李茂森,王麗淵,楊波,劉福童,張勇江,任天寶*,張福建*
(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)∕河南省生物炭研究工程技術(shù)中心,鄭州 450002;2.生物炭技術(shù)河南省工程實(shí)驗(yàn)室,鄭州 450002;3.江西省煙草公司宜春市公司,江西 宜春 336000;4.安徽中煙工業(yè)有限責(zé)任公司,合肥 230000)
生物炭是生物質(zhì)在低氧條件下經(jīng)高溫裂解而產(chǎn)生的一種性質(zhì)穩(wěn)定的黑色富碳物質(zhì)[1]。生物炭表面孔隙豐富,有較大的電荷密度和比表面積[2]。這些特殊的理化性質(zhì)使生物炭可以作為優(yōu)秀的土壤改良劑[3],生物炭可以改善土壤的理化性質(zhì)及微生態(tài)環(huán)境,提高土壤礦化效率,進(jìn)而提高土壤肥力[4]。此外,生物炭可以吸附土壤中的重金屬,改變土壤中重金屬的形態(tài),減輕其對(duì)作物的毒害[5]。研究發(fā)現(xiàn),施用生物炭可以有效提高土壤中速效鉀、有效磷等養(yǎng)分含量,提高土壤pH,改善土壤酸化現(xiàn)象[6-7]。另有研究表明,在土壤中持續(xù)添加生物炭數(shù)年,可以有效改善土壤結(jié)構(gòu),提高土壤孔隙度,降低土壤容重[8]。
微生物驅(qū)動(dòng)土壤的物質(zhì)循環(huán),微生物種類(lèi)不同,其生理、生化和生態(tài)特性也有顯著的差異,微生物群落的組成和結(jié)構(gòu)對(duì)土壤中的物質(zhì)循環(huán)有較大的影響[9]。反之,土壤的形態(tài)以及土壤中的養(yǎng)分等因素也會(huì)對(duì)微生物的群落組成產(chǎn)生一定的影響。生物炭表面具有發(fā)達(dá)的孔隙結(jié)構(gòu)和較大的比表面積,對(duì)水肥有較好的吸收和保持能力,為微生物提供了絕佳的生存環(huán)境[10]。大量試驗(yàn)表明,施加生物炭可以在不同程度上增加土壤中細(xì)菌、真菌和放線菌的數(shù)量。殷全玉等[11]連續(xù)4 年在煙地中施加生物炭,發(fā)現(xiàn)連續(xù)施用生物炭顯著改變了土壤真菌的群落結(jié)構(gòu),但對(duì)真菌OTU數(shù)量和α多樣性指數(shù)沒(méi)有顯著影響。閻海濤等[12]研究發(fā)現(xiàn),施加生物炭提高了子囊菌門(mén)和擔(dān)子菌門(mén)的相對(duì)豐度,降低了接合菌門(mén)的相對(duì)豐度。真菌是土壤微生物的重要組成部分,在土壤物質(zhì)循環(huán)、能量傳遞、抑菌殺蟲(chóng)、防治土傳病害等方面具有不同的作用和特性。研究發(fā)現(xiàn),真菌是土壤中最主要的一類(lèi)病原物,70%左右的植物侵染性病害都是由真菌引起[13],如鐮刀菌可通過(guò)侵染煙草根系,破壞煙草根系的維管束組織,從而引發(fā)煙草根黑腐病[14],黑腐病在煙草種植中的危害日益嚴(yán)重,已經(jīng)成為重要土傳病害[15]。另外,真菌在土壤物質(zhì)循環(huán)和抑菌殺蟲(chóng)等方面也發(fā)揮著重要作用:枯草芽孢桿菌是一種常見(jiàn)的益生菌,廣泛分布在土壤及腐敗的有機(jī)物中,多用于作物的病害防治[16];漆斑菌廣泛存在于植物和土壤中,具有極強(qiáng)的纖維素分解能力,同時(shí)還能夠產(chǎn)生抗生素。這些真菌的存在對(duì)土壤微生態(tài)的自我修復(fù)或化學(xué)營(yíng)養(yǎng)環(huán)境的改善具有重要作用[17]。因此,加強(qiáng)對(duì)土壤微生物,尤其是真菌群落結(jié)構(gòu)調(diào)控技術(shù)研究有利于我國(guó)農(nóng)業(yè)的綠色可持續(xù)發(fā)展。
