劉高遠，和愛玲，杜君，楊占平，潘秀燕，許紀東，鄭念，張玉亭*

（1.河南省農業(yè)科學院植物營養(yǎng)與資源環(huán)境研究所，鄭州 450002；2.遂平縣農業(yè)科學試驗站，河南 駐馬店 463100）

土壤生物學特性是評價土壤肥力的敏感性指標。其中，土壤酶和微生物是土壤生物學特性的重要組成部分，二者共同參與多種重要的生物化學過程，在養(yǎng)分轉化循環(huán)、有機質分解、污染物降解等方面發(fā)揮著關鍵作用[1]。秸稈中含有豐富的有機碳及營養(yǎng)元素，秸稈還田能夠激發(fā)土壤酶及微生物活性，進而促進秸稈降解及養(yǎng)分釋放[2]。因此，明確秸稈還田條件下土壤酶及微生物變化特征對構建良好的土壤微生態(tài)環(huán)境具有重要意義。

秸稈還田量是影響土壤酶及微生物活性的重要因素。WU 等[2]和ZHAO 等[3]的研究已證實，適宜的秸稈還田量能夠提高土壤酶活性、微生物生物量及微生物群落豐度。但受氣候、土壤類型的制約，不同生態(tài)區(qū)適宜秸稈還田量存在明顯的差異[4-7]。秸稈還田量不合理不僅直接影響土壤理化性質，而且也影響土壤酶及微生物活性水平。ZHAO 等[8]發(fā)現(xiàn)，玉米秸稈還田量為4 500 kg·hm-2和9 000 kg·hm-2時，顯著提高了土壤酶（β-葡萄糖苷酶、β-木糖苷酶等）活性、革蘭氏陰性細菌豐度及真菌豐度，但兩個還田量處理土壤酶活性及微生物群落豐度無顯著差異。高日平等[4]發(fā)現(xiàn)，玉米秸稈還田量3 000～12 000 kg·hm-2條件下，6 000 kg·hm-2處理顯著提高了土壤微生物（細菌、真菌及放線菌）數(shù)量及土壤酶（蔗糖酶、脲酶及過氧化氫酶）活性。此外，秸稈還田量過高還會造成下茬作物出苗率降低、病蟲害加重[9]、溫室氣體排放量增加[10]等生產及環(huán)境問題。

砂姜黑土是黃淮海平原重要的農耕土壤，具有肥力水平低、透水透氣性差等特性，屬于典型的中低產土壤類型。秸稈還田仍是該土壤類型區(qū)小麥-玉米輪作制度下最重要的土壤培肥措施之一。然而，在該土壤類型區(qū)，關于秸稈還田的研究多集中在土壤理化性質方面[7，11]，缺乏土壤生物學特性方面的研究，尤其是土壤養(yǎng)分、酶活性等環(huán)境因子與微生物之間的互作關系仍需要進一步研究。因此，本研究以黃淮海平原砂姜黑土區(qū)小麥-玉米輪作為例，研究不同玉米秸稈還田量對土壤酶活性、微生物生物量及細菌群落的影響，結合土壤養(yǎng)分狀況，分析土壤細菌群落組成與環(huán)境因子的關系，從生物學角度探討土壤適宜的玉米秸稈承載力，為該土壤類型區(qū)秸稈資源合理利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

試驗于2019—2021 年在河南省駐馬店市遂平縣農業(yè)科學試驗站（113°97′E，33°15′N）開展。該地區(qū)屬暖溫帶大陸性季風氣候，年均氣溫14.9 ℃，年均降雨量972 mm，年均蒸發(fā)量1 574 mm，無霜期220 d。土壤類型為石灰性砂姜黑土，0～50 cm 土質為黏壤土及壤質黏土，耕層質地黏重，適耕期較短。試驗前，0～20 cm 土層基本性質：容重1.44 g·cm-3，有機碳7.8 g·kg-1，全氮0.11 g·kg-1，有效磷7.9 mg·kg-1，速效鉀134.2 mg·kg-1，pH 6.7。

