陳 卓，馮敬敬，劉愛(ài)玲，馬利芳，牛登云，孟小賓，陳家锃

（天津渤海農(nóng)牧產(chǎn)業(yè)聯(lián)合研究院有限公司，天津 300308）

冠狀病毒在系統(tǒng)分類(lèi)上屬冠狀病毒科、冠狀病毒屬，于1937年從雞身上分離得到[1]。冠狀病毒通過(guò)呼吸道分泌物排出體外，經(jīng)口液、噴嚏、接觸傳染，并通過(guò)空氣飛沫傳播，是許多家禽家畜、寵物包括人類(lèi)疾病的重要病原，可引起多種急慢性疾病[2]。在對(duì)冠狀病毒的各種預(yù)防和控制措施中，消毒是切斷傳播途徑重要措施之一[3]。禽傳染性支氣管炎病毒（Infectious bronchitis virus, IBV）屬于冠狀病毒科、γ冠狀病毒屬[4]。美國(guó)環(huán)境保護(hù)署（environmental protection agency, EPA）已推薦IBV為SARS病毒的替代病毒用于病毒滅活試驗(yàn)[5]。由于冠狀病毒存在傳染性危險(xiǎn)，因此本實(shí)驗(yàn)利用IBV H120株作為指示病毒，是一種合理的替代試驗(yàn)方式[6]。本研究利用IBV作為替代病毒用于消毒試驗(yàn)研究[7]，評(píng)估六種消毒劑對(duì)冠狀病毒的殺滅效果，為臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

市面上消毒劑種類(lèi)繁多，消毒原理和作用也大不相同，根據(jù)消毒劑的化學(xué)性質(zhì)，一般將其分為酚類(lèi)、堿類(lèi)、醛類(lèi)、季銨鹽類(lèi)、含氯制劑、含碘制劑、過(guò)氧化物類(lèi)、醇類(lèi)[8-9]。如何正確的選擇和使用消毒劑成為一個(gè)實(shí)際問(wèn)題。本研究建立的消毒劑評(píng)估模型為如何正確選擇消毒劑提供了參考。

1 材料和方法

1.1 雞胚、毒株、待測(cè)消毒劑及生化試劑 9～10日齡雞胚購(gòu)自北京勃林格殷格翰維通生物技術(shù)有限公司；毒株選擇純凈IBV H120株（EID50=10-7.0/0.1 mL），由天津瑞普生物空港基地實(shí)驗(yàn)室制備；過(guò)硫酸氫鉀復(fù)合物粉（瑞普生物，批號(hào)為20191005，有效氯不少于10%），月芐三甲氯銨（瑞普生物，批號(hào)為20200112，10%），戊二醛癸甲溴銨溶液（瑞普生物，批號(hào)20190814，戊二醛5 g+葵甲溴銨5 g/100 mL），二氯異氰脲酸鈉粉（內(nèi)蒙古瑞普大地，批號(hào)為190201，有效氯20%），消毒劑84（捷力達(dá)，批號(hào)為20190901，有效氯≥4.5%），75%酒精（利爾康，批號(hào)為20190610）；PCR所用試劑均購(gòu)自TaKaRa公司。

1.2 雞胚法消毒效果評(píng)估模型建立

1.2.1 消毒劑對(duì)雞胚的最大無(wú)毒濃度的測(cè)定 將消毒劑按照100倍梯度采用無(wú)菌PBS稀釋后與無(wú)菌PBS等量混勻后，取200 μL尿囊腔接種9～10日齡雞胚，摸索消毒劑對(duì)雞胚的最大無(wú)毒濃度。每種消毒劑稀釋8個(gè)梯度（1∶5、1∶10、1∶50、1∶100、1∶200、1∶300、1∶400、1∶800），每個(gè)稀釋梯度接種3枚雞胚；同時(shí)將200 μL無(wú)菌PBS經(jīng)尿囊腔接種3枚9～10日齡雞胚作為空白對(duì)照。接種后置于孵化器中培養(yǎng)72 h、24 h內(nèi)死亡的胚忽略不計(jì)，記錄雞胚死亡情況。24 h后死亡胚和72 h活胚逐個(gè)解剖觀察消毒劑對(duì)雞胚有無(wú)損傷，記錄消毒劑對(duì)雞胚的最大無(wú)毒濃度。

1.2.2 消毒劑最大有效稀釋度測(cè)定 將上述測(cè)定的消毒劑最大無(wú)毒濃度作為起始濃度，將病毒液稀釋成1000 EID50、500 EID50、200 EID50。用無(wú)菌PBS將消毒劑進(jìn)行100倍梯度稀釋?zhuān)♂尯蠹尤氲润w積稀釋后病毒液，渦旋30 s進(jìn)行充分混勻，于室溫下靜置30 min使消毒劑與病毒液充分作用。取以上反應(yīng)物200 μL尿囊腔接種9～10日齡雞胚，每個(gè)稀釋度接種3枚雞胚，同時(shí)將200 μL無(wú)菌PBS尿囊腔接種3枚9～10日齡雞胚作為空白對(duì)照。將接種雞胚置于孵化器中培養(yǎng)72 h。待實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，24 h內(nèi)死亡的胚忽略不計(jì)，24 h以后死亡的雞胚單獨(dú)收獲尿囊液，72 h未死亡的雞胚，每個(gè)稀釋度的雞胚尿囊液收集于同一個(gè)無(wú)菌的EP管中。將收獲的尿囊液進(jìn)行病毒RT-PCR實(shí)驗(yàn)，鑒定是否有病毒存在。