近些年來(lái),關(guān)于生物炭對(duì)植煙土壤微生物多樣性的影響已有較多的研究,但大多數(shù)研究圍繞生物炭對(duì)細(xì)菌或真菌多樣性和群落結(jié)構(gòu)的影響,而對(duì)于土壤微生物菌群尤其是真菌類(lèi)群的功能分析相對(duì)較少,本試驗(yàn)采用高通量測(cè)序技術(shù)結(jié)合FUNGuid分析方法,在研究生物炭對(duì)烤煙根際真菌群落結(jié)構(gòu)影響的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步探究生物炭對(duì)植煙土壤真菌功能類(lèi)群的影響,以期為植煙土壤微生態(tài)調(diào)控提供更多的理論依據(jù)。
本試驗(yàn)于2020 年在江西宜春上高煙區(qū)進(jìn)行,該煙區(qū)實(shí)行煙稻輪作制,植煙土壤均為砂壤土。土壤基本理化性質(zhì):土壤pH 為5.52,有機(jī)質(zhì)含量為13.40 g·kg-1,堿解氮為97.25 mg·kg-1,有效磷為25.54 mg·kg-1,速效鉀為105.40 mg·kg-1。生物炭原料為花生殼,在低氧環(huán)境下經(jīng)380~400 ℃持續(xù)炭化20 min 制得,其基本理化性質(zhì)如表1所示。
表1 供試生物炭理化性質(zhì)Table 1 Physicochemical properties of the biochar
試驗(yàn)采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì),共設(shè)置2 個(gè)處理(CK 和T),每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù),每小區(qū)長(zhǎng)20 m、寬5 m,試驗(yàn)總面積0.06 hm2。CK 處理:常規(guī)施肥(煙草專(zhuān)用肥270 kg·hm-2,m(N)∶m(P2O5)∶m(K2O)=1∶1∶3,硫酸鉀225 kg·hm-2,鈣鎂磷肥112.5 kg·hm-2),T 處理:750 kg·hm-2生物炭+常規(guī)施肥。2020 年4 月23 日之前將生物炭施入煙田,生物炭和常規(guī)肥料作為基肥一次性施入植煙土壤,施肥方式為條施。各處理的移栽方法、水肥管理、農(nóng)事操作與當(dāng)?shù)卮筇镆恢隆?/p>
1.3.1 供試土壤與樣品采集
烤煙生長(zhǎng)到成熟期第75 天時(shí),采用5 點(diǎn)取樣法,每個(gè)處理確定5 個(gè)取樣點(diǎn),用鏟子將煙株根際周?chē)耐寥劳谥?0 cm 的深度,切割土壤中煙株的任何側(cè)根,挖出煙株整個(gè)根部。將根球放入盆中,搖動(dòng)根部并用鏟子收集土壤,收集完成后混勻并分為3 部分:一部分保存在10 mL 無(wú)菌離心管中,用干冰保存送往上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行微生物多樣性檢測(cè);一部分于4 ℃冰箱保存,用于土壤微生物量的檢測(cè);最后一部分在陰涼處自然風(fēng)干后研磨,分別過(guò)0.85、0.25 mm 和0.15 mm 篩后于陰涼處保存,用于土壤理化性質(zhì)分析。
1.3.2 土壤理化指標(biāo)及養(yǎng)分測(cè)定
參考《土壤農(nóng)業(yè)化學(xué)分析方法》[18]對(duì)土壤理化性質(zhì)進(jìn)行測(cè)定,每個(gè)樣點(diǎn)做3 個(gè)平行組。pH 的測(cè)定用超純水作浸提劑,按照土水比為1∶2.5的比例浸提,用精密pH 計(jì)(型號(hào):IS128C)直接測(cè)定;堿解氮(AN)采用堿解擴(kuò)散法測(cè)定;土壤速效鉀(AK)采用火焰光度計(jì)法測(cè)定;土壤有效磷(AP)采用碳酸氫鈉浸提法測(cè)定;微生物量碳(MBC)、微生物量氮(MBN)采用氯仿熏蒸-硫酸鉀浸提法測(cè)定。
1.3.3 土壤真菌檢測(cè)