1.2 試驗設計

試驗設置0、1∕3、2∕3 和100%玉米秸稈還田量（CK、S3、S6 和S9），4 個處理，3 次重復，共12 個小區(qū)，小區(qū)面積40 m（28 m×5 m），完全隨機排列。CK、S3、S6 和S9 處理還田量分別為0、3 000、6 000 kg·hm-2和9 000 kg·hm-2。秸稈自然風干，粉碎至5 cm 左右，于小麥播種前按小區(qū)需求量旋耕翻入0～20 cm 土層。秸稈氮、磷和鉀含量分別為2.12%、0.24%和2.43%。小麥品種為遂麥139（遂平縣農業(yè)科學試驗站選育），播種量180 kg·hm-2，當年10 月下旬播種，翌年6 月上旬收獲。肥料品種與施肥量：肥料品種為尿素（含N 46%）、過磷酸鈣（含P2O512%）和氯化鉀（含K2O 60%），N、P2O5和K2O用量分別為180、100、60 kg·hm-2，其中磷、鉀肥和70%氮肥于小麥播種前基施，30%氮肥于拔節(jié)期追施。小麥收獲后，秸稈全量（7 500 kg·hm-2左右）覆蓋還田，接茬玉米輪作。玉米品種為鄭單1002（河南省農業(yè)科學院糧食作物研究所），播種與施肥方式為貼茬種肥同播，密度67 500 株·hm-2；肥料選用常規(guī)復合肥（N-P2O5-K2O 為30-5-5），施用量750 kg·hm-2，基施、無追肥。整地、病蟲草害防治等田間管理措施同當?shù)剞r戶保持一致。

1.3 樣品采集與分析

1.3.1 樣品采集

于2021 年小麥收獲期，采用五點取樣法，用5 cm直徑的土鉆分別采集各小區(qū)0～20 cm 土樣，混勻，每個土樣為各小區(qū)5 個采樣點的混合樣，剔除可見動、植物殘體和石塊等過2.00 mm 篩備用。將采集的土樣分成三部分：一部分自然風干過0.25 mm 篩，用于測定土壤養(yǎng)分含量；另一部分4 ℃保存，7日內測定酶活性及微生物生物量；其余部分-80 ℃保存，3日內分析土壤細菌群落特征。

1.3.2 土壤養(yǎng)分、酶活性及微生物生物量分析

有機碳的測定采用K2Cr2O7-H2SO4氧化法；堿解氮的測定采用堿解擴散法；有效磷的測定采用鉬藍比色法；速效鉀的測定采用火焰光度法。土壤養(yǎng)分指標的測定方法均參考《土壤農化分析》[12]。微生物生物量碳、生物量氮的測定采用氯仿熏蒸-K2SO4浸提法[13]。脲酶、纖維素酶、木聚糖酶和漆酶活性的測定采用酶聯(lián)免疫分析（ELISA）雙抗體夾心法，步驟參考ELISA 試劑盒（上海雙贏生物科技有限公司）使用說明書。

1.3.3 微生物DNA提取及高通量測序

稱取0.5 g 冷凍土樣，使用FastDNA?SPIN Kit（MP Biomedicals，法國）提取微生物DNA，采用Nano-Drop2000 分光光度計（Thermo Scientific，美國）檢測DNA 濃度和純度，采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質量，檢測合格后，用于構建文庫。采用細菌通用引物對16S rRNA基因V3～V4區(qū)進行PCR擴增，使用2%瓊脂糖凝膠回收擴增產物，利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit（Axygen Biosciences，美國）純化，并用QuantiFluorTM-ST（Promega，美國）檢測定量。根據Illumina MiSeq 平臺（Illumina，美國）標準操作規(guī)程，利用純化后擴增片段構建PE 2×300 文庫，采用Illumina Miseq技術測序。

1.4 測序數(shù)據處理

測序完成后，對有效序列進行質控、拼接和去雜等處理，12 個樣品共得到723 735（46 573～73 118）條高質量序列，平均長度415 bp，用于分析細菌群落特征。基于97%的相似水平，利用UPARSE軟件對操作分類單元（OTU）進行聚類，并使用UCHIME 鑒定及去除嵌合序列。根據Silva數(shù)據庫，對每個OTU物種注釋與分類。利用Mothur軟件計算Shannon、Simpson多樣性指數(shù)及Chao1、ACE豐富度指數(shù)，用于評價細菌α-多樣性[14]；基于Bray-Curtis 距離矩陣進行非度量多維尺度分析（NMDS），用于評價細菌群落結構特征。

1.5 統(tǒng)計分析

利用SPSS 21.0 軟件中單因素方差分析法（Oneway ANOVA）比較處理間各指標的差異，采用最小顯著性差異法（LSD，P=0.05）比較處理間各指標結果的平均值。采用R 3.60 軟件中Vegan 包進行細菌群落結構的NMDS 分析及細菌群落組成與環(huán)境因子的冗余分析（RDA），并采用Ggplot2 包繪圖。采用Origin-Pro 2021b繪制柱狀圖。

