孫 見

（1.威海海洋職業(yè)學(xué)院，榮成 264300；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，長春 132109）

豬繁殖與呼吸障礙綜合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是由豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）引起的一種以懷孕母豬繁殖障礙、流產(chǎn)、木乃伊胎和呼吸困難為主要特征的疾病，高致病性豬繁殖與呼吸障礙綜合征在我國已被列為一類動物疫病，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。弱毒疫苗的應(yīng)用在一定程度上控制了本病的流行，但由于病毒的不斷變異，給防控工作帶來了巨大的挑戰(zhàn)[1-2]。建立針對PRRSV抗體檢測的間接ELISA檢測方法，對于疫苗效力評價、種群進(jìn)化均有重要意義。N蛋白在病毒粒子中含量最高，且免疫原性較強(qiáng)，在對PRRSV抗體監(jiān)測中最早7即可監(jiān)測到N蛋白抗體并且持續(xù)存在半年之久[3-4]。因此，N蛋白可作為PRRSV抗體的檢測抗原，在對PRRSV抗體持續(xù)監(jiān)測中都有重要的診斷學(xué)意義[5]。本研究以化學(xué)合成的方法合成了三條針對N蛋白的多肽，從中篩選了一條最適多肽建立的間接ELISA方法，通過與商品化IDEXX-PRRSV-X3試劑盒的比較，其特異性和敏感性均較高，此方法的建立對豬群的種群凈化具有重要意義。

1 材料和方法

1.1 標(biāo)準(zhǔn)陽性血清及陰性血清 PRRSV陽性血清，用PRRSV 弱毒疫苗免疫16頭25日齡PRRS陰性豬一個月左右采集血清；PRRSV陰性血清50份，來自SPF豬場；豬偽狂犬、豬圓環(huán)、豬瘟、豬細(xì)小病毒陽性血清均由本實驗室保存。

1.2 主要試劑、耗材、設(shè)備 TMB、辣根過氧化酶（HRP）標(biāo)記的兔抗豬二抗購自Sigma，96孔可拆卸酶標(biāo)板購自美國Costar公司，酶標(biāo)儀為Bio-Rad公司產(chǎn)品，PRRSV抗體檢測試劑盒為美國IDEXX公司產(chǎn)品。

1.3 N蛋白抗原表位預(yù)測 主要涉及以下幾個參數(shù)：①親水性參數(shù)；②可及性參數(shù)；③極性參數(shù)；④柔韌性參數(shù)；⑤抗原性參數(shù)。采用DNA star預(yù)測軟件和在線預(yù)測（http://.expasy.org/cgi-bin/protscale.pl）相結(jié)合的方式對上述參數(shù)進(jìn)行預(yù)測。

1.4 合成多肽的篩選 對已經(jīng)合成的三條抗原表位多肽采用間接ELISA方法分別與PRRSV陰陽性血清（經(jīng)IDEXX鑒定）進(jìn)行反應(yīng)測定抗原表位多肽的反應(yīng)性和特異性。將合成的三條多肽分別進(jìn)行2000倍稀釋包被酶標(biāo)板，4℃過夜，甩干洗滌三次，加入100倍稀釋的PRRSV陰陽性血清100 μL/孔，37℃反應(yīng) 45 min，甩干洗滌三次，加入HRP標(biāo)記兔抗豬酶標(biāo)二抗100 μL/孔，37℃作用 45 min，甩干洗滌三次，加入TMB顯色液100 μL/孔，37℃避光顯色 15 min，加入2 mol/L H2SO450 μL/孔終止反應(yīng)，A（450 nm）讀數(shù)。

1.5 多肽工作濃度和血清最佳稀釋倍數(shù)的選擇 采用方陣滴定法測定多肽最佳包被量和血清最佳稀釋度。多肽稀釋至終濃度為0.3125、0.625、1.25、2.5、5.0和10.0 μg/mL，陰陽性血清分別稀釋至1∶50、1∶100、1∶200、1∶400，之后按常規(guī)方法進(jìn)行試驗，以P/N值最大時的多肽含量和血清稀釋倍數(shù)作為最佳多肽工作濃度和血清稀釋倍數(shù)。

