王一帆，吳圓圓，屈勇剛，于會舉，梁 晏，吳 勤，肖陳城，安 洋，吳敏瑞，趙崇祺，李 巖

（1.石河子大學(xué)動物科技學(xué)院，石河子 832003；2.石河子大學(xué)分析測試中心，石河子 832003；3.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)畜牧獸醫(yī)工作總站，烏魯木齊 830063）

近年來，我國奶牛存欄數(shù)不斷發(fā)展，居世界第三位。隨著奶牛飼養(yǎng)環(huán)境、飼養(yǎng)方式和飼料成分改變，致使奶牛乳房炎（bovine mastitis）發(fā)病率日趨增長，高達(dá)40%左右[1]。目前，奶牛乳房炎的治療難度越來越大，病原菌的耐藥性日趨嚴(yán)峻。據(jù)調(diào)查我區(qū)奶牛乳房炎的治療成本逐年增高，奶牛乳房炎已經(jīng)成為困擾我區(qū)奶業(yè)經(jīng)濟(jì)效益及其發(fā)展的主要原因之一。金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是引起奶牛乳房炎最主要的病原菌之一，由其引起的乳房炎占50%以上。據(jù)楊峰等[2]報道，世界范圍內(nèi)對金黃色葡萄球菌性奶牛乳房炎的研究熱點時期是從1995年到2012年，研究熱點大致歸類于病原菌的分離鑒定、藥物敏感性檢測和致病機(jī)理的研究。期間該領(lǐng)域的發(fā)文量自1995年至2012年急速上升，直到2013年起發(fā)文量才有下滑趨勢。未來一段時間該領(lǐng)域的主要研究可能是金黃色葡萄球菌生物被膜及其噬菌體的相關(guān)研究。目前缺少有效的疫苗用于金黃色葡萄球菌感染引起的乳房炎，且抗生素在治療金黃色葡萄球菌乳房炎時的治愈率往往低于15%。此外，由于抗生素的濫用、細(xì)菌基因突變，以及耐藥質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子或整合子在細(xì)菌間的傳遞使得金黃色葡萄球菌對多種藥物產(chǎn)生抗性[3]，如青霉素類、頭孢類、氨基糖苷類、四環(huán)素類、頭孢類等，導(dǎo)致病原菌對有效的藥物產(chǎn)生了耐藥性，給奶牛乳房炎的治療帶來巨大的挑戰(zhàn)。張倩等[4]研究發(fā)現(xiàn)，致奶牛乳房炎金黃色葡萄球菌對阿莫西林、桿菌肽、復(fù)方新諾明的耐藥率均在80%以上。

因此，新型藥物的研究十分迫切，采用噬菌體及其制劑防治奶牛乳房炎，無殘留、副作用小，且不影響牛乳品質(zhì)，相關(guān)研究在國外已經(jīng)倍受青睞[5-8]。國內(nèi)的楊毓[9]在應(yīng)用噬菌體治療金黃色葡萄球菌感染的奶牛乳房炎；吉林大學(xué)韓文瑜課題組應(yīng)用噬菌體與其裂解酶來治療奶牛乳房炎[10-11]，乳腺內(nèi)的菌含量得到了顯著下降，均取得了良好的治療效果。本研究以奶牛乳房炎金黃色葡萄球菌為宿主菌，分離篩選出1株裂解性短尾噬菌體，并初步分析了其生物學(xué)特性，為其在奶牛乳房炎的防治及其制劑的研發(fā)應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集 采集石河子周邊地區(qū)奶牛場擠奶廳污水和糞尿混合樣品，共8份，將其作為分離噬菌體的來源。

1.2 菌株來源 11株金黃色葡萄球菌（編號為1-11）均為石河子大學(xué)動物科技學(xué)院傳染病實驗室分離鑒定并于-20℃下所保存的奶牛乳房炎源菌株。

1.3 宿主菌的準(zhǔn)備 將11株金黃色葡萄球菌分別接種到裝有LB液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，于37℃、160 rpm搖床中進(jìn)行過夜培養(yǎng)。

