仝明薇，李承瑤，康 杰，楊 勇

（1.山西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，太原 030000；2.吉林大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 人獸共患病研究所，長(zhǎng)春 130062；3.山西醫(yī)科大學(xué)汾陽(yáng)學(xué)院科技中心，汾陽(yáng) 032200）

現(xiàn)代生活飲食習(xí)慣，尤其是長(zhǎng)期的高脂飲食（high fat diet，HFD），常導(dǎo)致肥胖等代謝疾病的出現(xiàn)[1]。當(dāng)今，肥胖發(fā)病率在全球仍持續(xù)上漲，且仍然是成人和兒童健康的重要危害之一[2]。2021年8月，衛(wèi)健委新聞發(fā)布會(huì)上，有專家表示，在我國(guó)成人肥胖率可超50%，而在17歲以下青少年，此數(shù)值可達(dá)30%。調(diào)整飲食結(jié)構(gòu)、運(yùn)動(dòng)[3]、藥物治療[4]及手術(shù)減肥[5]是目前干預(yù)治療肥胖的主要方法，但主觀因素較大，難以持之以恒或存在某些不確定性和風(fēng)險(xiǎn)。因此，探尋能夠有效防治肥胖的安全、長(zhǎng)效且副作用小的生物制劑將為肥胖防治提供一種新的策略，具有重要意義。

眾多流行病學(xué)分析和實(shí)驗(yàn)研究表明，蠕蟲(chóng)感染率和代謝綜合征發(fā)病率負(fù)性相關(guān)[6]，表明蠕蟲(chóng)可能具有防治代謝性疾病的潛能。2012 年，發(fā)表于Nature Medicine的研究表明，血吸蟲(chóng)糖蛋白及隨后被相繼報(bào)道的鉤蟲(chóng)、絲蟲(chóng)和多形螺旋線蟲(chóng)等寄生蟲(chóng)及其蟲(chóng)體抗原，都可以抑制高脂誘導(dǎo)的胰島素抵抗和肥胖等代謝紊亂[7-10]。以上研究也證明了，蠕蟲(chóng)具有防治代謝疾病的潛能。

旋毛蟲(chóng)（Trichinella.spp.）是一種寄生性蠕蟲(chóng)，其感染所致的旋毛蟲(chóng)病，人獸共患，危害嚴(yán)重[11-12]。那么旋毛蟲(chóng)是否可以像上述蠕蟲(chóng)一樣具有防治代謝性疾病的潛能，目前還未可知。因此，我們擬用HFD構(gòu)建肥胖小鼠模型，探查旋毛蟲(chóng)感染對(duì)模型小鼠的干預(yù)作用，并初步分析其作用機(jī)制，為防治代謝性疾病提供新策略，并可望為后續(xù)開(kāi)發(fā)寄生蟲(chóng)免疫調(diào)節(jié)分子作為新型生物制劑奠定理論基礎(chǔ)，具有重要的基礎(chǔ)和應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 飼料及主要試劑 基礎(chǔ)及高脂飼料購(gòu)于南通特洛菲飼料科技有限公司；油紅O染液購(gòu)于北京solarbio科技有限公司；TransScript?One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMixgu購(gòu)于北京TransGen Biotech股份有限公司。

1.2 動(dòng)物飲食及分組 30只，4周齡雄性C57BL/6J小鼠購(gòu)于長(zhǎng)春生物制品所。環(huán)境適應(yīng)7 d后，分為兩組：ND組，10 只，飼喂基礎(chǔ)飼料；HFD組，20 只，飼喂高脂飼料。

1.3 旋毛蟲(chóng)感染 旋毛蟲(chóng)保種及肌幼蟲(chóng)分離參考文獻(xiàn)[13]。小鼠飼喂4周后，HFD組小鼠口服感染250條肌肉蟲(chóng)期旋毛蟲(chóng)（HFD+inf 組，n=10），同時(shí)設(shè)立未感染對(duì)照，繼續(xù)飼喂8 周。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)如圖1A所示。

