包 華 李 康 鐘睦琪 郝智慧*

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 化學(xué)與藥學(xué)院，山東 青島 266109； 2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院/中獸醫(yī)創(chuàng)新中心，北京 100193)

番茄是世界上種植面積第二大的蔬菜，也是我國重要的經(jīng)濟(jì)作物。番茄灰霉病是由灰葡萄孢菌(

Botrytis

cinerea

)侵染引起的一種世界性番茄病害，其傳播速度快且危害重，是番茄上發(fā)生最嚴(yán)重且最頻繁的病害。該病主要危害果實(shí)，造成果實(shí)腐爛，也可危害葉、莖和花，極大影響了番茄產(chǎn)量，嚴(yán)重時(shí)可減產(chǎn)20%～30%，給農(nóng)戶帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

近年來，番茄灰霉病以化學(xué)藥劑防治為主，不僅污染環(huán)境，而且易使病菌產(chǎn)生抗藥性，導(dǎo)致防效降低。植物源農(nóng)藥是國內(nèi)外新農(nóng)藥研發(fā)熱點(diǎn)之一。植物源農(nóng)藥取材于植物中的天然活性成分，在自然環(huán)境中可被有效降解，同時(shí)可以有效殺死或有效抑制病原菌的生長(zhǎng)，其種類繁多、資源豐富，并且無殘留，低毒或無毒，不易使病原菌產(chǎn)生抗性。植物源農(nóng)藥結(jié)構(gòu)類型涉及萜類、生物堿類、黃酮類、醌類、酯類、酚類、醛類、醇類、甾類、有機(jī)酸及精油類等化合物。

目前，國內(nèi)外有關(guān)植物體內(nèi)生物堿化合物的分離及抑菌作用研究較多，相關(guān)報(bào)道也證明了生物堿對(duì)植物病原菌具有顯著的抑制作用。如小檗堿能抑制水稻細(xì)菌性條斑病菌的正常生長(zhǎng)，并使其致病力降低；0.5%苦參堿水劑防治蘋果樹腐爛病效果優(yōu)異，明顯優(yōu)于市場(chǎng)上常用的40%福美砷；胡椒堿的類似物蓽茇寧酰胺對(duì)枯草芽孢桿菌具有很強(qiáng)的抑制活性。

胡椒堿是胡椒科植物特有的一種生物堿，具有良好的抗炎和抗菌作用，如黑胡椒石油醚提取物可破壞大腸桿菌以及金葡萄球菌細(xì)胞壁和細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，從而達(dá)到抑菌效果。但胡椒堿對(duì)植物病原菌抑制效果的研究鮮有報(bào)道，本研究通過測(cè)定胡椒堿對(duì)番茄灰霉病菌抑菌活性，以及從顯微結(jié)構(gòu)、細(xì)胞膜通透性和酶活性等方面探究胡椒堿對(duì)番茄灰霉病菌的作用機(jī)理，以期為胡椒堿的田間利用及植物源農(nóng)藥的研制開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

番茄灰霉病菌由青島農(nóng)業(yè)大學(xué)綠色農(nóng)藥研究所提供，于4 ℃條件下保存。將保存的菌種轉(zhuǎn)接到培養(yǎng)平板上進(jìn)行活化，置于26 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至菌絲長(zhǎng)滿整個(gè)平板，用打孔器沿菌落外緣打取直徑為5 mm的菌餅備用。

胡椒堿(Piperine，純度≥98%)購于上海麥克林生物科技有限公司，PDA培養(yǎng)基、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒、琥珀酸脫氫酶(SDH)試劑盒、NAD-蘋果酸脫氫酶(NAD-MDH)試劑盒、考馬斯亮藍(lán)(G-250)和牛血清白蛋白(BSA)購于北京索萊寶有限公司，二甲基亞砜(DMSO)和葡萄糖購于國藥化學(xué)試劑有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1

.

2

.