1.4 噬菌體的富集 將采集的污水和糞尿混合樣品充分?jǐn)嚢杈鶆蚝?，?層紗布過濾后再用2層濾紙過濾，用0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，最終得到混合物液體1 L。將濾液接種到LB液體培養(yǎng)基里面，加入11株金黃色葡萄球菌的菌懸液各1 mL，于37℃、160 rpm搖床中培養(yǎng)5 h，放置4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 噬菌體的分離和篩選 將放置于-4℃冰箱保存的噬菌體原液在1000×g下離心10 min，取100 μL上清液分別加入到11支試管中，在每個試管中分別加入11株金黃色葡萄球菌的菌懸液各100 μL，充分混勻后靜置15 min，使噬菌體和宿主菌充分吸附。采用雙層瓊脂平板法進(jìn)行過夜培養(yǎng)，觀察平板生長情況。先選取出現(xiàn)噬菌斑所對應(yīng)的宿主菌接種到5 mL的LB液體培養(yǎng)基中，于37℃、160 rpm搖床中培養(yǎng)8 h，后在噬菌斑出現(xiàn)的的平板中挑取1個邊緣整齊光滑、形狀較大、色澤較為透亮的噬菌斑接種到相應(yīng)的宿主菌培養(yǎng)液中，恒溫?fù)u床中培養(yǎng)3 h后，取10倍倍比稀釋的上清液稀釋液與宿主菌混勻吸附后，采用雙層瓊脂平板法培養(yǎng)，重復(fù)3次以上，直至在同一個平板內(nèi)的噬菌斑形態(tài)大小基本一致，即能得到純的噬菌體。

1.6 噬菌體的電鏡觀察 參考文獻(xiàn)[12]，應(yīng)用PEG沉淀法進(jìn)行噬菌體顆粒的濃縮，取噬菌體濃縮懸液20 μL滴在銅網(wǎng)上，讓其作用15 min，然后用濾紙吸去多余的液體，選用2%磷鎢酸染液染色10 min，干燥后電鏡下觀察噬菌體形態(tài)。

1.7 噬菌體的基因型鑒定 使用病毒基因DNA/RNA提取試劑盒提取噬菌體的基因組，將提取的噬菌體核酸分別用DNase I、RNase A和Mung Bean Nuclease于37℃水浴中，酶解2 h后，用0.8%的瓊脂糖進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.8 噬菌體的生物學(xué)特性

1.8.1 噬菌斑大小 采用雙層瓊脂平板法觀察噬菌斑形態(tài)特征并測量噬菌斑的直徑。

1.8.2 效價測定 將純化后的單個噬菌斑與100 μL對數(shù)期宿主菌懸液，震蕩培養(yǎng)液體至澄清時，取上清液作10倍連續(xù)稀釋后，分別在噬菌體每個稀釋度中取100 μL，加入到100 μL相應(yīng)宿主菌增菌液中，然后采用雙層瓊脂平板培養(yǎng)，計算形成噬斑的個數(shù)。每組重復(fù)3次，最后在計算效價時取其平均值。在計算的時候，選取30～300個噬菌斑的平板計算每毫升未稀釋的原液的噬菌體數(shù)（噬菌體效價）。噬菌體的滴度（PFU/mL）=密度適當(dāng)?shù)钠桨迳鲜砂邤?shù)的平均數(shù)×稀釋倍數(shù)×10。

1.8.3 最佳感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection, MOI）測定 在宿主菌數(shù)量體積不變的條件下，按照不同的 MOI（100、10、1、0.1、0.01、0.001、0.0001）加入相應(yīng)數(shù)量體積的噬菌體液，加入液體培養(yǎng)基調(diào)整每管總體積使其相同，于37℃條件下、160 rpm搖床中培養(yǎng)3 h，后采用雙層瓊脂平板法測其每個MOI的效價，最佳感染復(fù)數(shù)即為產(chǎn)生最高噬菌體效價的MOI。