土壤DNA 提取和PCR 擴(kuò)增:使用E.Z.N.A.?soil試劑盒(Omega Bio-tek,Norcross,美國(guó))對(duì)土壤DNA進(jìn)行提取,利用NanoDrop2000 超微量分光光度計(jì)(Thermo Fisher Scientific,美國(guó))對(duì)DNA 的純度進(jìn)行檢測(cè);檢測(cè)合格后,以稀釋后的基因組DNA 為模板,引物采 用18S SSU0817F(5′ -TTAGCATGGAATAATRRAATAGGA-3′)和1196R(5′-TCTGGACCTGGTGAGTTTCC-3′)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。為了確保擴(kuò)增效率和準(zhǔn)確性,PCR 產(chǎn)物使用電泳檢測(cè),檢測(cè)后使用磁珠純化,純化后作為二輪PCR 模板,并進(jìn)行二輪PCR擴(kuò)增,再次使用電泳檢測(cè),檢測(cè)后使用磁珠純化,純化后對(duì)PCR 產(chǎn)物進(jìn)行Qubit 定量。根據(jù)PCR 產(chǎn)物濃度進(jìn)行等量混樣,之后上機(jī)測(cè)序。
1.3.4 農(nóng)藝性狀及烤后煙葉化學(xué)成分測(cè)定
在煙葉移栽后65、85 d 和105 d 的兩個(gè)處理中各選取10 株烤煙,分別測(cè)量煙株的株高、莖圍、中部葉葉長(zhǎng)和葉寬,煙株莖圍選取煙株自上而下第5、10、15片葉處測(cè)定,取平均值。中部葉葉長(zhǎng)、葉寬選煙株自上而下第10 片葉進(jìn)行測(cè)量。烘烤結(jié)束后,選取兩個(gè)處理的B2F等級(jí)煙葉各0.5 kg,總糖、還原糖、總氮、煙堿、鉀元素、氯元素和蛋白質(zhì)分別參照煙草行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)YC∕T 159—2002、YC∕T 160—2002、YC∕T 161—2002、YC∕T 166—2002、YC∕T 166—2002、YC∕T 160—2002和YC∕T 166—2003 進(jìn)行測(cè)定,每個(gè)處理重復(fù)3 次。
采用Microsoft Excel 2016 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理,方差分析采用最小顯著性差異法,用SPSS 22.0 軟件處理數(shù)據(jù),樣本間群落組成差異采用非度量多維尺度法(NMDS)進(jìn)行分析,用R 語(yǔ)言軟件的Vegan 包進(jìn)行繪圖。
由表2 可知,添加生物炭后煙株株高和中部葉葉寬在移栽后65、105 d均大于對(duì)照處理,且差異均達(dá)到顯著性水平(P<0.05),株高在三個(gè)時(shí)期各提高了3.32%、0.35%和2.34%,生物炭處理煙株中部葉葉寬較對(duì)照分別提高了4.28%、4.79%和5.48%。添加生物炭處理莖圍與對(duì)照組無(wú)顯著差異(P>0.05)。生物炭處理在移栽后65 d和105 d中部葉葉長(zhǎng)較對(duì)照顯著提高2.33%和1.71%。以上結(jié)果表明施用生物炭有利于煙株生長(zhǎng)。
表2 煙株不同生育時(shí)期農(nóng)藝性狀指標(biāo)Table 2 Agronomic traits of tobacco at different growth stages
由表3可知,與CK相比,施加生物炭的土壤pH升高了0.52個(gè)單位,與CK 存在顯著差異(P<0.05);土壤堿解氮含量與CK 無(wú)顯著差異(P>0.05);生物炭處理速效鉀、有效磷和有機(jī)碳含量較CK 處理分別提高了11.14%、7.90%和11.76%,且均與CK存在顯著差異(P<0.05)。這說(shuō)明添加生物炭可以顯著提高土壤速效養(yǎng)分含量,并有效改善土壤的酸化現(xiàn)象。
