍數(shù)閾值設(shè)定為FC=2，平均表達(dá)量≥2 FPKM。差異基因富集分析(包括GO、COG、KEGG和KOG富集)和注釋分析(包括Pfam、Swiss prot、NR與eggNOG注釋)均在百邁客云平臺完成。篩選出重點(diǎn)基因的表達(dá)量使用R語言中

Z

-score方法進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，熱圖使用MeV4.9.0軟件進(jìn)行繪制。

1.6 實(shí)時(shí)定量熒光PCR

使用Prime Script RT Reagent Kit(寶生物工程(大連)有限公司)進(jìn)行mRNA反轉(zhuǎn)錄，而后利用TB GreenPremix Ex

Taq

II(寶生物工程(大連)有限公司)試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)，PCR儀為ABI PRISM 7500 Real-Time PCR System(Applied Biosystems，美國)。使用Primer 5軟件設(shè)計(jì)引物，詳細(xì)信息參見表1。選擇

UBI-3

(

Capana06

g002873

)基因作為內(nèi)參基因，使用2計(jì)算相對表達(dá)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 破色期果實(shí)表型及組織學(xué)調(diào)查

19C705與19C961 2種試材果實(shí)大小與形狀差異見圖1(a)。19C705為典型的螺絲椒類型，果實(shí)較長、表面褶皺且整體呈右手螺旋；19C961為長牛角形，果面光滑。通過破色期果實(shí)徒手切片發(fā)現(xiàn)，在縱剖面方向上19C705的細(xì)胞呈傾斜排列且細(xì)胞形狀細(xì)長，而19C961的細(xì)胞整體呈垂直排列且細(xì)胞形狀較圓(圖1(c)和(d))。在橫切面方向上，2種材料的細(xì)胞均呈圓形且排列均垂直于表皮方向(圖1(e)和(f))。在縱切面方向上，19C705的細(xì)胞呈波浪狀排列，細(xì)胞大且細(xì)胞較多；而19C961細(xì)胞整體上呈縱向排列(圖1(g)和(h))。

2種試材花期子房的橫切與縱切切片見圖2。對2種材料花期子房進(jìn)行測量與組織學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，19C705的花期子房長度和寬度均顯著大于19C961，但二者子房的形狀指數(shù)差異不顯著(圖2和圖3(a))；2種材料果肉縱、橫向細(xì)胞數(shù)目差異不顯著(圖3(b))，但19C705縱向細(xì)胞面積顯著大于19C961(圖3(c))。對2種材料破色期果實(shí)而言，19C705的果實(shí)長度顯著大于19C961，但果實(shí)寬度卻顯著小于后者，這也最終導(dǎo)致了19C705的果形指數(shù)顯著大于19C961(圖4(a))；在細(xì)胞數(shù)目方面，19C705的縱向與橫向細(xì)胞數(shù)目均顯著多于19C961(圖4(b))；在細(xì)胞大小方面，19C705的縱向與橫向切面細(xì)胞面積均顯著小于19C961，但是前者的縱剖面細(xì)胞面積卻顯著大于后者(圖4(c))。為更加準(zhǔn)確地衡量果實(shí)縱剖面細(xì)胞的排列方式，本研究測量了縱剖面細(xì)胞排列方向與縱軸的夾角，結(jié)果發(fā)現(xiàn)19C705的夾角顯著大于19C961(圖4(d))。在縱剖面上，19C705的細(xì)胞形狀指數(shù)(細(xì)胞長度/寬度)也明顯高于19C961(圖4(d))。