1.4 體重、肝重及脂肪重量 小鼠每周稱重，飼喂末期，禁食12 h，眼球取血，同時(shí)分離肝臟及附睪脂肪組織。參考文獻(xiàn)[14]，稱量肝臟及附睪脂肪濕重并計(jì)算相應(yīng)器官組織指數(shù)。

1.5 血清中脂類生化指標(biāo)檢測(cè) 將收集的血液于4℃、3500×g離心15 min，獲取血清，利用全自動(dòng)生化儀檢測(cè)血清總膽固醇（Total Cholesterol，TC）和甘油三酯Triglyceride（TG）的含量。

1.6 HE染色 新鮮獲取的肝臟及附睪脂肪組織，經(jīng)4%多聚甲醛固定，隨后常規(guī)脫水及二甲苯透明，常規(guī)石蠟包埋、切片及HE染色鏡下觀察各組織的病理學(xué)表現(xiàn)。

1.7 油紅O染色 厚度約為15 μm的肝臟冰凍切片，經(jīng)60%異丙醇固定后，用油紅O染液染色10～15 min，再經(jīng)60%異丙醇分色，蘇木素復(fù)染2 min后，分色、封片，鏡下觀察肝細(xì)胞內(nèi)的脂滴沉積程度。

1.8 脂肪組織中脂代謝相關(guān)基因檢測(cè) 參考說(shuō)明書(shū)操作，采用Trizol法提取附睪脂肪組織總RNA。隨即參考TransScript?One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix說(shuō)明書(shū)操作步驟，對(duì)總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。

利用表1中引物，參考相應(yīng)退火溫度，將上述所得的cDNA利用qRT-PCR方法，檢測(cè)相應(yīng)附睪脂肪組織中脂代謝基因的表達(dá)情況。

表 1 qRT-PCR檢測(cè)所需引物序列Table 1 Primer sequences of qRT-PCR detection

1.9 數(shù)據(jù)處理 利用GraphPad prism5.0軟件進(jìn)行結(jié)果分析，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜ 0.001。體重?cái)?shù)據(jù)分析中，ND與HFD組相比，#P＜0.05，##P＜0.01，###P＜ 0.001；HFD與HFD+inf組相比，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜ 0.001。

2 結(jié)果

2.1 旋毛蟲(chóng)干預(yù)對(duì)小鼠體重和表觀肥胖的作用 感染旋毛蟲(chóng)后，小鼠無(wú)運(yùn)動(dòng)障礙、呼吸困難、食欲減退、拉稀等臨床癥狀，與未感染組無(wú)明顯差別，與先前的報(bào)道一致[15]。解剖后發(fā)現(xiàn)，感染組小鼠腸道無(wú)明顯炎癥反應(yīng)。對(duì)小鼠膈肌壓片鏡檢查發(fā)現(xiàn)肌幼蟲(chóng)卷曲成團(tuán)，包囊完全形成，肌肉結(jié)構(gòu)與正常組相似，表明旋毛蟲(chóng)在小鼠體內(nèi)發(fā)育完全，成功建立感染。在此基礎(chǔ)上，我們進(jìn)一步分析旋毛蟲(chóng)感染對(duì)高脂誘導(dǎo)的肥胖的干預(yù)效果。

在實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)相比于對(duì)照組，HFD和HFD+inf組小鼠體重增長(zhǎng)速率較快（圖1B）。在高脂飼喂的第3周，ND與HFD兩組小鼠體重存在極顯著差異（P＜0.001），且差異性持續(xù)至實(shí)驗(yàn)?zāi)┢?。旋毛蟲(chóng)感染后2 周（即高脂飼喂第6周），與HFD組相比，HFD+inf組小鼠體重增長(zhǎng)開(kāi)始減緩，于感染后第5周（高脂飼喂9周），兩組小鼠體重增加存在極顯著差異（P＜0.01）（圖1C），直至感染后第7周（高脂飼喂11周），HFD+inf組比HFD組小鼠體重下降4.65%（P＜0.05）（圖1B），在實(shí)驗(yàn)?zāi)┢谝部捎^察到各組小鼠外觀肥胖度上的明顯差異（圖1D）。說(shuō)明，旋毛蟲(chóng)干預(yù)能夠緩解高脂飲食肥胖小鼠的體重增加。