1

胡椒堿溶液的配制

準(zhǔn)確稱取胡椒堿20 mg，用DMSO溶解，配置成20 000 mg/L的胡椒堿儲(chǔ)備液。

1

.

2

.

2

番茄灰霉病菌抑菌活性和產(chǎn)孢量的測(cè)定采用生長(zhǎng)速率法測(cè)定胡椒堿對(duì)番茄灰霉菌的抑菌活性。將配置好的儲(chǔ)備液添加到PDA培養(yǎng)基(約50 ℃)中，配置成質(zhì)量濃度分別為200.0、150.0、100.0、50.0、25.0和12.5 mg/L的含藥培養(yǎng)基，搖勻后倒平板；以添加相同濃度的百菌清為陽性對(duì)照，以添加相同劑量(200.0 μL)的DMSO的培養(yǎng)基作為陰性對(duì)照(CK)，在培養(yǎng)基中央接種

d

=5 mm經(jīng)純培養(yǎng)的番茄灰霉菌菌絲圓片，26 ℃恒溫培養(yǎng)。4 d后用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，計(jì)算抑制生長(zhǎng)率，每處理3次重復(fù)。采用濃度對(duì)數(shù)-抑制率概率值法求取毒力回歸方程及半數(shù)效應(yīng)濃度(EC)。將番茄灰霉病菌接種在PDA培養(yǎng)基上，26 ℃恒溫培養(yǎng)7 d，待對(duì)照產(chǎn)生大量分生孢子后，用無菌水洗脫孢子，配置成孢子懸浮液，計(jì)算產(chǎn)孢抑制率。計(jì)算公式如下：

抑制率=

(1)

產(chǎn)孢抑制率

(2)

1

.

2

.

3

番茄灰霉病菌孢子萌發(fā)的測(cè)定

番茄灰霉病菌培養(yǎng)7～8 d后使其產(chǎn)孢，加無菌水配制成孢子懸浮液數(shù)量為1×10CFU/mL，在凹玻片上加入與1.2.2相同質(zhì)量濃度的胡椒堿，26 ℃黑暗條件下培養(yǎng)12 h后，計(jì)算孢子萌發(fā)率。

孢子萌發(fā)率

(3)

1

.

2

.

4

番茄灰霉病菌菌絲形態(tài)測(cè)定

配置質(zhì)量濃度為25.0、50.0和100.0 mg/L的PDA培養(yǎng)基。在平皿中央接種番茄灰霉病菌，在菌落邊緣斜插蓋玻片，待菌絲長(zhǎng)到蓋玻片上，取出，通過掃描電鏡觀察菌絲形態(tài)并進(jìn)行比較。

1

.

2

.

5

番茄灰霉病菌菌體可溶性蛋白含量測(cè)定

采用考馬斯亮藍(lán)G-250染色法測(cè)定菌絲可溶性蛋白含量。

1

.

2

.

6

番茄灰霉病細(xì)胞膜通透性的測(cè)定

采用電導(dǎo)率法，將PDB培養(yǎng)液中的菌絲培養(yǎng)3 d，于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期取出，用超純無菌水沖洗4次，用濾紙吸干水分。稱取1.5 g菌絲均分為6份，分別加到質(zhì)量濃度為200.0、100.0、50.0、25.0和12.5 mg/L含胡椒堿溶液的去離子水和對(duì)照組中，對(duì)照組加上等量的去離子水，在環(huán)境條件為25 ℃時(shí)分別測(cè)定0、1、2、3、4、5和6 h電導(dǎo)率。根據(jù)電導(dǎo)率變化，觀察胡椒堿對(duì)細(xì)胞膜通透性的影響。

1

.

2

.