表1 實(shí)時(shí)定量引物
Table 1 Primers for real-time qPCR

基因IDGene ID引物序列(5'-3')Primer sequence (5'-3')產(chǎn)物長度/bpProduct length退火溫度/℃TmCapana09 g000310_OFP8AGAGAATTGCAACTTCAACACCATGACCCCGAGAGAAGAATATTCCGATGAATC22064.865.1Capana01 g002642_KIN12ATCACCATCTCAGCTATCTCATCTGCTCCAGAGATTTATTTGATGCAGAATGGCAG18065.466.8Capana11 g001424_CycB1CATCATCTTCCCAACCAACAAGTATCTCAGGTAGCGGTCAATAATGTTGATTCG17965.765.1Capana03 g000798_ExpA1CGAGTTTCAAATGTTGTTGTCTTGGCTGACATAGGCATCCAGCCACTTCTAG19966.366.0Capana08 g000965_PGAGTAGCTGAGAACGTGTCAATGGCCCAGCTAGCAACTTGCAAGGTGAAGG18565.966.7Capana03 g002435_GA20ox1TGCATAGAGCAGTGGTAAACAACAAGACCTGAGTGAATTCATGGAGGGTAGGC16465.465.3Capana03 g003744_ZOG1AGCTGGTCGAGATCCGATTCTAATGACCGTGGAAGATAAACGACATGACG17865.266.4Capana12 g000825_ARF3CCCTTTGACAGAAGAAGAATGATCGAGCTACCAGCTCTTGTGAAGGCCTCTG24066.165.8

2.2 19C705果實(shí)發(fā)育調(diào)查

為明確19C705果實(shí)自何時(shí)開始發(fā)生旋轉(zhuǎn)，本研究對發(fā)育前期果實(shí)的旋轉(zhuǎn)情況進(jìn)行了調(diào)查，結(jié)果發(fā)現(xiàn)花后8 d的果實(shí)已經(jīng)有非常明顯的旋轉(zhuǎn)，并且在花后3和5 d都可以發(fā)現(xiàn)子房的不對稱生長(圖5(a)～(e))，說明旋轉(zhuǎn)出現(xiàn)的時(shí)期早于花后3 d。

2.3 轉(zhuǎn)錄組分析

對2種材料6個(gè)樣品進(jìn)行測序共產(chǎn)生39.16 Gb的高質(zhì)量數(shù)據(jù)，各樣品Q30均≥94.74%。在19C705與19C961間共鑒定出1 205個(gè)表達(dá)差異顯著基因，其中713個(gè)基因在19C705中被下調(diào)，492個(gè)基因被上調(diào)(圖6(a))。KOG分析發(fā)現(xiàn)上述差異顯著基因富集在從RNA處理與編輯(RNA processing and modification)到細(xì)胞周期調(diào)控-細(xì)胞分裂-染色體分割(Cell cycle control, cell division, chromosome partitioning)再到細(xì)胞壁-膜-包膜形成(Cell wall/membrane/envelope biogenesis)最后到細(xì)胞骨架(Cytoskeleton)的19個(gè)分類中(圖6(b))。另外，通過以往有關(guān)螺旋生長的研究，本研究在表達(dá)差異顯著基因中根據(jù)GO、COG、KOG、Pfam、Swiss prot、eggNOG和NR注釋，篩選出與細(xì)胞骨架、細(xì)胞周期與分類、細(xì)胞壁和激素相關(guān)的基因共45個(gè)(圖6(c)和(d))。其中，與細(xì)胞骨架相關(guān)基因中有3個(gè)驅(qū)動蛋白(Kinesin)基因(

KIN

-

UA

、

KIN-14G

和

KIN12A

)在19C705中被上調(diào)，1個(gè)Kinesin相關(guān)基因(

KIN-14G

)被下調(diào)；1個(gè)驅(qū)動蛋白輕鏈相關(guān)蛋白(

KLCR3

)基因在19C705中被下調(diào)；2個(gè)

TPX2-like

基因被上調(diào)；1個(gè)成束阿拉伯半乳糖蛋白基因(

FLA12

)與1個(gè)

NPH3

基因被上調(diào)；另外，

Flotillin-like3

(編碼筏蛋白)、

Myosin-2-like

(編碼肌球蛋白)、

OFP

8(編碼OVATE家族蛋白)與

CML19

(編碼鈣調(diào)素相似蛋白)基因均在19C705中被下調(diào)，而

ICR4

(編碼ROP持續(xù)激活抑制子)基因則被上調(diào)(圖6(c))。在與細(xì)胞周期和細(xì)胞分裂相關(guān)的基因中，僅有染色體結(jié)構(gòu)維持蛋白基因(

SMC1

)與

Myb

基因在19C705中被上調(diào)，其他基因包括細(xì)胞周期蛋白基因

CycA2

與

2

個(gè)

