韓文龍，張雪梅,2，王小蘭，于圣青

（1.中國農(nóng)業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241；2.安徽農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，安徽 230036）

鴨疫里默氏桿菌（Riemerella anatipestifer, RA）病是家禽中主要的細菌性傳染病之一，主要癥狀是以纖維素性心包炎、肝周炎、氣囊炎和干酪性輸卵管炎為特征的傳染性敗血癥。除感染鴨外，RA還可以感染雞、火雞、鵝及其他禽類[1]。本病對1～8周齡的鴨易感，感染RA的病鴨精神沉郁，綠色腹瀉，眼睛和鼻子有漿液性分泌物，部分呈現(xiàn)神經(jīng)癥狀，死亡率高，且該病治療成本高，對養(yǎng)鴨業(yè)造成較大的經(jīng)濟損失。鴨疫里默氏桿菌的血清型眾多而復雜，至今不同國家已報道了21種血清型[2-4]，其中血清1、2、6、10型是國內主要流行血清型[5-6]，且血清型間缺乏交叉保護，給鴨疫里默氏桿菌病的診斷與防控造成極大的困難。

OmpA蛋白家族是革蘭氏陰性菌外膜蛋白中的一個保守的且最為豐富的結構蛋白，具有很強的免疫原性和反應原性，并且不同血清型RA的ompA基因具有較高的同源性，它的這一特性具有極高的研究價值，Hu等[7]以血清2型RA為基礎構建OmpA缺失株Th4△OmpA，發(fā)現(xiàn)缺失株的毒力顯著下降，血液載菌量顯著低于野生株，證明OmpA是RA的毒力因子之一。本研究通過雜交瘤技術，成功制備3株能夠穩(wěn)定分泌抗RA OmpA單克隆抗體的雜交瘤細胞株，為進一步研制RA快速診斷試劑盒奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 菌株、實驗動物及細胞株 RA血清1型分離株CH3、RA血清2型分離株NJ3、RA血清10型分離株HXb2[8]，大腸桿菌血清型O78菌株E937，大腸桿菌血清型O2菌株DE719，大腸桿菌血清型O1菌株APEC01[9]，均為本實驗室保存菌株。雞白痢菌株CVCC519，禽傷寒菌株CVCC 3384，巴氏桿菌株CVCC 493均購自中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心；骨髓瘤細胞（SP2/0）購自中國科學院細胞庫；BALB/c小鼠購自上海杰思捷實驗動物有限公司；鴨疫里默氏桿菌OmpA蛋白[10]保存于本實驗室。

1.2 主要試劑及儀器 蛋白電泳儀、蛋白轉印槽、細胞計數(shù)儀均購自Bio-Rad公司；二氧化碳培養(yǎng)箱、液氮罐均購自Thermo Fisher公司；生物安全柜購自美國LABCONCO公司；倒置顯微鏡購自Leica公司；超低溫冰箱購自美國Nuair公司。小鼠單克隆抗體分型試劑盒SBA ClonotypingTMSystem/HRP 購自Southern Biotech公司；蛋白質分子量標準購自Thermo Fisher公司；胎牛血清、青鏈霉素雙抗購自Gibco公司；PRMI 1640購自Hyclone公司；HRP標記的羊抗鼠IgG抗體購自Abcam公司；

1.3 動物免疫 將純化后的OmpA蛋白與完全弗氏佐劑1∶1混合，經(jīng)乳化器充分乳化，以100 μg的免疫劑量皮下多點免疫注射8周齡雌性BALB/c鼠，每隔兩周，相同的免疫劑量，進行第二次和第三次加強免疫，第二、三次免疫用不完全弗氏佐劑乳化。第三次加強免疫后兩周，眼眶后靜脈叢采血并分離血清，間接ELISA法檢測血清效價。選效價最高的小鼠第四次加強免疫，免疫原劑量是初次免疫的二倍且不使用免疫佐劑，72 h內進行細胞融合。