1.2.3 消毒劑最短有效感作時(shí)間測(cè)定 根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)測(cè)得的消毒劑起始濃度和最大有效稀釋度，取二者中濃度作為此次消毒劑的作用濃度，用無(wú)菌PBS將消毒劑稀釋到該濃度。將病毒液稀釋成1000 EID50、500 EID50、200 EID50。將稀釋好的消毒劑與病毒液等體積混合，渦旋30 s進(jìn)行充分混勻，于室溫下分別靜置5 min、10 min使消毒劑與病毒液充分作用。取以上反應(yīng)物200 μL尿囊腔接種9～10日齡雞胚，每個(gè)稀釋度接種3枚雞胚，同時(shí)將200 μL無(wú)菌PBS尿囊腔接種3枚9～10日齡雞胚作為空白對(duì)照。將接種雞胚置于孵化器中培養(yǎng)72 h。待實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，24 h內(nèi)死亡的胚忽略不計(jì)，24 h以后死亡的雞胚單獨(dú)收獲尿囊液，72 h未死亡的雞胚，每個(gè)稀釋度的雞胚尿囊液收集于同一個(gè)無(wú)菌的EP管中。將收獲的尿囊液進(jìn)行病毒RT-PCR實(shí)驗(yàn)，鑒定是否有病毒存在。

2 結(jié)果

2.1 消毒劑對(duì)雞胚的最大無(wú)毒濃度結(jié)果分析 根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，過(guò)硫酸氫鉀復(fù)合物粉、84消毒劑在1∶5倍稀釋時(shí)出現(xiàn)死胚，故兩種消毒劑最大無(wú)毒濃度均為1∶10倍稀釋?zhuān)缕S三甲氯銨、戊二醛癸甲溴銨溶液、二氯異氰脲酸鈉粉在1∶50倍稀釋時(shí)出現(xiàn)死胚，故三種消毒劑最大無(wú)毒濃度均為1∶100。陰性對(duì)照成立。具體結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 消毒劑最大無(wú)毒濃度結(jié)果分析Table 1 Analysis of the results of the maximum non-toxic concentration of disinfectant

2.2 消毒劑最大有效稀釋度結(jié)果分析 根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在與病毒液感作30 min后，過(guò)硫酸氫鉀復(fù)合物粉的殺滅效果最好，在1∶8000倍稀釋后仍能殺滅IBV；其次為二氯異氰脲酸鈉和月芐三甲氯銨，在1∶4000和1∶3200倍稀釋后仍能殺滅IBV。對(duì)照組成立。詳細(xì)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 消毒劑最大有效稀釋度結(jié)果分析Table 2 Analysis of the results of maximum effective dilution of disinfectants

（接上表）

2.3 消毒劑最短有效感作時(shí)間結(jié)果分析 根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，過(guò)硫酸氫鉀復(fù)合物粉1∶4000倍稀釋、二氯異氰脲酸鈉1∶2000倍稀釋、84消毒劑1∶600倍稀釋后可在5 min內(nèi)完全殺滅IBV，10%月芐三甲氯銨1∶1600倍稀釋、戊二醛癸甲溴銨溶液1∶1300倍稀釋后可在10 min內(nèi)完全殺滅IBV。75%的酒精殺滅病毒所需時(shí)間最長(zhǎng)。詳細(xì)結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 消毒劑最短有效作用時(shí)間結(jié)果分析Table 3 Analysis of the results of the shortest effective time of disinfectants

3 討論

在各種預(yù)防和控制措施中，做好消毒是切斷傳播途徑重要措施之一。消毒措施不應(yīng)該盲目進(jìn)行，應(yīng)科學(xué)合理進(jìn)行消毒。如何選擇正確的消毒劑變得尤為重要。市面上消毒劑種類(lèi)繁多，其產(chǎn)品的主要成分及復(fù)配成分不同，其殺滅效果有差異[10]。若消毒劑選用不當(dāng)，不僅起不到消毒效果，還會(huì)進(jìn)一步的影響生物安全。本研究建立了雞胚法消毒效果評(píng)估模型，選擇過(guò)硫酸氫鉀復(fù)合物粉、10%月芐三甲氯銨、戊二醛癸甲溴銨溶液、二氯異氰脲酸鈉粉（有效氯20%）、消毒劑84，以及75%酒精六種消毒劑進(jìn)行消毒評(píng)估實(shí)驗(yàn)。從最大有效稀釋度和最短有效感作時(shí)間這兩個(gè)方面對(duì)這六種消毒劑進(jìn)行評(píng)估實(shí)驗(yàn)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和雞胚實(shí)驗(yàn)均屬于活體實(shí)驗(yàn)，相比較動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，建立雞胚法消毒效果評(píng)估模型，更加方便操作，容易觀察，重復(fù)性好，經(jīng)濟(jì)，衛(wèi)生，實(shí)驗(yàn)耗時(shí)短等優(yōu)點(diǎn)[11]，可以更加方便快捷的運(yùn)用于不同消毒劑的效果評(píng)估。