1.8.4 噬菌譜 將100 μL噬菌體液分別與100 μL的12株大腸桿菌、11株金黃色葡萄球菌混合吸附，測定噬菌體對菌株的裂解能力。

1.8.5 熱穩(wěn)定性 將已知滴度的噬菌體液等體積分裝若干，分別至40℃、45℃、50℃、55℃和60℃的恒溫水浴中，每間隔10 min取樣一次，取6次，用雙層瓊脂平板法測定存活的噬菌體的數(shù)量，重復(fù)3次。觀察噬菌體生長情況，制作噬菌體熱穩(wěn)性曲線。

1.8.6 pH穩(wěn)定性 分別取不同（pH2.0～12.0）的液體培養(yǎng)基37℃水浴，待溫度平衡后加入已知等體積噬菌體液，經(jīng)1 h處理后，再用雙層瓊脂平板法進(jìn)行計數(shù)。制作pH穩(wěn)定性曲線。

1.8.7 一步生長曲線 將對數(shù)期生長的金黃色葡萄球菌與噬菌體按照最佳感染復(fù)數(shù)MOI=0.001比例混合、吸附，于37℃、160 rpm搖床中培養(yǎng)，分別在第5、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、110、130、150、170、190、210 min取樣（3個平行樣品），測定噬菌體滴度，并取平均值，繪制噬菌體的一步生長曲線。

2 結(jié)果

2.1 噬菌體的分離、純化 通過污水和糞尿混合樣品濃縮和噬菌體富集處理后，分離到1株裂解性金黃色葡萄球菌噬菌體，通過雙層瓊脂平板法對其進(jìn)行3次以上純化，得到噬菌斑邊緣整齊光滑、大小均一、形態(tài)一致、色澤較為透亮的純化噬菌體（圖1），將其命名為P42。

圖1 噬菌體P42的噬菌斑形態(tài)Fig.1 The plaque of phage P42

2.2 噬菌體P42的電鏡觀察 純化后的噬菌體濃縮液經(jīng)負(fù)染后，在透射電子顯微鏡下觀察其形態(tài)，如圖2所示，噬菌體P42頭部呈廿面體的立體對稱，頭部長約42.67 nm，尾長約16.67 nm。根據(jù)2011年國際病毒分類委員會第9次報告提出的噬菌體分類與命名標(biāo)準(zhǔn)，該噬菌體符合有尾噬菌體目（Caudovirales），短尾噬菌體科（Podoviridae）的特征。

圖2 噬菌體P42的電鏡照片F(xiàn)ig.2 Electron microgragh of phage P42

2.3 噬菌體P42的核酸鑒定 噬菌體P42的基因經(jīng)DNase I、RNase A和Mung Bean Nuclease消化處理后，對其產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，由圖3可知，DNase I可消化噬菌體的遺傳物質(zhì)，而RNase A和Mung Bean Nuclease不能將其消化，可以判定噬菌體P42的遺傳物質(zhì)為dsDNA。

圖3 噬菌體P42的核酸類型Fig.3 Nucleic acid type of phage P42

2.4 噬菌體P42的生物學(xué)特性

2.4.1 噬菌體P42的效價測定 將純化后的噬菌體作10倍連續(xù)稀釋后，通過雙層瓊脂平板法，計算噬菌斑的個數(shù)，經(jīng)過多次平行重復(fù)試驗后，可得出本試驗分離純化的P42效價為3.01×109PFU/mL。

2.4.2 噬菌體P42的最佳MOI測定 當(dāng)MOI=0.001時，噬菌體P42感染宿主菌釋放的子代噬菌體的數(shù)量最多，因此，確定其最佳感染復(fù)數(shù)為0.001。測定結(jié)果見圖4。

圖4 噬菌體P42的最佳MOI測定Fig.4 Determination of optimal multiplicity of infection for phage P42

2.4.3 噬菌體P42裂解譜的測定 裂解譜的測定結(jié)果見表1。由表1可知，此噬菌體目前只能裂解其宿主菌，而對其他10株大腸桿菌型菌株、10株金黃色葡萄球菌均無裂解能力。