圖 1 旋毛蟲(chóng)干預(yù)對(duì)小鼠體重的作用Fig.1 The effect of Trichinella spiralis on body weight in mice

2.2 旋毛蟲(chóng)干預(yù)對(duì)小鼠肝指數(shù)和附睪脂肪指數(shù)的作用HFD組小鼠肝重較ND組升高了1.19倍（P＜0.05），但肝指數(shù)卻顯著降低（P＜0.01），（圖2A、2B），或許是由于高脂飲食所致體重增加顯著高于肝重增加引起的。而與高脂組比，HFD+inf組肝重及肝指數(shù)雖無(wú)顯著性變化，但均呈下降趨勢(shì)，表明旋毛蟲(chóng)感染可以降低高脂飲食小鼠的肝臟脂肪堆積，具有減輕肥胖小鼠肝臟損傷的潛能。與ND組比，HFD組小鼠附睪脂肪的重量和脂肪指數(shù)都明顯增加（P＜0.001）（圖2C、2D），可能是因?yàn)楦咧嬍吃斐傻捏w內(nèi)白色脂肪堆積，而旋毛蟲(chóng)感染可以明顯降低高脂誘導(dǎo)的小鼠附睪脂肪的重量和相應(yīng)指數(shù)。機(jī)體脂肪過(guò)度累積被認(rèn)為是導(dǎo)致肥胖的關(guān)鍵元素之一[16]。因此，旋毛蟲(chóng)感染可以通過(guò)降低機(jī)體白色脂肪蓄積，減輕肝臟損傷，進(jìn)而緩解肥胖發(fā)生發(fā)展。

圖2 旋毛蟲(chóng)干預(yù)對(duì)小鼠肝臟指數(shù)和附睪脂肪指數(shù)的作用Fig.2 The effect of Trichinella spiralis on liver index and epididymal fat index in mice

2.3 旋毛蟲(chóng)干預(yù)對(duì)小鼠血脂水平的作用 HFD組血清TC和TG含量顯著升高（P＜0.01或P＜0.05），而旋毛蟲(chóng)干預(yù)后TC水平顯著降低（P＜0.05），TG水平也有減少趨勢(shì)，表明旋毛蟲(chóng)感染對(duì)高脂肥胖小鼠的血脂代謝紊亂具有某種程度的拮抗作用，見(jiàn)圖3。

圖3 旋毛蟲(chóng)干預(yù)對(duì)血清脂質(zhì)水平的作用Fig.3 The effect of Trichinella spiralis on the level of serum lipids in mice

2.4 附睪脂肪組織HE染色分析 慢性營(yíng)養(yǎng)過(guò)量常引起脂肪細(xì)胞不健康的擴(kuò)張。在我們的研究中也可見(jiàn)，HFD導(dǎo)致附睪脂肪細(xì)胞體積變大，而旋毛蟲(chóng)感染后HFD+inf組小鼠的附睪脂肪細(xì)胞體積有所下降（圖4），表明旋毛蟲(chóng)感染能夠拮抗HFD引起的脂肪組織中脂質(zhì)堆積，進(jìn)而調(diào)控肥胖。

圖4 附睪脂肪組織HE染色（200 x）Fig.4 Hematoxylin-eosin staining of epididymal fat (200 x)

2.5 肝臟組織油紅O染色分析 相比于ND組，HFD組肝組織中有大量紅色脂滴聚集，表明長(zhǎng)期高脂飲食會(huì)誘導(dǎo)肝臟損傷，出現(xiàn)脂肪變性病變特征。而HFD+inf組相比于HFD組，其肝臟組織中脂滴數(shù)量減少，大小有所下降，表明旋毛蟲(chóng)感染能夠緩解高脂誘導(dǎo)的肝臟脂質(zhì)聚集，降低肝臟脂質(zhì)變性的風(fēng)險(xiǎn)（圖5）。