7

番茄灰霉病菌菌體相關(guān)酶(SOD、CAT、POD、SDH和NAD

-

MDH)活性測(cè)定

按照1.2.6取菌絲方法，將菌絲冰浴研磨成勻漿后離心，取得上清液為粗酶液，將粗酶液(菌絲)按照參考文獻(xiàn)[19]方法進(jìn)行操作，加入所需試劑。SOD酶活性測(cè)定將560 nm吸光度下以黃嘌呤氧化酶偶聯(lián)反應(yīng)體系中抑制百分率為50%時(shí)定義為 1個(gè)活力單位，CAT酶活性測(cè)定將240 nm吸光度下每毫克蛋白每分鐘減少0.01吸光度定義為1個(gè)活力單位，POD酶活性測(cè)定將470 nm吸光度下每毫克蛋白每分鐘增加0.01吸光度定義為1個(gè)活力單位，SDH酶活性測(cè)定將600 nm吸光度下每毫克蛋白每分鐘使反應(yīng)體系吸光度降低0.01為1個(gè)活力單位，NAD-MDH酶活性測(cè)定將340 nm吸光度下每毫克蛋白每分鐘使反應(yīng)體系吸光度降低0.01為1個(gè)活力單位。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Excel 2007和Graphpad進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和繪圖，利用SPSS 19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)的方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同質(zhì)量濃度胡椒堿對(duì)番茄灰霉病菌生長(zhǎng)的抑制作用

不同質(zhì)量濃度胡椒堿對(duì)番茄灰霉病菌的抑菌活性測(cè)定結(jié)果見表1。毒力回歸方程為

y

=3.849 6+0.904 2

x

，相關(guān)系數(shù)

R

≥0.95。試驗(yàn)結(jié)果表明，不同質(zhì)量濃度的胡椒堿對(duì)番茄灰霉病抑制效果顯著差異，隨著質(zhì)量濃度的增加抑菌率也在增加，呈劑量依賴性。當(dāng)胡椒堿質(zhì)量濃度為200.0 mg/L時(shí)，其抑菌率為80.61%。胡椒堿對(duì)番茄灰霉病菌菌絲生長(zhǎng)EC為18.72 mg/L，其置信限為8.30～42.24 mg/L。陽性對(duì)照藥物百菌清對(duì)番茄灰霉病菌EC為20.65 mg/L，由此可見胡椒堿對(duì)番茄灰霉病菌的抑制效果優(yōu)于百菌清對(duì)番茄灰霉病菌的抑制效果。

表1 不同質(zhì)量濃度胡椒堿對(duì)番茄灰霉病菌的抑菌活性
Table 1 Antifungal activity of piperine against with different mass concentrations

質(zhì)量濃度/(mg/L)Mass concentration質(zhì)量濃度對(duì)數(shù)Mass concentrationlogarithm菌落直徑/cm Colony diameter123平均值抑制率/%Inhibition rateEC50/(mg/L)05.755.705.765.7412.51.093.553.453.373.4643.5325.01.402.903.03.062.9952.4950.01.702.132.262.42.2666.3218.72100.02.001.571.631.791.6677.87150.02.181.601.611.651.6278.63200.02.301.501.531.521.5280.61

2.2 不同質(zhì)量濃度胡椒堿對(duì)番茄灰霉病菌孢子產(chǎn)量的影響

胡椒堿對(duì)番茄灰霉病菌孢子產(chǎn)量抑制結(jié)果見圖1。不同質(zhì)量濃度的(200.0、150.0、100.0、50.0、25.0和12.5 mg/L)胡椒堿處理番茄灰霉病菌后，孢子數(shù)量分別為3.04×10、5.62×10、7.20×10、13.58×10、18.00×10和21.38×10cfu/mL，對(duì)應(yīng)的孢子產(chǎn)孢抑制率分別為88.30%、78.36%、72.27%、47.75%、30.77%和17.79%，孢子產(chǎn)孢量EC為45.11 mg/L。與CK對(duì)比，產(chǎn)孢量顯著下降。上述結(jié)果表明，胡椒堿對(duì)番茄灰霉病菌產(chǎn)孢量具有明顯抑制效果，且質(zhì)量濃度越大，抑制效果越好。