1.4 細胞融合、亞克隆及穩(wěn)定性檢測 將1×108個脾臟細胞與2.5×107個骨髓瘤細胞SP2/0混合，以pH8.0的50%PEG為融合劑，分裝至96孔細胞培養(yǎng)板，每孔0.10～0.15 mL，然后37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)。5 d后用HAT培養(yǎng)基換出一半培養(yǎng)基，7 d后更換HT培養(yǎng)基，觀察雜交瘤細胞生長情況，待其生長至孔底面積的10%以上時，取細胞培養(yǎng)上清液測定抗體效價。以OmpA蛋白為包被抗原（1 μg/孔），以HRP標記的羊抗鼠IgG+IgM（H+L）作二抗，健康鼠血清作為陰性對照，根據(jù)抗體效價篩選出陽性反應的雜交瘤細胞。分泌特異性單克隆抗體的雜交瘤細胞使用有限稀釋法亞克隆至陽性單克隆100%。將雜交瘤細胞傳代培養(yǎng)10代，用間接ELISA法檢測細胞上清液抗體水平，鑒定雜交瘤細胞分泌抗體的穩(wěn)定性。

1.5 腹水制備及效價檢測 BALB/c小鼠飼養(yǎng)至8周齡，腹腔注射滅菌液體石蠟致敏，0.3 mL/只。飼養(yǎng)一周后，將培養(yǎng)狀態(tài)良好的雜交瘤細胞用RPMI 1640洗滌3次，計數(shù)后每只腹腔注射0.2 mL（1×106cell）。5 d后每日觀察小鼠狀態(tài)，若腹部明顯膨大，用滅菌的16號針頭收取腹水，收集的腹水離心除去雜質。間接ELISA法[11]測定效價，以OmpA蛋白（1 μg/孔）作為包被抗原，以梯度稀釋的腹水作為一抗，以OmpA蛋白鼠抗血清作為陽性對照，以空白對照組鼠血清作為陰性對照，以HRP標記山羊抗鼠IgG作二抗。判定標準，小鼠腹水效價為實驗組OD450（P）與陰性對照組OD450（N）的比值（P/N）不小于2.1的最大稀釋倍數(shù)。

1.6 單克隆抗體亞型測定 根據(jù)小鼠單克隆抗體分型試劑盒SBA ClonotypingTMSystem/HRP說明書提供的方法，鑒定3株單克隆抗體的亞型。

1.7 單克隆抗體的特異性鑒定 按文獻報道 [12]進行檢測。RA血清1型CH3、RA血清2型NJ3、RA血清10型HXb2菌株、巴氏桿菌菌株CVCC 493，分別轉接TSA平板，將大腸桿菌血清型O78 E937、腸桿菌血清型O2 DE719、大腸桿菌血清型O1APEC01菌株、雞白痢菌株CVCC519、禽傷寒菌株CVCC 3384，分別轉接LB平板，培養(yǎng)至對數(shù)生長期，無菌PBS洗脫平板上的菌，4℃、6000 ×g離心5 min，重復洗滌3次，菌數(shù)調整至OD600為1.0，將菌液濃縮10倍，OmpA蛋白為陽性對照，誘導后大腸桿菌BL21全菌蛋白作為陰性對照，各取10 μL加入40 μL的5×loading-buffer，煮沸20 min，得到蛋白電泳樣品。加樣孔中加入等量的蛋白樣品，恒壓80 V直至loading-buffer泳至膠片底部，恒壓120 V直至結束，轉印到硝酸纖維素膜（NC膜），5%脫脂乳PBS封閉轉印后的NC膜，將腹水1∶5000稀釋作為一抗，將HRP標記羊抗鼠IgG抗體1∶20 000稀釋作為二抗，檢測單克隆抗體的特異性。玻片凝集法檢測按文獻[12]進行，取RA血清1型CH3、RA血清2型NJ3、RA血清10型HXb2、大腸桿菌血清型O78 E937、大腸桿菌血清型O2 DE719、大腸桿菌血清型O1 APEC01、雞白痢菌株CVCC519、禽傷寒菌株CVCC 3384、巴氏桿菌株CVCC 493的單個菌落作為診斷抗原，均勻涂布于5 μL單克隆抗體2D5、2A6或4H8腹水中，2 min內觀察凝集反應結果檢測單克隆抗體的特異性。