1.6 其他試驗條件的優(yōu)化 在多肽工作濃度和血清稀釋倍數(shù)確定的基礎(chǔ)上,分別進(jìn)行多肽包被條件、封閉液、酶標(biāo)二抗工作濃度、血清、酶標(biāo)二抗、顯色液作用時間等優(yōu)化試驗，各項試驗均按常規(guī)方法設(shè)計。按P/N值最大，且陰性血清OD值較低的原則確定最佳作用條件。

1.7 PRRSV多肽間接ELISA檢測方法的建立 依據(jù)上述試驗所確定的最適條件，建立PRRSV多肽間接ELISA方法。

1.8 判定標(biāo)準(zhǔn)的建立 選取經(jīng)IDEXX試劑盒鑒定的陰性血清50份，用已優(yōu)化好的間接ELISA方法進(jìn)行檢測，計算S/P值，結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。

1.9 靈敏度試驗 利用已優(yōu)化好的的最佳條件，將PRRSV標(biāo)準(zhǔn)陽性血清以1∶400、1∶800、1∶1600、1∶3200、1∶6400稀釋測定OD值，計算S/P值，最大稀釋倍數(shù)仍為陽性即為該檢測方法的靈敏度。

1.10 特異性試驗 分別取豬瘟、豬流感、豬偽狂犬、豬圓環(huán)病毒的陽性血清，1∶200倍稀釋，用已優(yōu)化的ELISA方法進(jìn)行檢測，每份血清重復(fù)檢測3孔，同時設(shè)立陰陽性對照各1孔，以此來進(jìn)行交叉性檢測。

1.11 符合率試驗 選取PRRSV陽性血清20份，分別進(jìn)行102、103、104稀釋，利用Pep3-PRRSV ELISA和IDEXX-PRRSV ELISA進(jìn)行測定，計算符合率。

1.12 疫苗免疫后抗體動態(tài)監(jiān)測 用PRRSV弱毒疫苗免疫5頭PRRSV陰性豬，分別于第0、7、14、21～56 d采血分離血清測其抗體效價，并與IDEXX-PRRSV ELISA試劑盒的檢測結(jié)果進(jìn)行比對。

1.13 臨床樣品的檢測 對采自湖南的200份血清，按照已建立的間接ELISA方法進(jìn)行檢測。

2 結(jié)果

2.1 PRRSV N蛋白抗原表位預(yù)測結(jié)果 將各種預(yù)測方法預(yù)測的可能性抗原表位的肽段加以綜合，選出了三段B細(xì)胞抗原性表位最可能出現(xiàn)的區(qū)域（表1）。通過對多肽的親水性參數(shù)、可及性參數(shù)、極性參數(shù)、柔韌性參數(shù)綜合分析最終得出，Pep3抗原性指數(shù)最強(qiáng)，且通過對經(jīng)典毒株和高致病性毒株進(jìn)行綜合比對，該段序列保守性較高，適合作為優(yōu)選多肽進(jìn)行包被。

表1 B細(xì)胞表位預(yù)測結(jié)果Table 1 Prediction results of B cell epitope

2.2 最佳B細(xì)胞表位多肽的篩選 根據(jù)OD值可以看出（表2），多肽1、2盡管與陽性血清反應(yīng)的OD值較高，但是與陰性血清反應(yīng)的OD值也較高；多肽3雖然與陽性血清反應(yīng)的OD值較低，但是與陽性血清、陰性血清反應(yīng)的P/N值最大，并且本底值很低，可以最大程度的消除本底值，易于對最后的結(jié)果判定做出正確的計算，所以綜合分析應(yīng)該選取多肽3為最佳的B細(xì)胞表位，并利用該多肽進(jìn)行下面的試驗。

表2 最佳多肽的選擇Table 2 Selection of the optimal polypeptides

2.3 多肽最佳包被量和血清最佳稀釋度的選擇 當(dāng)多肽工作濃度為2.5 μg/mL，一抗待檢血清最佳稀釋倍數(shù)為1∶200時當(dāng)P/N值最大為6.147（表3）