表3 生物炭對(duì)土壤養(yǎng)分的影響Table 3 Effects of biochar on soil nutrients
對(duì)6個(gè)樣本的真菌進(jìn)行檢測(cè),共得到真菌24個(gè)門(mén)類(lèi),99個(gè)科類(lèi),114個(gè)屬類(lèi),測(cè)得有效序列(Sequences)259 848 條。對(duì)所有序列進(jìn)行聚類(lèi)后得知,CK 和T 處理的樣本平均OTU 數(shù)分別為170 和166,對(duì)照和施加生物炭處理的OTU 數(shù)差異不大(圖1)。如表4 所示,施加生物炭后ACE 指數(shù)和超指數(shù)降低,香農(nóng)指數(shù)升高,說(shuō)明生物炭對(duì)土壤真菌多樣性具有一定的影響。樣品測(cè)序覆蓋度分別達(dá)到99.92%和99.95%,表明樣品測(cè)序深度足夠,滿足后續(xù)分析要求。
表4 真菌群落測(cè)序順序和α多樣性Table 4 Sequencing result of fungal communities α diversity
圖1 土壤真菌群落OTU數(shù)Figure 1 OTU number of soil fungal community
2.4.1 生物炭對(duì)門(mén)水平上真菌相對(duì)豐度的影響
由圖2 可以看出,在所有樣本門(mén)水平上優(yōu)勢(shì)真菌為子囊菌門(mén)(Ascomycota)、毛霉菌門(mén)(Mucoromycota)、一種未分類(lèi)SAR超類(lèi)群(SAR-k-NORANK)和一種未分類(lèi)的真菌類(lèi)群(Unclassified-k-Fungi),其相對(duì)豐度之和占所有可注釋真菌的90%以上,相對(duì)豐度分別為81.21%~87.37%、2.69%~8.60%、0.83%~5.19% 和1.44%~3.70%。
圖2 門(mén)水平上真菌相對(duì)豐度Figure 2 Relative abundance of fungi at phylum level
對(duì)施加生物炭處理和對(duì)照土壤樣品中真菌群落的相對(duì)豐度進(jìn)行T檢驗(yàn),結(jié)果如圖3 所示。與對(duì)照相比,施加生物炭降低了子囊菌門(mén)和一種未分類(lèi)的SAR超類(lèi)群的相對(duì)豐度,分別降低了1.20%和63.88%;同時(shí)提高了毛霉菌門(mén)、擔(dān)子菌門(mén)和一種未分類(lèi)的真菌類(lèi)群,升幅分別達(dá)到54.02%、31.49%和38.63%。
圖3 門(mén)水平上真菌相對(duì)豐度差異Figure 3 Relative abundance differences of fungi at phylum level
2.4.2 生物炭對(duì)土壤真菌β多樣性的影響
如圖4所示,基于OTU 水平的非度量多維尺度分析結(jié)果表明,在NMDS1軸上,生物炭添加后土壤樣本與對(duì)照組真菌群落明顯分離,說(shuō)明添加生物炭可以影響土壤的真菌群落。
圖4 基于非度量多維尺度(NMDS)土壤真菌群落分析Figure 4 Analysis of soil fungal community based on NMDS
2.4.3 生物炭對(duì)真菌功能類(lèi)群的影響
從圖5 中可以看出,土壤中可鑒定真菌共分6 種營(yíng)養(yǎng)類(lèi)型。其中病理-腐生-共生過(guò)渡型真菌豐度在CK 和T 處理中占比均為最高,分別為34.21%和33.50%。添加生物炭使土壤病理營(yíng)養(yǎng)型真菌豐度較對(duì)照下降了62.07%,腐生營(yíng)養(yǎng)型真菌豐度提高了69.80%,說(shuō)明生物炭對(duì)土壤的物質(zhì)循環(huán)和病害防治具有一定的促進(jìn)作用。