CycB1

、

MEI2-like2

、細(xì)胞周期依賴激酶基因(

CDK12/13

)、

Myb113

基因、細(xì)胞分裂控制蛋白基因(

CDC48C

)、絲氨酸/蘇氨酸激酶

TOR

基因(

mTOR

)和

PIF

解旋酶基因(

PIF1-like

helicase

)，均在19C705中被下調(diào)(圖6(c))。在與細(xì)胞壁相關(guān)的基因中，植物細(xì)胞壁GP蛋白基因(

GP1

)、WALL ARE THIN1(

WAT1

)、擴(kuò)展蛋白A1(

ExpA1

)和β葡萄糖苷酶(

BGLU42

)均在19C705中被上調(diào)，而果膠酯酶基因(

PME53

)、多聚半乳糖醛酸酶基因(

PG

)和另一個(gè)

β

葡萄糖苷酶(

BGLU42

)均在19C705中被下調(diào)(圖6(d))。在與植物激素相關(guān)的基因中生長素響應(yīng)因子基因

ARF3

、生長素受體基因

TIR1

、吲哚-3-乙醛酸氧化酶基因

AAO

、生長素響應(yīng)蛋白SAUR32以及生長素極性運(yùn)輸?shù)鞍譒AX3均在19C705中被下調(diào)，而生長素響應(yīng)因子

ARF18

和另一個(gè)生長素響應(yīng)蛋白SAUR則在19C705中被上調(diào)；除生長素相關(guān)基因外，2個(gè)細(xì)胞分裂相關(guān)基因

ZOG1

(玉米素-O-糖基轉(zhuǎn)移酶基因)均在19C705中被下調(diào)；赤霉素相關(guān)基因

GA3ox2

、

GA20ox1

與

GA2ox8

的表達(dá)均在19C705中被上調(diào)，而赤霉素調(diào)節(jié)蛋白基因

GASA6

則在19C705中被下調(diào)(圖6(d))。

19C705和19C961分別代表試驗(yàn)所用的螺絲椒與牛角椒。下同。(a)19C705與19C961成熟果實(shí)表型；(b)橫切、縱切與縱剖切示意圖；(c)和(d)分別為19C705和19C961縱剖切片圖；(e)和(f)分別為19C705和19C961橫切切片圖；(g)和(h)分別為19C705和19C961縱切切片圖。細(xì)胞排列方向與果實(shí)縱軸夾角為φ。圖(c)～(h)比例尺為1 mm。 19C705 and 19C961 respectively represent helical-shaped pepper and horn-shaped pepper used in the test. The same below. (a) 19C705 and 19C961 mature fruit phenotype; (b) Schematic diagram of cross cutting, longitudinal cutting and longitudinal cutting that parallel to the surface; (c) and (d) respectively represent 19C705 and 19C961 longitudinal cut slicediagram that parallel to the surface; (e) and (f) respectively represent 19C705 and 19C961 cross cut slice diagram; (g) and (h) respectively represent 19C705 and 19C961 longitudinal cut slice diagram. The angle between the cell arrangement direction and the longitudinal axis of the fruit is φ. The scale in Figs (c)-(h) is 1 mm.圖1 2種試材表型及徒手切片F(xiàn)ig.1 Phenotype and freehand section of two samples

(a)19C705縱切石蠟切片圖；(b)19C705橫切石蠟切片圖；(c)19C961縱切石蠟切片圖；(d)19C961橫切石蠟切片圖。圖(a)和(c)中的虛線表示子房底端。

(a)花期子房長度、寬度與形狀指數(shù)；(b)花期子房縱切和橫切細(xì)胞總數(shù)；(c)花期子房縱切和橫切細(xì)胞面積。*表示0.05水平差異顯著；**表示0.01水平差異顯著。下同。

(a)果實(shí)長度、寬度與果形指數(shù)；(b)果實(shí)縱切與橫切面細(xì)胞數(shù)；(c)果實(shí)縱切、橫切與縱剖面細(xì)胞面積；(d)果實(shí)縱剖面細(xì)胞排列方向與縱軸夾角以及細(xì)胞在排列方向的細(xì)胞形狀指數(shù)。

2.4 基因表達(dá)的實(shí)時(shí)定量熒光PCR檢測

為了驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果，本試驗(yàn)挑選了8個(gè)基因進(jìn)行了實(shí)時(shí)定量熒光PCR檢測(表2)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)基因的表達(dá)模式與轉(zhuǎn)錄測序結(jié)果一致，其中