表3 多肽包被量和一抗血清稀釋度的確定Table 3 Determination of polypeptide-coated amounts and primary antibody serum dilution

2.4 最佳酶標(biāo)二抗?jié)舛鹊拇_定 酶標(biāo)抗體1∶1000稀釋時，檢測的5份血清的P/N值顯示最大（表4），之后隨著酶標(biāo)二抗稀釋度的加大，P/N值也隨之變小，所以酶標(biāo)二抗選擇1∶1000稀釋。

表4 酶標(biāo)二抗工作濃度的確定Table4 Determination of the working concentration of enzyme-labeled secondary antibodies

2.5 Pep3-PRRSV間接ELISA檢測方法的建立 以2.5 μg/mL的合成肽（Pep3）包被酶標(biāo)板，4℃過夜，不需封閉，陰陽性血清分別稀釋200倍，37℃作用60 min，辣根過氧化酶（HRP）標(biāo)記兔抗豬酶標(biāo)二抗1000倍稀釋，37℃作用30 min，TMB37℃顯色15 min，2 mol/L H2SO4終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀A（450 nm）讀數(shù)。

2.6 臨界值的確定 用已建立的間接ELISA方法檢測50份陰性血清，計算S/P的平均值及標(biāo)準(zhǔn)差（表5）。S/P值=（樣品的OD450值-陰性對照OD450）/（陽性對照OD450-陰性對照OD450），求得均值X為-0.012，標(biāo)準(zhǔn)差SD為0.112，因此當(dāng)被檢樣品的S/P值≥S/P平均值（X）+3SD時，即S/P值≥0.324時，判為陽性；X+3SD＞樣品S/P值≥X+2SD時，即0.324＞樣品S/P值＞0.212判為可疑；當(dāng)樣品S/P值＜X+2SD，即S/P值≤0.212時，判為陰性。

表5 判定標(biāo)準(zhǔn)的建立Table5 Establishment of the determination criteria

2.7 靈敏度試驗結(jié)果 PRRSV標(biāo)準(zhǔn)陽性血清1∶3200倍稀釋時S/P值仍大于0.324（表6），說明該檢測方法有較好靈敏度。

表6 靈敏性試驗結(jié)果Table6 Results of the sensitivity test

2.8 特異性試驗結(jié)果 對于豬瘟、豬圓環(huán)、豬偽狂犬、豬細(xì)小等4種疾病的陽性血清按間接ELISA程序測定，S/P值均小于0.224，為陰性（表7）。結(jié)果表明，Pep3-PRRSV間接ELISA診斷方法具有較高的特異性。

表7 特異性試驗結(jié)果Table7 Results of the specific tests

2.9 符合率試驗結(jié)果 選取經(jīng)IDEXX和Pep3-ELISA檢測均為陽性的血清20份，分別進(jìn)行102、103、104稀釋，結(jié)果顯示（表8）：當(dāng)血清進(jìn)行100倍稀釋時，二者的符合率為100%；當(dāng)被檢血清稀釋至104倍稀釋時，符合率分別為89.9%和90%。

表8 符合率試驗結(jié)果Table8 Results of the sensitivity test

2.10 PRRSV抗體的動態(tài)監(jiān)測結(jié)果 PRRSV活疫苗免疫豬后，分別在第0、1、14、21-56 d采血分離血清，測其抗體效價（圖1），經(jīng)與IDEXX-PRRSVELISA試劑盒相比對，能比較正確的反應(yīng)抗體的消長規(guī)律，所不同的是：IDEXX試劑盒能在疫苗免疫后7 d檢測到PRRSV抗體，而Pep3-PRRSV ELISA檢測方法能在疫苗免疫后14 d檢測到PRRSV抗體，靈敏性稍差。

圖1 PRRSV抗體動態(tài)消長規(guī)律Fig.1 Dynamic length extinction pattern of PRRSV antibodies