不同字母表示差異顯著(P<0.05)，相同字母表示差異不顯著(P>0.05)。下同。 Different letters represent significant differences (P<0.05), while the same letters represent no significant differences (P>0.05). The same below.圖1 不同質(zhì)量濃度胡椒堿對(duì)番茄灰霉病菌孢子產(chǎn)生的影響Fig.1 The effect of different mass concentrations of piperine on the spore production of B. cinerea

2.3 不同質(zhì)量濃度胡椒堿對(duì)番茄灰霉病菌孢子萌發(fā)的影響

載玻片萌發(fā)法測(cè)定番茄灰霉病菌孢子萌發(fā)結(jié)果表明(圖2)，隨著胡椒堿質(zhì)量濃度的增加，對(duì)孢子萌發(fā)的抑制作用增強(qiáng)。胡椒堿質(zhì)量濃度在200.0 mg/L下，孢子萌發(fā)率為16.92%，孢子萌發(fā)抑制率高達(dá)88.81%。高質(zhì)量濃度胡椒堿對(duì)番茄灰霉病菌孢子萌發(fā)具有較強(qiáng)的抑制效果，胡椒堿對(duì)孢子萌發(fā)EC為38.86 mg/L。

2.4 胡椒堿對(duì)番茄灰霉病菌超微結(jié)構(gòu)的影響

通過掃描電鏡觀察，不同質(zhì)量濃度胡椒堿處理的番茄灰霉病菌菌絲形態(tài)與對(duì)照相比存在明顯差異。對(duì)照組菌絲粗細(xì)均勻、形態(tài)規(guī)則(圖3(a))；處理組菌絲變細(xì)、節(jié)間拉長(zhǎng)、菌絲干癟和坍塌(圖3(b)～(d))。

2.5 胡椒堿對(duì)番茄灰霉病菌菌絲體可溶性蛋白含量的影響

采用胡椒堿處理后的番茄灰霉病菌菌絲體(表2)可溶性蛋白含量隨著胡椒堿質(zhì)量濃度的升高呈降低的趨勢(shì)，說明胡椒堿影響了可溶性蛋白的合成或是破壞了細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)從而造成可溶性蛋白流失。

圖2 不同質(zhì)量濃度胡椒堿對(duì)番茄灰霉病菌孢子萌發(fā)的影響Fig.2 The effect of different mass concentrations of piperine on spore germination of B. cinerea

2.6 胡椒堿對(duì)番茄灰霉菌體細(xì)胞膜滲透性的影響

采用電導(dǎo)率法測(cè)定了胡椒堿對(duì)番茄灰霉菌體細(xì)胞膜滲透性的影響，結(jié)果如圖4所示。未經(jīng)胡椒堿處理的菌液(CK組和DMSO組)電導(dǎo)率在作用1～6 h內(nèi)基本沒有變化，經(jīng)胡椒堿處理后的菌液電導(dǎo)率均有不同程度的變化。當(dāng)胡椒堿作用時(shí)間超過2 h時(shí)，隨著胡椒堿質(zhì)量濃度的增大，電導(dǎo)率也隨之增大；作用時(shí)間相同時(shí)，胡椒堿質(zhì)量濃度越大，相應(yīng)菌液的電導(dǎo)率也越大。說明經(jīng)胡椒堿處理后的番茄灰霉病菌菌絲細(xì)胞膜受到損傷，細(xì)胞內(nèi)的小分子如Na、K和Ca等離子外漏，導(dǎo)致電導(dǎo)率發(fā)生變化。

2.7 胡椒堿對(duì)番茄灰霉病菌菌體酶活系統(tǒng)的影響

2

.

7

.

1

胡椒堿對(duì)番茄灰霉病菌抗氧化酶(SOD、CAT和POD)相關(guān)活性的影響

胡椒堿對(duì)番茄灰霉病菌菌體SOD、CAT和POD酶活性的影響如圖5所示。從圖中可以看出，經(jīng)200.0、100.0、50.0和25.0 mg/L胡椒堿處理的番茄灰霉病菌菌體SOD、CAT和POD酶活性均顯著低于對(duì)照組，且菌體SOD、CAT和POD酶活性隨著胡椒堿質(zhì)量濃度增加呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。說明胡椒堿抑制了番茄灰霉病菌菌體內(nèi)抗氧化酶系統(tǒng)活性，導(dǎo)致菌體內(nèi)活性氧離子不能被及時(shí)清除，從而達(dá)到抑菌效果。

2

.