IBV屬于冠狀病毒屬，是有包膜的RNA病毒，包膜具有親脂性，因此對(duì)消毒劑的作用較敏感[12]，對(duì)含氯消毒劑、季銨鹽類(lèi)、醇類(lèi)消毒劑均較敏感。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，根據(jù)消毒劑最大有效稀釋度結(jié)果分析，在與病毒液感作30 min后，過(guò)硫酸氫鉀復(fù)合物粉的殺滅效果最好，在1∶8000倍稀釋后仍能殺滅IBV；其次為二氯異氰脲酸鈉和月芐三甲氯銨，在1∶4000和1∶3200倍稀釋后仍能殺滅IBV。通過(guò)對(duì)最小有效感作時(shí)間的摸索，過(guò)硫酸氫鉀復(fù)合物粉1∶4000倍稀釋、二氯異氰脲酸鈉1∶2000倍稀釋、84消毒劑1∶600倍稀釋后可在5 min內(nèi)完全殺滅IBV；10%月芐三甲氯銨1∶1600倍稀釋、戊二醛癸甲溴銨溶液1∶1300倍稀釋后需10 min完全殺滅IBV；75%的酒精殺滅病毒所需時(shí)間最長(zhǎng)。

84消毒液和二氯異氰脲酸鈉粉雖殺滅效果較好，但均屬于含氯消毒劑，有刺激性氣味，有一定腐蝕性，會(huì)產(chǎn)生氯化消毒副產(chǎn)物，給氯化消毒帶來(lái)了挑戰(zhàn)和質(zhì)疑。隨著工藝技術(shù)發(fā)展，過(guò)硫酸氫鉀復(fù)合物進(jìn)入市場(chǎng)[13]。過(guò)硫酸氫鉀復(fù)合物粉對(duì)人畜共患的幾乎所有的細(xì)菌、真菌、病毒具有較好的殺滅作用。同時(shí)低毒，用途廣泛、安全、綠色環(huán)保完美結(jié)合，具有良好發(fā)展前景[14]。過(guò)硫酸氫鉀復(fù)合物是一種高效廣譜、可靠持久、安全環(huán)境友好型的復(fù)合消毒劑，且不受低溫、高溫、水的硬度和pH值影響[15]，可在多種場(chǎng)景和復(fù)雜環(huán)境中保證消毒的可靠性。衛(wèi)清寧（天津瑞普生物，過(guò)硫酸氫鉀復(fù)合物，有效氯不少于10%）屬于復(fù)合型含氯消毒劑，可快速滅活病毒，消毒效果穩(wěn)定，7 d長(zhǎng)效，安全環(huán)保，不腐蝕金屬和活體。并于近日獲天津衛(wèi)健委批準(zhǔn)，取得人用衛(wèi)消字號(hào)。也屬于國(guó)家衛(wèi)生健康委要求緊急上市的含氯消毒劑[16]。2020年2月12日，中國(guó)疾控中心消毒首席專(zhuān)家、環(huán)境所消毒中心張流波主任，在《新聞1+1》關(guān)于冠狀病毒如何消毒的直播訪談中，推薦使用季銨鹽類(lèi)消毒藥用于新型冠狀病毒進(jìn)行消毒，又安全，又可靠。安立消（天津瑞普生物）主要成分為10%月芐三甲氯銨，屬于季銨鹽類(lèi)消毒劑，季銨鹽類(lèi)消毒劑的特點(diǎn)是對(duì)皮膚黏膜無(wú)刺激，毒性小，穩(wěn)定性好，對(duì)消毒物品無(wú)損害等[17]，在本研究中也證實(shí)其消殺冠狀病毒效果較好。

本研究建立的雞胚法消毒評(píng)估模型，以雞傳染性支氣管炎為指示性病毒，該病毒操作時(shí)安全，雞胚也易于獲得，評(píng)價(jià)成本低，通過(guò)RT-PCR的方法的確認(rèn)使得結(jié)果更加可信。雖然本研究得出的結(jié)果與國(guó)家衛(wèi)健委推薦的消毒劑一致，但本研究還需要進(jìn)一步與以標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)為參考做平行比對(duì)實(shí)驗(yàn)，以便為消毒劑評(píng)估提供更多的數(shù)據(jù)支撐，有利于公共衛(wèi)生事業(yè)的發(fā)展。