表1 噬菌體P42對21株臨床分離株裂解情況Table 1 The host range of phage p42 to 21 strains of clinical isolates

2.4.4 噬菌體P42的熱穩(wěn)定性測定 通過測定噬菌P42對溫度的耐受，可看出其在45℃時，活性基本不受影響。當(dāng)溫度高于50℃時，滴度開始下降但不明顯；當(dāng)溫度高于55℃時，滴度明顯下降；當(dāng)溫度高于60℃時，噬菌體P42失去活性，結(jié)果見圖5。

圖5 噬菌體P42的熱穩(wěn)定性測定Fig.5 Determination of thermal stability of phage P42

2.4.5 噬菌體P42的pH穩(wěn)定性測定 測定結(jié)果如圖6所示。噬菌體P42的pH耐受范圍為4.0～9.0，且當(dāng)pH為7.0時噬菌體活性最好。當(dāng)pH在2.0和12.0時噬菌體失去活性，表明其不耐強(qiáng)酸強(qiáng)堿。

圖6 噬菌體P42的pH穩(wěn)定性測定Fig.6 Determination of pH stability of phage P42

2.4.6 噬菌體P42的一步生長曲線測定 依照實驗數(shù)據(jù)繪制噬菌體P42的一步生長曲線，如圖7所示。噬菌體P42的潛伏期為10 min，這段時間噬菌體的量基本沒有增加；暴發(fā)期為140 min，在感染后10～150 min噬菌體的量大幅度增加，隨后進(jìn)入平穩(wěn)期。其裂解量約為126 PFU/cell，說明噬菌體P42有很強(qiáng)的裂解活性，可為奶牛乳房炎的噬菌體生物制劑研發(fā)提供材料。

圖7 噬菌體P42的一步生長曲線Fig.7 One step growth curve of phage P42

3 討論

本研究分離到的噬菌體P42是一株短尾科的裂解性金黃色葡萄球菌噬菌體，目前只能裂解其宿主菌，其效價為3.01×109PFU/mL，最佳MOI=0.001，在pH4.0～9.0時，P42的活性沒有明顯的變化，繁殖迅速，感染宿主菌的潛伏期是10 min，暴發(fā)期是140 min，裂解量約為126 PFU/cell。

本試驗采用雙層瓊脂平板方法進(jìn)行噬菌體P42的分離、純化與計數(shù)。根據(jù)《國際病毒分類委員會第9次報告》將噬菌體P42歸類為最常見的dsDNA病毒群的成員，且通過電鏡觀察得知該噬菌體屬有尾噬菌體目短尾噬菌體科的一員。目前在研究噬菌體的裂解譜當(dāng)中，發(fā)現(xiàn)噬菌體P42只裂解其宿主菌，對本試驗的10株大腸桿菌型菌株及10株金黃色葡萄球菌均無裂解能力。在目前研究中雖然其宿主譜較窄，但其宿主菌在新疆患有乳房炎奶牛樣本中較為常見，分布范圍較廣。對于該株噬菌體的全基因組分析以及其是否能裂解其他菌屬需要在后期的試驗中進(jìn)行驗證。

通過對噬菌體P42與其宿主菌之間MOI的測定知該噬菌體的最佳MOI=0.001，與范錦戴等[13-14]分離的葡萄球菌噬菌體相比，噬菌體P42對其宿主菌的感染率高。通過研究該噬菌體的一步生長曲線得知，該噬菌體比王倩等[15]和鞠磊等[16]分離報道的噬菌體有著短潛伏期、長暴發(fā)期及高裂解量的優(yōu)點。該噬菌體與湯婷婷等[17]分離到的短尾科裂解性金黃色葡萄球菌噬菌體相比，耐堿能力弱。噬菌體P42是裂解性金黃色葡萄球菌噬菌體中少見的短尾科噬菌體，為建立奶牛乳房炎用噬菌體庫奠定基礎(chǔ)，很有可能為金黃色葡萄球菌性奶牛乳房炎的防治和治療提供一種新的途徑，本研究為其在臨床上的應(yīng)用及后續(xù)的研究奠定了基礎(chǔ)。