OFP8

、

CycB1

、

PG

、

ZOG1

和

ARF3

分別在19C961花期子房中被上調(diào)了2.47、19.66、3.92、187.12和69.03倍；而

ExpA1

和

GA20ox1

分別在19C961被下調(diào)為19C705的0.38和0.51倍；對于

KIN12A

基因而言，其在35個(gè)循環(huán)內(nèi)沒有發(fā)生指數(shù)擴(kuò)增，說明其表達(dá)量低于檢測范圍。

3 討論與結(jié)論

3.1 2種試材果實(shí)形狀差異的組織學(xué)基礎(chǔ)

(a)～(e)為19C705試材花后0、3、5、8和12 d果實(shí)生長表型。

2種試材破色期果實(shí)在長度、果形、螺旋程度和表面平整度上均存在明顯差異。19C705的果實(shí)長度顯著大于19C961，而寬度顯著小于后者，這導(dǎo)致了其果形指數(shù)顯著高于19C961。在組織學(xué)層面，由于19C705的果實(shí)縱切面細(xì)胞大小顯著小于19C961，因此前者的果實(shí)長度主要受細(xì)胞數(shù)目的影響。而在果實(shí)寬度或周長方面，雖然19C705的橫向細(xì)胞數(shù)目顯著高于19C961，但增幅僅有9.74%，19C705果實(shí)的橫向細(xì)胞面積顯著小于19C961并且降幅高達(dá)57.45%。這種細(xì)胞數(shù)目與大小的相反變化趨勢最終導(dǎo)致了19C705果實(shí)寬度顯著小于19C961，同時(shí)也說明了橫向細(xì)胞面積是決定二者寬度的1個(gè)主要調(diào)控因子。綜合果實(shí)縱切、橫切、縱剖面細(xì)胞面積以及細(xì)胞形狀指數(shù)發(fā)現(xiàn)19C705的細(xì)胞較19C961更加細(xì)長。結(jié)合細(xì)胞排列方向與縱軸夾角

φ

，可以通過S=S剖×(S縱×sin

φ

)×1/2或S=S剖×(S橫×cos

φ

)×1/2來粗略估算19C705的平均細(xì)胞大小，也可以通過S=(S剖×S橫×S縱)×1/2來粗略估算19C961的細(xì)胞平均大小。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，19C705細(xì)胞的平均大小介于(10.41×10～11.83×10) mm之間，19C961細(xì)胞的平均大小約為11.88×10mm。這說明2種材料的整體果形與果實(shí)大小主要由細(xì)胞數(shù)目與細(xì)胞形狀共同決定。與上述情況不同的是，2種材料的花期子房在形狀指數(shù)上沒有明顯差異，說明二者果形指數(shù)的差異主要由果實(shí)發(fā)育階段差異決定。二者在子房大小與子房壁細(xì)胞大小上存在差異，可能暗示了開花前的發(fā)育過程影響了子房細(xì)胞的一些基本生長發(fā)育模式。在果實(shí)的螺旋生長方面，本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)2種材料果實(shí)的差異主要體現(xiàn)在縱剖面細(xì)胞排列方向上，其中19C705的細(xì)胞基本呈直線排列，但排列方向與果實(shí)縱軸有明顯的夾角并呈右螺旋方向(果梗端到果頂端方向)，而19C961細(xì)胞排列方向基本與果實(shí)縱軸平行。19C705這種細(xì)胞的排列方式與