圖5 肝臟油紅O染色（200 x）Fig.5 Oil-red staining of liver (200 x)

2.6 旋毛蟲(chóng)干預(yù)對(duì)附睪脂肪代謝相關(guān)基因表達(dá)的作用 機(jī)體脂肪過(guò)度累積導(dǎo)致肥胖，為了探查旋毛蟲(chóng)感染對(duì)肥胖小鼠脂肪代謝的干預(yù)作用，我們對(duì)旋毛蟲(chóng)干預(yù)末期，附睪脂肪中脂代謝基因表達(dá)變化情況進(jìn)行了調(diào)查。由圖6可見(jiàn)，相比于ND組，HFD組中參與脂質(zhì)合成的相關(guān)基因，脂肪酸合成酶（Fatty Acid Synthase, FAS）和過(guò)氧化物酶激活物受體γ（Peroxisome Proliferators-Activated Receptors-γ,PPAR-γ）mRNA的表達(dá)顯著升高（P＜0.01或P＜0.001），而在旋毛蟲(chóng)感染后又顯著降低（P＜0.01或P＜0.001）。

圖6 旋毛蟲(chóng)干預(yù)對(duì)附睪脂肪組織脂代謝相關(guān)基因表達(dá)水平的作用Fig.6 The effect of Trichinella spiralis infection on the expression levels of genes associated with lipid metabolism in mice

相反，相比于ND組，HFD組附睪脂肪組織中參與脂質(zhì)分解的相關(guān)基因，脂蛋白脂肪酶（Lipoprotein Lipase, LPL）、激素敏感性脂肪酶（Hormonesensitive Lipase, HSL）和過(guò)氧化物酶激活物受體α（Peroxisome Proliferators-Activated Receptors-α，PPAR-α）的表達(dá)顯著下降（P＜0.01），而在旋毛蟲(chóng)感染后LPL和HSL的表達(dá)明顯下降（P＜0.05），PPAR-α的表達(dá)也有增多趨勢(shì)，表明旋毛蟲(chóng)干預(yù)能夠促進(jìn)高脂肥胖小鼠的脂質(zhì)分解。

3 討論

肥胖及其并發(fā)癥是全球性社會(huì)公共健康的重要威脅，然而防治肥胖的方法非常有限。我們以HFD小鼠為模型，探查了旋毛蟲(chóng)感染對(duì)肥胖小鼠的干預(yù)作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，旋毛蟲(chóng)感染可以降低肥胖小鼠的體重增加，抑制小鼠血清中脂質(zhì)的升高和附睪脂肪的脂質(zhì)累積，并改善肝臟脂質(zhì)變性的癥狀。此外，旋毛蟲(chóng)感染可有效降低肥胖小鼠的肝臟質(zhì)量增加，改善肝臟脂質(zhì)變性的癥狀。

Kang等[17]發(fā)表了相似研究成果，但研究設(shè)計(jì)有所不同，他們?cè)谛∈蟾腥拘x(chóng)數(shù)周后再進(jìn)行高脂飼喂，進(jìn)而探究旋毛蟲(chóng)感染對(duì)肥胖小鼠的預(yù)防作用，并發(fā)現(xiàn)了與本研究一致的研究結(jié)果，進(jìn)一步說(shuō)明了旋毛蟲(chóng)感染對(duì)高脂飼喂誘導(dǎo)的小鼠體重增加具有一定的改善作用，對(duì)防治肥胖具有積極作用。