2 結果與分析

2.1 玉米秸稈還田量對土壤基礎養(yǎng)分含量的影響

圖1 為不同玉米秸稈還田量處理下土壤有機碳、堿解氮、有效磷和速效鉀含量。結果表明，與CK處理相比，S6 和S9 處理顯著提高了土壤有機碳（12.9%和14.4%）、堿解氮（21.4%和25.6%）、有效磷（17.9%和20.5%）和速效鉀（25.9%和29.8%）含量，而S3 處理土壤養(yǎng)分含量與CK處理無顯著差異。在秸稈還田處理中，S6 和S9 處理較S3 處理土壤速效鉀含量分別顯著提高了12.8%和16.2%，而S6和S9處理各土壤養(yǎng)分含量均無顯著差異。

圖1 不同處理下土壤養(yǎng)分含量Figure 1 Soil nutrient contents under different treatments

2.2 玉米秸稈還田量對土壤酶活性的影響

表1 為不同玉米秸稈還田量處理下土壤酶活性。結果表明，與CK處理相比，秸稈還田處理顯著提高了土壤脲酶和纖維素酶活性，增幅分別為22.5%～44.6%和23.9%～52.1%；同時，S6 和S9 處理較CK 處理顯著提高了土壤木聚糖酶活性，增幅分別為32.7%和21.2%；不同處理土壤漆酶活性之間差異不顯著。在秸稈還田處理中，S6 和S9 處理較S3 處理土壤纖維素酶活性分別顯著提高了22.8%和14.5%，木聚糖酶活性分別顯著提高了23.2%和12.5%，而S6和S9處理之間土壤酶活性無顯著差異。

表1 不同處理下土壤酶活性（U·g-1）Table 1 Soil enzyme activities under different treatments（U·g-1）

2.3 玉米秸稈還田量對土壤微生物生物量碳、生物量氮的影響

圖2 為不同玉米秸稈還田量處理下土壤微生物生物量碳、生物量氮含量。結果表明，與CK 處理相比，秸稈還田處理顯著提高了土壤微生物生物量碳，增幅為16.6%～46.7%，S6 處理增幅最高；同時，S6 和S9 處理較CK 處理顯著提高了土壤微生物生物量氮，增幅分別為53.5%和54.4%。在秸稈還田處理中，S6和S9處理較S3處理土壤微生物生物量碳分別顯著提高了25.9%和23.6%，而S6和S9處理土壤微生物生物量碳、生物量氮之間均無顯著差異。

圖2 不同處理下土壤微生物生物量碳、生物量氮含量Figure 2 Contents of soil microbial biomass C and N under different treatments

2.4 玉米秸稈還田量對土壤細菌α-多樣性的影響

不同玉米秸稈還田量處理下土壤細菌α-多樣性特征（表2）表明，與CK 處理相比，秸稈還田處理土壤細菌群落豐富度指數(shù)（Chao1 指數(shù)和ACE 指數(shù)）無顯著變化，即秸稈還田對土壤細菌群落豐富度的影響較小。然而，對于土壤細菌群落多樣性指數(shù)（Shannon指數(shù)和Simpson 指數(shù)）來說，與CK 處理相比，S6 和S9 處理Shannon 指數(shù)顯著升高、Simpson 指數(shù)顯著下降，即2∕3 和100%玉米秸稈還田量均顯著提高了土壤細菌群落多樣性。由此可見，秸稈還田對土壤細菌群落豐富度影響較小，而增加秸稈還田量一定程度上能夠提高土壤細菌群落多樣性。

表2 不同處理下土壤細菌α-多樣性Table 2 Soil bacterial α-diversity under different treatments

2.5 玉米秸稈還田量對土壤細菌群落結構的影響

對土壤細菌群落在門水平上進行分類，4 個處理共含有30 個門，相對豐度≥1%的門有9 個（圖3），其中放線菌門、變形菌門、酸桿菌門、綠彎菌門和厚壁菌門為優(yōu)勢門，相對豐度占87.2%～89.4%。與CK 處理相比，秸稈還田處理下酸桿菌門相對豐度顯著降低了2.6～4.7 個百分點，S6 和S9 處理下變形菌門相對豐度分別顯著增加了3.8、4.9 個百分點，不同處理下其他細菌門之間相對豐度差異均不顯著。進一步對比分析，4 個處理共含有637 個屬，其中熱酸菌屬、布氏桿菌屬和芽孢桿菌屬為優(yōu)勢屬（圖4）。與CK 處理相比，秸稈還田處理下芽孢桿菌屬相對豐度顯著提高了1.2～2.9 個百分點，S6 和S9 處理下布氏桿菌屬相對豐度分別顯著降低了1.4和1.8個百分點，不同處理下熱酸菌屬相對豐度差異不顯著。

