張素，邵陽，華臻，楊俊鋒，王建偉，△

1 南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇 南京 210023；2 南京中醫(yī)藥大學(xué)無錫附屬醫(yī)院

脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）多由外傷引起，常導(dǎo)致受損平面以下的運動、感覺、反射及括約肌功能障礙，是造成截癱的主要原因，近年來，隨著現(xiàn)代社會交通、工業(yè)的不斷發(fā)展，其發(fā)病率正呈現(xiàn)逐年增高趨勢，但目前卻仍然缺乏較為理想的治療藥物［1］。因此，尋找療效顯著、安全可靠的治療SCI的方法是當(dāng)今基礎(chǔ)和臨床研究的熱點之一。脊髓康是王建偉教授以“腎督同治”理論為指導(dǎo)、結(jié)合多年臨床實踐創(chuàng)制的經(jīng)驗方，具有“祛瘀通督，溫腎利濕，調(diào)和氣血”之功效。前期研究［2-3］證實，脊髓康能明顯改善脊髓受損區(qū)域微環(huán)境、促進軸突再生及神經(jīng)細(xì)胞修復(fù)，但脊髓康能否對SCI后膠質(zhì)瘢痕形成產(chǎn)生影響尚不清楚。硫酸軟骨素蛋白多糖（chondroitin sulfate proteoglycans，CSPG）是膠質(zhì)瘢痕中存在的重要抑制分子，其高表達(dá)可制約受損區(qū)域神經(jīng)組織修復(fù)再生。為此，本研究擬通過觀察脊髓康對SCI模型大鼠脊髓組織受損區(qū)域膠質(zhì)瘢痕形成及CSPG表達(dá)的影響，進一步探討脊髓康治療SCI的潛在機制，為臨床治療SCI提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物選擇60只SD大鼠，SPF級，體質(zhì)量（200±20）g，由無錫市血吸蟲病防治研究所提供，實驗動物合格證號：SYXK（蘇）2017-0050。飼養(yǎng)條件：按5只/籠飼養(yǎng)于無錫市血吸蟲病防治研究所動物房，自由進食、進水，恒溫恒濕。本實驗已獲南京中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)，大鼠在本實驗室經(jīng)1周適應(yīng)性飼養(yǎng)后方可開始實驗。

1.2 實驗藥物脊髓康藥液（藥物組成：生黃芪30 g，當(dāng)歸12 g，川芎10 g，丹參20 g，地鱉蟲10 g，赤芍12 g，淫羊藿10 g，制大黃10 g等）為王建偉教授臨床經(jīng)驗方（國家發(fā)明專利ZL200910026193.7），其中生藥由南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院提供，制成質(zhì)量濃度為1.25 g/mL的水煎劑，4℃保存。0.3%強的松藥液：取300 mg強的松片（意大利輝瑞公司，國藥準(zhǔn)字H20110064，規(guī)格：100 mg/片）研磨成粉，充分溶解于100 mL生理鹽水中，4℃保存。

1.3 試劑及儀器PBS（北京solarbio公司，批號：20170517）；多聚甲醛（天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所，批號：20180204）；硫酸軟骨素蛋白多糖4（NG2）一抗（英國Abcam公司，批號：BK-K3443）。自制改良Allen’s脊髓損傷造模裝置（南京中醫(yī)藥大學(xué)骨傷研究所）；4853型冰凍包埋劑OCT（美國SAKURA公司）；CM3050S型冰凍切片機/切片刀（德國leica公司）；BX46型光學(xué)顯微鏡（日本OLYMPUS公司）；DM500型生物顯微鏡（德國Leica公司）；7500型實時熒光定量PCR儀（美國ABI公司）。

1.4 實驗方法

1.4.1 模型制備以7%水合氯醛腹腔注射麻醉（劑量為0.3～0.4 mL/100 g），將大鼠俯臥位固定于手術(shù)臺上，以T10棘突為中心取背部后正中縱行切口，長約3 cm，逐層進入，沿棘突剝離椎旁肌，顯露T9～T11棘突及椎板，仔細(xì)咬除T9～T11全部椎板至椎弓根部，暴露硬脊膜并保持其完整性。采用改良Allen法25 g/cm（10 g×2.5 cm）垂直打擊大鼠T9～T11節(jié)段脊髓，大鼠后肢痙攣性抽搐數(shù)次后軟癱為造模成功。逐層縫合肌肉、筋膜、皮膚。術(shù)后3天每天予以青霉素8萬單位腹腔注射以預(yù)防感染，每天2次局部按摩輔助膀胱排尿。

1.4.2 分組及處理將60只SD大鼠稱重后隨機分為4組：正常對照組、模型組、脊髓康組、激素組，每組15只。除正常對照組，其余3組大鼠均進行造模，造模成功后，分別以等體積的生理鹽水、12.5 g/（kg·d）的脊髓康溶液及0.06 g/（kg·d）的強的松溶液灌胃給藥，共給藥14天。