7

.

2

胡椒堿對(duì)番茄灰霉菌體SDH和NAD

-

MDH酶相關(guān)活性的影響

胡椒堿對(duì)番茄灰霉病菌菌體SDH和NAD-MDH酶活性的測(cè)定結(jié)果如圖6所示。經(jīng)200.0、100.0、50.0和25.0 mg/L胡椒堿處理的番茄灰霉病菌菌體SDH和NAD-MDH酶活性均顯著低于對(duì)照組，

圖3 不同質(zhì)量濃度胡椒堿對(duì)番茄灰霉病菌菌絲形態(tài)的影響Fig.3 The effect of different mass concentrations of piperine on the hyphae morphology of B. cinerea

表2 不同質(zhì)量濃度胡椒堿對(duì)番茄灰霉病菌菌絲體 可溶性蛋白含量的影響
Table 2 The effect of different mass concentrations of piperine on the soluble protein of

質(zhì)量濃度/(mg/L)Massconcentration可溶性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)/(mg/g)Soluble protein massconcentration抑制率/%Inhibitionrate03.617±0.100 a-12.53.291±0.070 a9.0225.02.875±0.090 b20.5250.02.756±0.160 b23.79100.02.132±0.010 c41.05200.01.191±0.080 d67.06

注：同列數(shù)據(jù)不同字母表示差異顯著(<0.05)。

Note: Within the same column, different letters represent significant differences (<0.05).

圖4 不同質(zhì)量濃度胡椒堿對(duì)番茄灰霉病菌 細(xì)胞膜通透性的影響Fig.4 The effect of different mass concentrations of piperine on the cell membrane permeability of B. cinerea

且菌體SDH和NAD-MDH酶活性隨著胡椒堿質(zhì)量濃度增加呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。SDH和NAD-MDH酶是三磷酸循環(huán)中2種重要的氧化還原酶，胡椒堿通過降低番茄灰霉病菌菌體SDH和NAD-MDH酶活力，從而抑制菌體內(nèi)的能量代謝，最終抑制菌體生長(zhǎng)。

圖5 不同質(zhì)量濃度胡椒堿對(duì)番茄灰霉病菌抗氧化酶活性的影響Fig.5 The effect of different mass concentrations of piperine on the activity of antioxidant enzymes of B. cinerea

圖6 不同質(zhì)量濃度胡椒堿對(duì)番茄灰霉病菌SDH和NAD-MDH酶活性的影響Fig.6 The effect of different mass concentrations of piperine on the enzyme activities of SDH and NAD-MDH of B.cinerea

3 討論與結(jié)論

目前，胡椒堿及其衍生物對(duì)植物病原真菌的研究主要集中在抑菌活性方面，但胡椒堿對(duì)植物病原真菌抑菌機(jī)理尚不明確?；诖?，本研究通過胡椒堿對(duì)番茄灰霉病菌抑菌機(jī)理展開研究，進(jìn)而確定抑制靶點(diǎn)。本研究結(jié)果表明，胡椒堿對(duì)番茄灰霉病菌菌絲孢子的產(chǎn)生和萌發(fā)均具有強(qiáng)烈的抑制作用，胡椒堿可造成菌絲生長(zhǎng)畸形，并使其產(chǎn)孢能力、芽管長(zhǎng)度和孢子萌發(fā)率下降。這與張新虎等研究的蒼耳提取物對(duì)孢子和菌絲的抑制作用結(jié)果一致，表明胡椒堿中可能含有能抑制孢子和菌絲呼吸作用的活性物質(zhì)，并通過抑制孢子和菌絲的呼吸而實(shí)現(xiàn)抑菌作用?？扇苄缘鞍鬃鳛橹匾臐B透調(diào)節(jié)物質(zhì)和營養(yǎng)物質(zhì)，對(duì)細(xì)胞的生命物質(zhì)及生物膜起到保護(hù)作用，其含量變化是衡量生物活性的一個(gè)重要的生理指標(biāo)。本研究發(fā)現(xiàn)，番茄灰霉病菌經(jīng)胡椒堿處理后菌液電導(dǎo)率上升，說明其細(xì)胞膜滲透性發(fā)生改變。進(jìn)一步測(cè)定番茄灰霉病菌可溶性蛋白含量發(fā)現(xiàn)，胡椒堿處理后番茄灰霉病菌的可溶性蛋白含量出現(xiàn)明顯下降，表明胡椒堿主要通過抑制可溶性蛋白的合成，致使細(xì)胞膜受損而導(dǎo)致菌絲死亡。