圖5 真菌營(yíng)養(yǎng)類(lèi)型組成的相對(duì)豐度Figure 5 Relative abundance of nutrient types of fungi
由圖6 可知,已鑒定出的土壤功能真菌優(yōu)勢(shì)類(lèi)群為動(dòng)物病原菌-內(nèi)生菌-地衣寄生菌-植物病原菌-土壤腐生菌-木質(zhì)腐生真菌、動(dòng)物病原菌-糞腐生物-內(nèi)生菌-表生菌-植物腐生菌-木質(zhì)腐生真菌、一種未分類(lèi)的腐生菌和動(dòng)物病原菌-內(nèi)生菌-地衣寄生菌-植物病原菌-木質(zhì)腐生真菌,其平均豐度分別占優(yōu)勢(shì)OTU 的28.31%、17.26%、12.22%和6.65%。添加生物炭后動(dòng)物病原菌-內(nèi)生菌-地衣寄生菌-植物病原菌-土壤腐生菌-木質(zhì)腐生真菌和一種未分類(lèi)的腐生菌類(lèi)群豐度較CK 處理分別升高了37.15%和64.38%,動(dòng)物病原菌-糞腐生物-內(nèi)生菌-表生菌-植物腐生菌-木質(zhì)腐生真菌和動(dòng)物病原菌-內(nèi)生菌-地衣寄生菌-植物病原菌-木質(zhì)腐生真菌類(lèi)群豐度分別下降了32.70%和58.89%。
圖6 基于OTUs的真菌功能類(lèi)群Figure 6 Functional groups of fungi based on OTUs
試驗(yàn)比較分析了兩個(gè)處理中B2F 等級(jí)烤后煙葉樣品的常規(guī)化學(xué)成分,由表5 可知,生物炭處理的煙葉總糖、還原糖、鉀含量較對(duì)照處理均有顯著增加,分別增加16.47%、10.82%和11.78%(P<0.05);生物炭對(duì)煙堿、氯、總氮和蛋白質(zhì)的影響均未達(dá)到顯著水平(P>0.05)。煙葉中的氯離子含量較對(duì)照組略微下降,鉀氯比明顯提高了13.31%。施加生物炭后,總糖和還原糖含量均有所增加,但總糖增幅較大,兩糖比下降了4.44%。
表5 生物炭施用對(duì)烤后煙常規(guī)化學(xué)成分的影響Table 5 Effects of biochar on conventional chemical components of flue-cured tobacco
生物炭能夠改良土壤,使土壤更有利于植物生長(zhǎng)[19]。本試驗(yàn)結(jié)果表明,施加生物炭顯著提高了土壤pH 值,這是由于生物炭在自然條件下呈堿性,pH 值一般為7.0~10.5[20],施加到土壤后可以提升土壤的pH值,使煙株在適宜的pH 條件下生長(zhǎng)發(fā)育,朱盼等[21]研究發(fā)現(xiàn),施加生物炭和石灰均能提高土壤的pH 值。氮素是影響植株生長(zhǎng)發(fā)育的關(guān)鍵元素,直接決定作物的產(chǎn)量,生物炭能夠保持土壤水分并且提升土壤的固氮能力,降低氮素流失。
本研究發(fā)現(xiàn),施加生物炭可以顯著提高土壤有效磷含量,與劉卉等[22]的研究結(jié)果一致,這是由于生物炭能通過(guò)影響土壤中的陽(yáng)離子活性或者改變微生物活性間接影響磷素的有效性和可吸附性[23],并且生物炭還能有效促進(jìn)土壤微生物對(duì)土壤磷素的溶解、礦化及固持作用,從而提高土壤中有效磷含量[24]。施用生物炭能提高土壤有機(jī)碳水平,而有機(jī)碳能夠降低土壤固鉀能力,使土壤中鉀元素的有效性提升,同時(shí)施用生物炭能夠提高土壤溫度,使土壤中緩效鉀的釋放量增多,并能提高速效鉀含量[25]。