1.4.3 標(biāo)本制備按照實驗分組，每組分別于干預(yù)后3、7、14天隨機抽取3例樣本，脊髓神經(jīng)功能評定后以體積分?jǐn)?shù)7%水合氯醛生理鹽水溶液麻醉，固定，打開胸腔，經(jīng)左心室進針至升主動脈，剪開右心耳，PBS快速灌注至流出液體清亮，40 g/L多聚甲醛灌注固定。沿原手術(shù)切口暴露椎管，咬除上下節(jié)段椎板，輕柔取出脊髓組織，以損傷節(jié)段為中心，保留約2 cm長脊髓組織，投入4%多聚甲醛液內(nèi)繼續(xù)固定24 h，石蠟包埋，在距脊髓直接損傷處5 mm部位連續(xù)進行厚約4～5μm的超薄切片，每個樣本10張，用于脊髓組織形態(tài)學(xué)觀察及熒光定量PCR實驗。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 脊髓組織形態(tài)學(xué)觀察每組隨機抽取6例切片標(biāo)本，分別予HE染色及EnVision法染色，生物學(xué)顯微鏡觀察脊髓的病理形態(tài)學(xué)改變。其中HE染色標(biāo)本以受損區(qū)域星形膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)性改變?yōu)橛^察重點，關(guān)注膠質(zhì)瘢痕形成情況；EnVision法染色標(biāo)本以受損區(qū)域CSPG蛋白表達(dá)情況為觀察重點，以胞漿內(nèi)淡黃色或棕黃色顆粒染色為陽性表達(dá)。

1.5.2 PCR法檢測大鼠脊髓損傷區(qū)CSPG表達(dá)的檢測每組隨機抽取3例切片標(biāo)本，PCR法檢測大鼠脊髓損傷后CSPG表達(dá)，由生工生物工程（上海）公司進行引物設(shè)計并合成，行PCR擴增（正反向分別進行）：CSPG4，5'-GTCCTCCTGCTCCTGGCTCTC－3'和5'-ACAGTTGTGAGTGGAATGGCTTGG－3'，再按照qRT-PCR反應(yīng)體系加樣、操作，按兩步法進行PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火34 s，上述變性、退火步驟循環(huán)40次，隨后繼續(xù)進行建立熔解曲線的反應(yīng)：95℃15 s，60℃1 min，95℃15 s。反應(yīng)結(jié)束后自動得出擴增曲線和熔解曲線。以管家基因GAPHD作為內(nèi)參基因，采用2-△△Ct法分析CSPG在脊髓組織中的相對表達(dá)量。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件包進行分析，定量資料以±s表示，采用單因素方差分析及LSD法兩兩比較，不滿足方差分析條件時采用Wilcoxon秩和檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠脊髓組織形態(tài)學(xué)干預(yù)后3天，模型組相對于正常對照組脊髓組織損傷區(qū)域內(nèi)星形膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)性肥大和增生明顯，胞漿中的CSPG蛋白染色加深，膠質(zhì)瘢痕逐漸形成，并且保持到14天；激素組與脊髓康組脊髓組織損傷區(qū)域內(nèi)僅有部分星形膠質(zhì)細(xì)胞亦出現(xiàn)反應(yīng)性肥大和增生，但星形膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)性改變及CSPG蛋白染色加深明顯弱于模型組，膠質(zhì)瘢痕形成不明顯。見圖1—2。

圖1 各組大鼠脊髓組織形態(tài)學(xué)表現(xiàn)（HE，×200）

2.2 大鼠CSPG蛋白表達(dá)相對水平模型組脊髓組織損傷區(qū)域CSPG表達(dá)持續(xù)增強，并持續(xù)至14天。與模型組比較，脊髓康組大鼠CSPG表達(dá)于第3、7、14天呈逐步降低趨勢（P＜0.05）；第3天與第14天組內(nèi)比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。但與激素組相比，脊髓康組大鼠干預(yù)后第3、7、14天后的CSPG表達(dá)均較高，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

圖2 各組大鼠脊髓組織形態(tài)學(xué)表現(xiàn)（EnVision，×200）

表1 各組大鼠脊髓損傷區(qū)內(nèi)CSPG蛋白表達(dá)相對水平比較（±s）

表1 各組大鼠脊髓損傷區(qū)內(nèi)CSPG蛋白表達(dá)相對水平比較（±s）

注：*表示與模型組比較，P＜0.05；#表示與激素組比較，P＜0.05

時間點正常對照組模型組脊髓康組激素組樣本量（個）3 3 3 3 3 d 1 8.40±0.85 4.70±0.95*#1.93+0.15*7 d 1 8.60±0.44 3.50±0.30*#1.87±0.31*14 d 1 9.30±0.50 2.90±0.56*#1.73±0.15*