1.8 單克隆抗體的染色體分析 采用秋水仙素法[13]進行單克隆抗體染色體分析，當細胞生長至孔底面積85%時，用0.2 μg/mL秋水仙素的1640培養(yǎng)基分別處理雜交瘤細胞，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱恒溫培養(yǎng)6 h，無菌PBS洗脫細胞，1000 ×g離心5 min棄上清液；用預熱37℃的0.075 mol/L KCl溶液重懸細胞，37℃水浴15 min；加入新配置的固定液（甲醇：乙酸=3:1（V/V））混勻，1000 ×g離心5 min后棄上清液，用固定液重懸細胞，室溫靜置25 min，1000×g離心5 min后棄上清液，重復一次，加入適量固定液，4℃密閉靜置過夜，1000 ×g離心5 min棄上清液，加入1 mL固定液重懸；固定好的細胞滴加至載玻片（冰水預處理），鋪平，自然晾干，火焰固定；10×100倍鏡下觀察染色體數(shù)目。選擇分散、無重疊、無缺失的染色體進行觀察，每個雜交瘤細胞計數(shù)100個中期核細胞，算出雜交瘤細胞的染色體數(shù)目。

2 結果

2.1 單克隆抗體細胞株的建立及穩(wěn)定性檢測 OmpA超免后的小鼠脾臟細胞與骨髓瘤細胞SP2/0融合，經(jīng)間接ELISA法篩選出陽性融合細胞，成功融合的雜交瘤細胞經(jīng)3次亞克隆后獲得3株雜交瘤細胞，命名為2D5、2A6、4H8。圖1可以看出1-10代2D5、2A6、4H8細胞上清液效價基本一致，說明這3株雜交瘤細胞均能夠穩(wěn)定分泌抗體。

圖1 3株雜交瘤細胞穩(wěn)定性Fig.1 Cell stability of three hybridomas

2.2 單克隆抗體效價檢測 用間接ELISA方法檢測單克隆抗體腹水效價，2D5、2A6、4H8腹水的效價均為1∶2 048 000。

2.3 單克隆抗體亞型測定 利用小鼠單克隆抗體分型試劑盒SBA ClonotypingTMSystem/HRP，按說明書進行檢測，抗RA OmpA 單克隆抗體2D5、2A6和4H8均為IgG2a亞型。

2.4 單克隆抗體的特異性鑒定 由Western blot結果可知，3株腹水均與OmpA蛋白特異性反應，與誘導后BL21全菌蛋白無反應，與RA株CH3、NJ3、HXb2特異性反應，與沙門菌、大腸桿菌及巴氏桿菌不反應（圖2），表明研制的3株單克隆抗體具有很強的種屬特異性。由玻片凝集結果可知，3株腹水均與RA株CH3、NJ3和HXb2發(fā)生特異性反應，與沙門菌、大腸桿菌及巴氏桿菌不反應（圖3），同樣表明研制的3株單克隆抗體具有很強的種屬特異性。

圖2 Western blot檢測單克隆抗體的特異性結果Fig.2 Western blot of the specificity of monoclonal antibodies

圖3 單克隆抗體玻片凝集結果Fig.3 The slide agglutination of monoclonal antibodies

2.5 單克隆抗體的染色體分析 通過顯微鏡觀察，細胞染色體形態(tài)一致，分布均勻，圖4所示，雜交瘤細胞100倍鏡下染色體的分布，每個雜交瘤細胞計數(shù)100個，雜交瘤細胞2D5的平均染色體對數(shù)是78；雜交瘤細胞2A6的平均染色體對數(shù)是84；雜交瘤細胞4H8的平均染色體對數(shù)是85，說明鼠骨髓瘤細胞與小鼠B細胞融合成功，成功得到這3株單克隆抗體。