抗氧化酶作為細(xì)胞內(nèi)重要的保護(hù)酶系廣泛分布于生物體內(nèi)，通過分工協(xié)作共同清除細(xì)胞內(nèi)活性氧類。SOD酶可以把有害的超氧自由基轉(zhuǎn)化為過氧化氫，盡管過氧化氫仍是對(duì)機(jī)體有害的活性氧，但體內(nèi)的CAT酶和POD酶會(huì)立即將其分解為完全無害的水。只有3種酶共同協(xié)作才可組成一個(gè)完整的防氧化鏈，但目前研究中僅少數(shù)藥物可同時(shí)對(duì)這3種抗氧化酶產(chǎn)生抑制效果。周杰辰等研究表明黃檀炭疽病菌經(jīng)垂序商陸與勝紅薊乙酸乙酯提取物處理后，SOD酶活力降低，CAT酶活力升高。本研究通過胡椒堿處理番茄灰霉病菌菌體后，菌體SOD、POD和CAT酶活性均顯著下降，與周杰辰等研究結(jié)果不同。表明胡椒堿可通過抑制番茄灰霉病菌菌絲細(xì)胞中的防御酶活性從而抑制菌絲生長(zhǎng)。此外，通過測(cè)定胡椒堿對(duì)番茄灰霉病菌菌體SDH和NAD-MDH酶活性，結(jié)果顯示SDH和NAD-MDH酶活性均有不同程度的降低。SDH和NAD-MDH酶是三羧酸循環(huán)中的關(guān)鍵酶，三羧酸循環(huán)是需氧生物體內(nèi)普遍存在的代謝途徑，因?yàn)榧?xì)胞通過呼吸代謝獲取能量，所以三羧酸循環(huán)受阻將導(dǎo)致細(xì)胞死亡。番茄灰霉病菌菌體中的SDH和NAD-MDH酶活性被胡椒堿抑制，導(dǎo)致菌絲體活力下降，從而對(duì)菌絲生長(zhǎng)起到了抑制作用。

在研究胡椒堿對(duì)番茄灰霉病菌抑菌機(jī)理基礎(chǔ)上，為提高對(duì)番茄灰霉病菌抑制效果，還有很多工作要做。如在盆栽或者大田條件下應(yīng)用胡椒堿對(duì)活體番茄灰霉病菌抑制效果進(jìn)行測(cè)定，以便胡椒堿更好應(yīng)用于實(shí)踐生產(chǎn)中。此外，還應(yīng)通過分子層面上探索胡椒堿對(duì)番茄灰霉病菌抑制作用，更深一步的探討其作用靶點(diǎn)。

從植物中篩選出活性更高的化合物，尋找更為理想的殺菌劑，是當(dāng)前十分活躍的研究領(lǐng)域。本研究表明，胡椒堿對(duì)番茄灰霉病菌有著良好的抑制效果，可針對(duì)多靶點(diǎn)進(jìn)行抑制，研究結(jié)果為番茄灰霉病菌的防治提供了新方向，為新型無公害防治藥劑的研制提供了基礎(chǔ)理論依據(jù)和參考借鑒。