圖3 不同處理下土壤細菌群落在門水平上的相對豐度Figure 3 Soil bacterial community abundance at phylum level under different treatments

圖4 不同處理下土壤優(yōu)勢細菌屬的相對豐度Figure 4 The abundance of soil predominant bacterial genera under different treatments

不同玉米秸稈還田量處理下土壤細菌群落結構在OTU 水平上的非度量多維尺度分析（NMDS）結果（圖5）表明，與CK 處理相比，秸稈還田處理明顯影響了土壤細菌群落組成，并形成了不同的群落空間結構。其中，S6 和S9 處理土壤細菌群落空間結構變化趨勢較為一致，且與CK處理差異較大。

圖5 不同處理下土壤細菌群落結構在OTU水平上的非度量多維尺度分析（NMDS）Figure 5 The NMDS of soil bacterial community structure at OTU level under different treatments

2.6 土壤細菌群落組成與環(huán)境因子之間的關系

圖6 為不同玉米秸稈還田量處理下土壤細菌群落組成與環(huán)境因子的RDA 結果，兩個排序軸共解釋了81.8%土壤細菌群落組成的差異。其中，第一排序軸貢獻率為69.2%且顯著（F=13.93，P＜0.05）影響了土壤細菌群落組成，主要反映了土壤細菌群落組成受有機碳（F=6.42，P＜0.05）、微生物生物量碳（F=5.51，P＜0.05）和脲酶（F=4.85，P＜0.05）的影響，其解釋率依次為59.8%、50.1%和43.4%；第二排序軸貢獻率僅為12.6%，主要反映了堿解氮和有效磷對土壤細菌群落組成的影響。由此可見，土壤有機碳、微生物生物量碳和脲酶是影響土壤細菌群落組成的關鍵因子。

圖6 不同處理下土壤細菌群落組成與環(huán)境因子的冗余分析Figure 6 The RDA of soil bacterial community composition and environmental factors under different treatments

3 討論

3.1 土壤基礎養(yǎng)分變化特征

秸稈還田是改善土壤養(yǎng)分狀況的有效措施[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，與CK 處理相比，S6 和S9 處理顯著提高了土壤有機碳、堿解氮、有效磷及速效鉀含量，而S3處理土壤養(yǎng)分含量無顯著變化，這與ZHANG 等[16]的研究結果一致，其原因歸結于高量或中量秸稈還田條件下大量秸稈發(fā)生腐解，使養(yǎng)分釋放量增加。然而，當秸稈還田量超出一定范圍后，秸稈腐解率會隨著投入量的增加而降低，土壤養(yǎng)分含量呈現(xiàn)下降趨勢[17]。在本研究中，S6 與S9 處理之間土壤養(yǎng)分含量均無顯著差異，說明100%秸稈還田量（9 000 kg·hm-2）未對土壤養(yǎng)分造成不良影響。

3.2 土壤酶活性變化特征

土壤酶活性是表征土壤養(yǎng)分循環(huán)及微生物代謝活性的關鍵指標[18]。其中，脲酶和纖維素酶是參與土壤碳、氮循環(huán)的主要酶系，其活性與纖維素降解密切相關[19]。程曼等[20]研究發(fā)現(xiàn)，長期秸稈還田顯著提高了土壤脲酶和纖維素酶活性。WEI等[21]也發(fā)現(xiàn)，秸稈還田條件下土壤脲酶、轉化酶等活性顯著增加，并指出土壤酶活性與有機質含量呈顯著正相關。在本研究中，秸稈還田處理顯著提高了土壤脲酶和纖維素酶活性，這可能與大量碳源投入引起的土壤有機質增加、微生物生長與活性增強及微生物群落變化有關[22-23]。木聚糖酶是降解半纖維素的主要酶系，其活性與微生物降解半纖維素能力相關。賀美等[24]研究發(fā)現(xiàn)，與不還田和1∕3 秸稈還田量（3 000 kg·hm-2）相比，1∕2（4 500 kg·hm-2）和100%秸稈還田量（9 000 kg·hm-2）均顯著提高了土壤木聚糖酶活性，本研究也得到了相似的結論（表1）。漆酶是降解木質素的關鍵酶系，其活性與微生物降解木質素能力相關。在本研究中，秸稈還田處理土壤漆酶活性無顯著變化，這一方面可能與秸稈木質素結構復雜、降解慢等特性有關；另一方面可能與該土壤類型下產漆酶微生物（白腐菌、褐腐菌等）較少有關[25]。此外，有研究表明，適宜秸稈還田量能夠顯著提高土壤酶（脲酶、轉化酶等）活性，而秸稈還田量過高造成了土壤酶活性大幅下降[4]。本研究發(fā)現(xiàn)，S6 和S9 處理4 種土壤酶活性之間均無顯著差異，說明100%秸稈還田量（9 000 kg·hm-2）未對土壤酶活性造成不良影響。