FAS和PPAR-γ是介導(dǎo)脂質(zhì)合成的重要酶或轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因。與先前的研究一致[17]，我們也發(fā)現(xiàn)，在高脂誘導(dǎo)的小鼠中，F(xiàn)AS和PPAR-γ mRNA的轉(zhuǎn)錄水平明顯下降，說(shuō)明旋毛蟲(chóng)感染可以降低高脂肥胖小鼠的脂肪酸合成速率，抑制脂肪合成。PPAR-γ除了調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝外，在免疫應(yīng)答調(diào)控中也占據(jù)重要地位。研究已表明，其可以通過(guò)抑制脂肪組織中的T淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)或誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞可替代極化從而改善高脂誘導(dǎo)小鼠的葡萄糖代謝平衡[18]。旋毛蟲(chóng)感染可以調(diào)節(jié)肥胖小鼠的葡糖代謝紊亂[17]，那么是否其可以以PPAR-γ為靶標(biāo)，調(diào)節(jié)機(jī)體免疫應(yīng)答來(lái)執(zhí)行這一功能需要更深入的調(diào)查。LPL、HSL和PPAR-α是調(diào)控脂肪酸分解代謝的關(guān)鍵酶或轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子[19-20]，在調(diào)節(jié)TG水解及脂肪酸氧化中占據(jù)著關(guān)鍵地位。我們研究發(fā)現(xiàn)，旋毛蟲(chóng)感染可以下調(diào)這些基因的表達(dá)，表明旋毛蟲(chóng)感染可以促進(jìn)白色脂肪組織的脂解。以上結(jié)果表明，旋毛蟲(chóng)可以通調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝有效干預(yù)肥胖，但具體的機(jī)制尚未闡明。

腸道蠕蟲(chóng)及其免疫調(diào)節(jié)分子可誘導(dǎo)Th2免疫反應(yīng)和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的表達(dá)，反向調(diào)節(jié)Th1/Th17免疫，這一典型特點(diǎn)可以有效的干預(yù)各種自身免疫性疾病，如IBD、關(guān)節(jié)炎、糖尿病等[21]。肥胖是一個(gè)促炎細(xì)胞因子表達(dá)明顯升高的慢性低度性炎癥，肥胖性炎癥反應(yīng)與代謝穩(wěn)態(tài)的破壞密切相關(guān)，因此被認(rèn)為是有效干預(yù)肥胖的重要靶點(diǎn)。研究表明IL-4能增加小鼠的能量消耗和脂肪分解，而阻斷TNF受體介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)可預(yù)防大鼠肥胖[22]。最近的研究發(fā)現(xiàn)，重組IL-27干預(yù)可明顯緩解肥胖小鼠體重增加[23]，表明其具有治療肥胖的潛力。在研究線蟲(chóng)感染對(duì)肥胖的干預(yù)作用時(shí)也發(fā)現(xiàn)，IL-13/stat6信號(hào)通路在巴西鉤蟲(chóng)抑制高脂誘導(dǎo)的體重增加中發(fā)揮著重要的作用[24]。那么，旋毛蟲(chóng)是否可以通過(guò)調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)影響宿主代謝平衡，從而改善高脂誘導(dǎo)的肥胖需要進(jìn)一步的研究。綜合以上結(jié)果表明，旋毛蟲(chóng)感染可以有效改善高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖，其可能是通過(guò)抑制機(jī)體脂質(zhì)累積和加速脂質(zhì)分解發(fā)揮作用，因此旋毛蟲(chóng)及其免疫調(diào)節(jié)分子可為防治肥胖及其它代謝紊亂相關(guān)疾病提供一種潛在途徑。需要指出的是，寄生蟲(chóng)治療方式也存在一些弊端，如患者對(duì)該對(duì)治療方案的心理負(fù)擔(dān)及出現(xiàn)胃腸不良反應(yīng)等。近年來(lái)蠕蟲(chóng)的免疫調(diào)節(jié)分子對(duì)免疫相關(guān)疾病的干預(yù)顯示出了良好的效果，其安全性與可控性方面均顯現(xiàn)優(yōu)勢(shì)。因此，蠕蟲(chóng)免疫調(diào)節(jié)分子的篩選與開(kāi)發(fā)利用是今后發(fā)展蠕蟲(chóng)有效干預(yù)代謝性疾病的核心方向。