spr1

、

spr2

、

trn2

以及

tor2

相似而與

sun

和

eb1b1

相反。由于19C705果實(shí)的螺旋并非由后期細(xì)胞分裂模式改變所導(dǎo)致，因此可以推測其果實(shí)螺旋生長的起始可能發(fā)生在子房發(fā)育較早階段。這種推測通過觀察果實(shí)連續(xù)發(fā)育結(jié)果得到了支持，因?yàn)樵诨ê? d即可觀察到果實(shí)的不對稱生長。另一方面，19C705果面的褶皺主要是由細(xì)胞在分裂方向上波浪狀排列所導(dǎo)致，然而在2種材料的花期子房切片中并沒有觀察到明顯的細(xì)胞排列變化，這種現(xiàn)象可能是由于子房細(xì)胞較小導(dǎo)致其排列變化幅度較小所導(dǎo)致，也可能是由螺旋生長的亞細(xì)胞基礎(chǔ)導(dǎo)致。前人發(fā)現(xiàn)，植物器官螺旋生長的原因之一是細(xì)胞壁纖維素微纖絲的傾斜螺旋排列，在這種情況下，植物細(xì)胞在膨大時(shí)會受到纖維素微纖絲長度與排布方式的約束，進(jìn)而產(chǎn)生螺旋與細(xì)長化，并最終導(dǎo)致細(xì)胞形狀與分裂方向的改變使植物器官呈現(xiàn)螺旋生長。雖然這種纖維素微纖絲排布模式的改變可能發(fā)生在植物器官形成的早期，但是其組織學(xué)與形態(tài)學(xué)的明顯變化卻依賴于細(xì)胞的膨大，因此有可能在器官發(fā)育的早期階段觀察不到細(xì)胞形狀與排列方式的改變。

3.2 2種試材果形差異的轉(zhuǎn)錄基礎(chǔ)

(a)所有差異表達(dá)基因熱圖；(b)差異表達(dá)基因的KOG富集；(c)細(xì)胞骨架、細(xì)胞周期以及與細(xì)胞分裂相關(guān)基因表達(dá)熱圖；(d)細(xì)胞壁與激素相關(guān)基因表達(dá)熱圖.(b)中方括號中的數(shù)字代表富集在對應(yīng)功能的基因數(shù)目，百分?jǐn)?shù)代表占比。

以往研究表明，植物器官的螺旋生長主要由細(xì)胞壁中纖維素微纖絲的排列模式調(diào)控，而纖維素微纖絲的排布模式又受到細(xì)胞中微管排布模式的調(diào)控。本研究在19C705和19C961花期子房轉(zhuǎn)錄組差異表達(dá)基因中篩選出與細(xì)胞骨架相關(guān)的14個(gè)基因，包括了驅(qū)動蛋白基因

KIN

、驅(qū)動蛋白輕鏈相關(guān)蛋白基因

KLCR3

基因、

TPX2-like

家族基因、阿拉伯半乳糖蛋白基因

FLA12

、

NPH3

家族基因、筏蛋白基因

Flotillin-like3

、肌球蛋白

Myosin-2-like

、

OVATE

家族蛋白基因

OFP8

、鈣調(diào)素相似蛋白CML19與ROP持續(xù)激活抑制子基因

ICR4

。其中

KIN

、

KLCR

、

NPH3

和

CML

基因家族成員的突變均被證明可以導(dǎo)致植物器官的螺旋生長。除上述基因外，

ICR

4基因也被發(fā)現(xiàn)在2種材料子房中差異表達(dá)，該基因編碼1個(gè)ROP持續(xù)激活抑制子，而該抑制子被證明編碼植物特異Rho GTP酶并可以與IQ67蛋白結(jié)合。IQ67家族蛋白成員IQD12已被證明在高表達(dá)狀態(tài)下可以通過增加縱向細(xì)胞數(shù)和減少橫向細(xì)胞數(shù)使番茄果形伸長同時(shí)引起營養(yǎng)器官的螺旋生長。而IQ67蛋白也被證明可與

KLCR

、

CaM

以及

CML

互作形成復(fù)合物并通過與微管的結(jié)合調(diào)控纖維素微纖絲的積累方向。因此，

IQ67

相關(guān)通路可能在19C705中被激活并參與調(diào)控果實(shí)的螺旋生長與伸長。有趣的是，除

IQ67

相關(guān)通路基因外，本研究還發(fā)現(xiàn)1個(gè)OFP家族成員基因

OFP8

在19C705中被顯著下調(diào)。OFP蛋白家族成員已被證明在多種作物中調(diào)控器官的形態(tài)，例如在番茄中

OVATE

基因的無義突變會通過改變果實(shí)基部細(xì)胞數(shù)目和伸長細(xì)胞形狀來使果實(shí)伸長并呈倒卵形。因此，19C705子房中

OFP8

的表達(dá)下調(diào)可能也是導(dǎo)致該材料果實(shí)及果實(shí)中細(xì)胞伸長的原因之一。除細(xì)胞骨架相關(guān)基因外，一些與細(xì)胞壁相關(guān)的基因如