3.3 土壤微生物生物量碳、生物量氮變化特征

土壤微生物生物量是土壤活性養(yǎng)分的儲存庫，反映了參與調控土壤養(yǎng)分循環(huán)的微生物數(shù)量[26]。有報道指出，有機物料的投入為土壤微生物提供了大量碳源，刺激了土壤微生物生長繁殖及作物生長，提高了土壤微生物生物量[27]，這與本研究中S6 和S9 處理土壤微生物生物量碳、生物量氮含量均顯著高于CK 處理的結果基本一致，可能是由于S6 和S9 處理下土壤有機碳及其他養(yǎng)分含量較高（圖1）。相比之下，S3 處理秸稈還田量相對較低，導致土壤微生物生物量的變化相對較小。

3.4 土壤細菌群落結構多樣性特征

土壤微生物是評價土壤生物學特性的關鍵指標[28]。張鑫等[29]研究發(fā)現(xiàn)，秸稈還田能夠維持和提高土壤細菌群落多樣性水平，本研究也得到了相似的結果（表2）。在本研究中，酸桿菌門相對豐度在秸稈還田處理下顯著降低，變形菌門相對豐度在S6 和S9 處理下均顯著增加，這可能是由于酸桿菌門屬于貧營養(yǎng)型菌，生長速率緩慢，易富集在養(yǎng)分含量較低環(huán)境中，能夠降解復雜的有機物質[30]；然而，變形菌門屬于富營養(yǎng)型菌，能夠在土壤有機質及營養(yǎng)元素較高環(huán)境條件下迅速生長[31]。進一步分析發(fā)現(xiàn)，芽孢桿菌屬相對豐度在秸稈還田處理中顯著提高，布氏桿菌屬相對豐度在S6 和S9 處理下均顯著降低，這主要是由于芽孢桿菌屬是厚壁菌門下主要化能異養(yǎng)細菌類群，參與木質纖維素降解、難溶性養(yǎng)分轉化等過程，其豐度與土壤有機碳及速效養(yǎng)分含量呈極顯著正相關[32]；然而，布氏桿菌屬是酸桿菌門下主要異養(yǎng)細菌類群，其生長特性及規(guī)律與酸桿菌門細菌相似[33]。本研究NMDS結果表明，與CK 處理相比，S6 和S9 處理下土壤細菌群落結構均發(fā)生了明顯的變化，其根本原因在于處理間土壤養(yǎng)分含量、酶活性及微生物生物量的差異影響了土壤細菌群落結構分布。由此可見，與不還田相比，2∕3（6 000 kg·hm-2）和100%秸稈還田量（9 000 kg·hm-2）在改善土壤細菌群落結構與多樣性方面均具有積極作用。

3.5 影響土壤細菌群落組成的關鍵因子

有研究表明，土壤有機質、微生物生物量碳、脲酶活性與微生物碳利用率呈顯著正相關[34]。本研究RDA 結果表明，土壤有機碳、微生物生物量碳及脲酶是影響土壤細菌群落組成的關鍵因子。該結果說明土壤有機碳含量、微生物生物量碳含量及脲酶活性越高越有利于細菌生長，進而提高土壤有機碳并改善土壤生物學特性。

4 結論

與玉米秸稈不還田相比，2∕3（6 000 kg·hm-2）和100%玉米秸稈還田量（9 000 kg·hm-2）均能夠提高砂姜黑土土壤養(yǎng)分含量，增強土壤脲酶、纖維素酶和木聚糖酶活性，提高土壤微生物生物量碳、生物量氮含量，改善土壤細菌群落結構；相比之下，1∕3 玉米秸稈還田量（3 000 kg·hm-2）的作用效果相對較弱。

因此，在砂姜黑土區(qū)，2∕3（6 000 kg·hm-2）和100%玉米秸稈還田量（9 000 kg·hm-2）均能夠改善土壤養(yǎng)分狀況及生物學特性，可根據當?shù)厍闆r選擇適宜用量。