3 討論

SCI后，脊髓內(nèi)神經(jīng)傳導(dǎo)通路遭到破壞，損傷部位周圍的星形膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)性活化增生，同時內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞增殖分化成星形膠質(zhì)細(xì)胞并遷移到損傷處，共同參與膠質(zhì)瘢痕形成［4］。膠質(zhì)瘢痕可界定損傷區(qū)域和神經(jīng)組織，阻止異常軸突生長，避免繼發(fā)性病理損害，具有一定保護作用，但過多形成的膠質(zhì)瘢痕不僅對神經(jīng)元再生及軸突延伸形成機械性屏障，還可產(chǎn)生抑制因子，影響神經(jīng)細(xì)胞存活和軸突生長，是阻礙SCI后神經(jīng)功能恢復(fù)的重要原因［5］。

CSPG是目前研究較多的一類抑制因子，來源主要有星形膠質(zhì)細(xì)胞、血源性巨噬細(xì)胞、少突膠質(zhì)前體細(xì)胞和腦脊膜細(xì)胞，而以后兩種細(xì)胞尤為重要，其成分為一組共價結(jié)合硫酸葡聚糖鏈的蛋白質(zhì)，在神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)有廣泛分布，大多存在于細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）中。一般認(rèn)為，CSPG在調(diào)節(jié)細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與ECM相互作用方面起重要作用，對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和成熟、病損的病理和生理反應(yīng)具有重要意義。正常情況下，CSPG在正常脊髓組織中僅少量表達(dá)，常聚集于神經(jīng)元樹突周圍，起到穩(wěn)定突觸、抑制不必要可塑性的作用。SCI后，由于原始的星形膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)性活化增生，成為反應(yīng)型星形膠質(zhì)細(xì)胞，進而形成瘢痕形成型星形膠質(zhì)細(xì)胞，膠質(zhì)瘢痕大量生成，CSPG表達(dá)亦隨之逐漸增高。既往研究指出，高表達(dá)的CSPG可限制軸突再生、少突膠質(zhì)細(xì)胞遷移和脫髓鞘病變軸突的再髓鞘化［6］。隨著研究的深入，近期一些實驗又為CSPG可抑制小膠質(zhì)細(xì)胞動員和調(diào)控的免疫應(yīng)答提供新的證據(jù)［7］，說明CSPG在繼發(fā)性脊髓組織病理損害中所發(fā)揮的作用還有待更進一步、更全面的認(rèn)識。

脊髓康是江蘇省名中醫(yī)王建偉教授的經(jīng)驗方。該方由補陽還五湯、小承氣湯等經(jīng)典方化裁而來，方中重用黃芪補脾胃以資氣血之源，氣旺血行，瘀去絡(luò)通；當(dāng)歸養(yǎng)血和營，使陰生陽長，血旺氣生，有祛瘀不傷血之妙；川芎行氣活血止痛；丹參、赤芍、澤瀉、制大黃等活血化瘀、理氣止痛、通絡(luò)復(fù)髓、利尿通便。諸藥合用，共奏祛瘀通督、補益肝腎、調(diào)和氣血之效?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究［8-10］顯示，黃芪、芍藥、大黃等多種藥物單體或提取物被證實可有效干預(yù)SCI繼發(fā)性病變，能夠顯著減輕脊髓組織病理損害、促進神經(jīng)功能恢復(fù)。而脊髓康作為中藥復(fù)方，與藥物單體或提取物相比，多靶點、多途徑、多層次等治療優(yōu)勢更加明顯，在發(fā)揮作用時整體性更佳，用于治療SCI、促進脊髓功能恢復(fù)、改善預(yù)后的前景十分廣闊。

綜上所述，減少膠質(zhì)瘢痕的過度形成及抑制CSPG的高表達(dá)是促進脊髓組織損傷的修復(fù)和功能重建的重要治療理念之一。本研究結(jié)果表明：SCI后，模型組脊髓組織損傷區(qū)域膠質(zhì)瘢痕大量形成，并伴隨CSPG表達(dá)持續(xù)增強，此過程可持續(xù)至第14天。與模型組相比，脊髓康組大鼠脊髓組織損傷區(qū)域膠質(zhì)瘢痕形成受到明顯抑制，同時CSPG表達(dá)于第3、7、14天皆明顯降低，并且CSPG表達(dá)呈逐步降低趨勢。與激素組相比，脊髓康組膠質(zhì)瘢痕形成情況差異不明顯，而干預(yù)后第3、7、14天CSPG表達(dá)均明顯高于激素組。同時隨著干預(yù)時間的推移，兩組之間的差距似乎呈縮小趨勢，說明脊髓康能夠顯著抑制SCI模型大鼠脊髓損傷區(qū)域CSPG蛋白的表達(dá)，但其抑制作用與強的松相較還有一定差距。至于脊髓康是否能起到與強的松相近的抑制CSPG蛋白表達(dá)的作用，還需要更多的實驗樣本以及更長時間的治療周期去驗證。

本研究初步證實了中藥脊髓康對大鼠脊髓損傷區(qū)域膠質(zhì)瘢痕形成及CSPG表達(dá)具有顯著抑制作用，這可能是脊髓康參與改善局部微環(huán)境、促進軸突再生及神經(jīng)細(xì)胞修復(fù)的重要機制之一，對進一步明確SCI的病理演變有著積極意義，同時也為藥物研發(fā)與臨床治療提供了參考思路。