GP1

、

WAT1

和擴(kuò)展蛋白

ExpA1

均在19C705中被上調(diào)，而與細(xì)胞壁降解相關(guān)的果膠酯酶基因

PME53

與多聚半乳糖醛酸酶基因

PG

均在19C705中被下調(diào)，這也與子房細(xì)胞的分裂狀態(tài)相對應(yīng)。除上述基因外，由于2種材料果實(shí)在細(xì)胞數(shù)目與形狀間也存在顯著差異，本研究也在差異表達(dá)基因中篩選出與細(xì)胞分裂及激素合成相關(guān)的基因。與細(xì)胞分裂相關(guān)的基因中除

SMC1

與

MYB

外，其余基因包括

CYCLIN

、

CDK

和

CDC

等均在19C705中下調(diào)。這種情況與19C705細(xì)胞數(shù)目多于19C961的現(xiàn)象相反。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能是19C705的細(xì)胞分裂高峰晚于19C961。植物激素尤其是生長素與赤霉素也被證明參與細(xì)胞數(shù)目與大小的調(diào)控。例如在番茄中改變

ARF7

、

ARF20

與

miR160

的表達(dá)以及外施生長素均會導(dǎo)致果形的改變。然而在本試驗(yàn)中除生長素響應(yīng)基因

SAUR

與

ARF18

外，其他篩選出的基因包括與生長素合成、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與極性運(yùn)輸相關(guān)基因均在19C705的子房中被下調(diào)。一方面說明

SAUR

與

ARF18

可能在19C705細(xì)胞分裂與伸長中發(fā)揮了重要作用，另一方面推測生長素在19C705與19C961果形的差異中并非發(fā)揮了最重要的作用。與之相反的是，2個(gè)細(xì)胞分裂素降解相關(guān)基因

ZOG

均在19C705中被顯著下調(diào)，說明19C705子房中細(xì)胞分裂素的積累可能高于19C961，這可能是導(dǎo)致前者細(xì)胞數(shù)目多于后者的原因之一。同時(shí)，19C705子房中赤霉素合成相關(guān)基因

GA20ox1

與赤霉素降解相關(guān)基因

GA2ox8

與

GA3ox2

的表達(dá)均被上調(diào)，說明19C705子房中赤霉素合成通路被激活。這種現(xiàn)象也可歸因于子房中細(xì)胞分裂素含量的提高，前人研究發(fā)現(xiàn)較高濃度的細(xì)胞分裂素可以誘導(dǎo)赤霉素的合成，植物體為了平衡體內(nèi)提高的赤霉素含量又激活了赤霉素降解通路基因。

表2 實(shí)時(shí)定量熒光PCR相對表達(dá)檢測結(jié)果
Table 2 Relative expression values of the interested genes in the real-time qPCR

基因IDGene ID19C705相對表達(dá)量19C705 relative expression level19C961相對表達(dá)量19C961 relative expression levelCapana09 g000310_OFP81.00±0.102.47±0.05Capana01 g002642_KIN12A1.00±0.03N.D.Capana11 g001424_CycB11.00±0.0819.66±3.04Capana03 g000798_ExpA11.00±0.040.38±0.08Capana08 g000965_PG1.00±0.063.92±0.07Capana03 g002435_GA20ox11.00±0.020.51±0.01Capana03 g003744_ZOG11.00±0.01187.12±40.11Capana12 g000825_ARF31.00±0.0569.03±1.43

注：N.D.表示在35個(gè)循環(huán)內(nèi)沒有檢測到指數(shù)擴(kuò)增。19C705和19C961分別代表試驗(yàn)中所用的螺絲椒與牛角椒試材。

Note: N.D. indicates that exponential amplification is not detected within 35 cycles. 19C705 and 19C961 respectively represent helical-shaped pepper and horn-shaped pepper used in the test.

綜上所述，19C705果實(shí)可能通過改變

KIN

、

NPH3

以及

IQ67

通路相關(guān)基因

KLCR3

、

CML

與

ICR4

的表達(dá)來調(diào)控子房中細(xì)胞的初始分裂方向使果實(shí)呈現(xiàn)螺旋生長的表型，同時(shí)可能通過調(diào)控

IQ67

通路相關(guān)基因、

OFP8

以及細(xì)胞分裂相關(guān)基因的表達(dá)來增加縱向與橫向細(xì)胞數(shù)目并影響細(xì)胞形狀，最終使果實(shí)伸長。