2.11 臨床應(yīng)用結(jié)果 IDEXX-PRRSV試劑盒檢測出陽性樣品128份，建立的Pep3-PRRSV ELISA方法檢測出陽性血清117份，其中疑似樣品20份，建立的診斷方法與標(biāo)準(zhǔn)檢測試劑盒的符合率為91.4%（表9），說明建立的診斷方法與標(biāo)準(zhǔn)試劑盒的符合率較高；對送檢的湖南樣品IDEXX檢測陽性率為64%，Pep3-PRRSV ELISA檢測陽性率為58.5%，說明該養(yǎng)殖場中PRRSV感染率較高。

表9 臨床樣品檢測結(jié)果Table9 Test results of clinical samples

3 討論

PRRSV是威脅養(yǎng)豬業(yè)的嚴(yán)重疫病之一，目前尚無特效的治療藥物，控制該病主要是使用PRRSV活疫苗[6]。因而建立新型的更為科學(xué)和便捷的診斷方法是當(dāng)前有效防治PRRSV感染急需解決的問題[7]。ELISA技術(shù)具有操作簡便、敏感性高和特異性強(qiáng)、重復(fù)性好、價格低廉等特點，在各實驗室及基層單位已普遍應(yīng)用[8]。傳統(tǒng)的間接ELISA包被抗原主要分為全病毒和表達(dá)蛋白，以全病毒包被的優(yōu)點是抗原制備方法比較簡單，缺點是病毒的純化比較復(fù)雜，血清、細(xì)胞碎片往往難以清除干凈，而且存在散毒的危險；表達(dá)蛋白又分原核表達(dá)和真核表達(dá)，原核表達(dá)大多以變性的包涵體形式存在，空間結(jié)構(gòu)難以吻合，真核表達(dá)表達(dá)量低，后期的蛋白純化也比較繁瑣[9-12]。近年來，具有極大理論意義和應(yīng)用價值的多肽的研究引起了學(xué)者的關(guān)注。合成肽方法與上述方法相比沒有細(xì)胞等其他蛋白混雜,且相對分子質(zhì)量小,結(jié)構(gòu)簡單,避免了與其他病毒細(xì)菌抗體交叉反應(yīng)的可能,特異度更強(qiáng),靈敏度更高,且多膚抗原是水溶性化合物,無感染性,可包被酶標(biāo)板,使操作更省時、更方便以合成肽替代表達(dá)蛋白作為ELISA包被抗原，可以避免表達(dá)蛋白的純化等復(fù)雜問題，顯示出了它在免疫學(xué)等研究領(lǐng)域上的明顯優(yōu)勢[13]。

本研究在PRRSV分子流行病學(xué)的基礎(chǔ)上，依據(jù)病毒N蛋白在免疫學(xué)方面的特性[14]，利用化學(xué)合成的方法合成了針對PRRSV N蛋白的多肽，該多肽具有抗原性強(qiáng)、保守性高，比較穩(wěn)定等特點可以作為包被抗原建立檢測PRRSV抗體的間接ELISA方法，并對各項條件進(jìn)行了優(yōu)化，大大提高了檢測的靈敏性和特異性，為PRRSV的快速診斷、預(yù)防和控制蔓延提供了依據(jù)。

本研究所建立的Pep3間接ELISA方法，與4種常見的豬病毒病均無交叉反應(yīng)，說明特異性良好；標(biāo)準(zhǔn)陽性血清稀釋至3200倍時仍能檢測到說明靈敏度較高；與商品化的IDEXX試劑盒符合率為91.4%，且能很好的反應(yīng)PRRSV抗體的動態(tài)消長規(guī)律，但抗體檢出時間稍遲，或許因為該方法僅用了一條多肽進(jìn)行包被而并未進(jìn)行多肽的串聯(lián)包被，所以前期靈敏性較IDEXX要差，后期試圖尋求多肽的串聯(lián)進(jìn)行包被來提高檢測的靈敏度。Pep3-PRRSV ELISA利用化學(xué)合成的方法合成抗原，大大降低了生產(chǎn)成本，跟IDEXX試劑盒相比，具有顯著的價格優(yōu)勢，因而具有廣闊的應(yīng)用前景。