施加生物炭可以改變土壤環(huán)境,進(jìn)而促進(jìn)微生物群落組成和結(jié)構(gòu)的改變[26]。本試驗(yàn)結(jié)果表明,施加生物炭后,土壤真菌OTU數(shù)和α多樣性指數(shù)較對(duì)照沒(méi)有顯著變化,這與殷全玉等[11]和閻海濤等[12]的研究結(jié)果一致,可能是由于真菌在土壤中大多為分解者,而生物炭是一種極難分解的惰性碳,真菌在短時(shí)間內(nèi)無(wú)法有效地分解利用生物炭[27]。本研究發(fā)現(xiàn)土壤中門(mén)水平上優(yōu)勢(shì)真菌為子囊菌門(mén)、毛霉菌門(mén)及一種未分類(lèi)的SAR 超類(lèi)群,這與前人的研究結(jié)果相似[28-29]。施加生物炭后,毛霉菌門(mén)、擔(dān)子菌門(mén)和一種未分類(lèi)的真菌類(lèi)群的群落相對(duì)豐度有所提高。毛霉菌是一種廣泛存在于自然界的腐生真菌,分解蛋白質(zhì)的能力較強(qiáng),毛霉菌門(mén)豐度的增加有利于土壤蛋白質(zhì)的循環(huán)[30]。子囊菌門(mén)是土壤中存在的豐度最高的真菌,子囊菌在土壤中以腐生、寄生和共生的營(yíng)養(yǎng)方式生存,可以分解動(dòng)植物殘?bào)w,部分子囊菌也會(huì)導(dǎo)致植物發(fā)生根腐、莖腐、枝枯和葉斑等[31]。本試驗(yàn)中,施加生物炭后,子囊菌門(mén)豐度有略微下降,這可能是由于其他真菌類(lèi)群與之產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)。
與細(xì)菌相比,真菌擁有更為復(fù)雜的生活史,在土壤中以多種方式吸收營(yíng)養(yǎng),土壤環(huán)境發(fā)生變化時(shí),部分真菌會(huì)迅速改變自身的營(yíng)養(yǎng)方式,以對(duì)抗因環(huán)境變化帶來(lái)的不利影響,這是一種較為高級(jí)的生存策略[32]。腐生真菌可以分解植物殘?bào)w、動(dòng)物糞便等有機(jī)質(zhì),使其能夠被植物吸收利用[33]。本研究發(fā)現(xiàn),施加生物炭后,土壤中病理營(yíng)養(yǎng)型真菌豐度降低,而腐生營(yíng)養(yǎng)型真菌豐度增加,說(shuō)明施用生物炭增強(qiáng)了土壤真菌的分解能力,更有利于作物吸收土壤中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),促進(jìn)煙株的生長(zhǎng)發(fā)育。同時(shí)病理營(yíng)養(yǎng)型真菌豐度下降,降低了煙草的病害風(fēng)險(xiǎn),減少了經(jīng)濟(jì)損失。
非度量多維尺度分析結(jié)果表明,施加生物炭后,土壤真菌群落結(jié)構(gòu)會(huì)產(chǎn)生一系列的變化,與對(duì)照表現(xiàn)出明顯的分離,這與陳坤等[34]的研究結(jié)果一致。生物炭對(duì)土壤微生物既有直接作用又有間接作用:一方面,生物炭豐富的孔隙結(jié)構(gòu)為微生物的生長(zhǎng)提供了極佳的條件,直接影響了微生物群落結(jié)構(gòu);另一方面,生物炭的施加影響了土壤的養(yǎng)分狀況,進(jìn)而對(duì)微生物的群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生一定的影響。
(1)生物炭的施加顯著提高了煙株的株高、葉長(zhǎng)、葉寬,使烤后煙葉總糖、還原糖和鉀離子含量顯著增加(P<0.05)。總體而言,施加生物炭對(duì)煙葉的品質(zhì)具有一定的提高作用。
(2)施加生物炭后,植煙土壤的速效養(yǎng)分含量提高,烤煙根際土壤酸化現(xiàn)象得到改善。
(3)生物炭改變了植煙土壤真菌的群落結(jié)構(gòu),提高了毛霉菌門(mén)、擔(dān)子菌門(mén)的相對(duì)豐度,降低了子囊菌門(mén)相對(duì)豐度。
(4)施加生物炭降低了植煙土壤病理營(yíng)養(yǎng)型真菌豐度,提高了腐生營(yíng)養(yǎng)型真菌豐度。
本試驗(yàn)探究了生物炭對(duì)植煙土壤真菌群落結(jié)構(gòu)以及功能類(lèi)群的影響,為烤煙根際微生態(tài)調(diào)控及煙草栽培提供一定的理論依據(jù)。
農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境學(xué)報(bào)2022年5期