圖4 雜交瘤細胞染色體分析Fig.4 Chromosome analysis of hybrid tumor cells

3 討論

1975年英國科學家Kohler和Milstein建立單克隆抗體技術，因此獲得了1984年諾貝爾獎。單克隆抗體（monoclonal antibody）技術利用B細胞產(chǎn)生特異性抗體的和骨髓瘤細胞能無限增值的能力，融合劑的作用下二者結合，得到既能分泌特異性抗體又具有無限增殖能力的雜交瘤細胞，并以此產(chǎn)生特異性抗體的技術。單克隆抗體具有特異性強、多樣性、效價高、定向性結合、交叉反應少等特點；此外，單克隆抗體不需要免疫動物，在體外能夠快速、大批量生產(chǎn)。隨著單克隆技術的不斷改進和發(fā)展，單克隆抗體技術在很多科學領域得到廣泛應用，尤其在疫病診斷方面，Hou等[14]利用抗RA GroEL的單克隆抗體（1G2F10）標記在膠體金顆粒上作為金標抗體，建立一種診斷RA的免疫膠體金檢測試紙條。Yu等[15]利用單克隆抗體A12D3作為金標抗體，制備一種免疫膠體金快速檢測試紙條，用于診斷鴨坦布蘇病毒。Ma等[16]利用重組蛋白E2和過氧化物酶標記的單克隆抗體（mAb G5），建立了一種競爭的化學發(fā)光免疫分析法，用于快速準確地檢測豬血清中E2特異性抗體。

本研究以OmpA蛋白為免疫原免疫小鼠，將免疫小鼠脾臟細胞和骨髓瘤細胞融合后獲得3株抗RA OmpA的單克隆抗體，命名為2D5、2A6、4H8。Western blot結果表明3株單克隆抗體均與RA血清1、2、10型菌株發(fā)生特異性反應，而與其他禽類致病菌（雞白痢、禽傷寒、禽巴氏桿菌，大腸桿菌）無反應性，表明3株單克隆抗體均具有RA特異性。單克隆抗體亞類分析結果表明，3株雜交瘤細胞分泌的單克隆抗體均為IgG2a亞類。病原進入宿主后，血液中主要的抗體成分是IgG，占血液總量的75%，具有ADCC及吞噬增強作用[17]，可用于疾病的早期診斷及致病機理的研究，對鴨疫里默氏桿菌病的診斷和防治具有深遠意義。

OmpA蛋白家族是革蘭氏陰性菌外膜蛋白中的一個最為豐富的結構蛋白，是決定細菌致病性的重要因素，具有很強的免疫原性和反應原性，不同來源的ompA基因具有較高的同源性，它的這一特性具有極高的研究價值[7]。本研究結果表明，3株單克隆抗體與RA的OmpA蛋白區(qū)域出現(xiàn)陽性反應條帶，表明制備的3株單克隆抗體是RA的OmpA抗原表位，具有RA特異性。玻片凝集結果同樣證明，3株單克隆抗體的RA特異性，3株單克隆抗體均與RA血清1、2、10型菌株發(fā)生特異性反應，與其他禽類菌株無反應性，因此3株單克隆抗體均可以作為診斷RA的靶標。

目前，臨床上診斷RA的方法主要是經(jīng)典的細菌分離鑒定、血清學方法和分子生物學方法。細菌分離鑒定耗時長達幾日，繁瑣且工作量大；血清學方法不需要特殊的儀器且能夠短時間內完成檢測，但檢測的工作量大且靈敏度低；分子生物學診斷方法特異性強、靈敏性高，但需要精密的儀器、專業(yè)的操作人員，因此需要建立一種快速、靈敏、特異性強，能用于臨床的檢測方法。單克隆抗體憑借特異性強、靈敏度高、易于生產(chǎn)等特點，已經(jīng)應用于多種檢測試劑盒的研制，本研究制備的3株單克隆抗體效價高、特異性強，可用于RA快速診斷試劑盒的研制。