朱喜春，徐繼軍△，朱旭江，陳乾兌，姚世霞，張明童，李成明，李子彬

1 甘肅省藥品檢驗研究院，甘肅 蘭州 730070；2 國家藥品監(jiān)督管理局中藥材及飲片質(zhì)量控制重點實驗室；3 長春中醫(yī)藥大學(xué)；4 甘肅省中醫(yī)院

阿膠益壽口服液是常用的中藥成方制劑，具有補(bǔ)氣養(yǎng)血的功效，臨床主要用于治療氣血雙虧、未老先衰、四肢無力、腰膝酸軟、面黃肌瘦、健忘失眠、婦女產(chǎn)后諸虛等癥［1］。阿膠益壽口服液由人參、炙黃芪、制何首烏、熟地黃、阿膠、陳皮、木香、甘草等組成，收載于《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑第六冊》（標(biāo)準(zhǔn)編號：WS3-B-1143-92），該標(biāo)準(zhǔn)中鑒別項只有化學(xué)鑒別一項，不能有效地控制制劑質(zhì)量。陳皮為蕓香科植物橘及其栽培變種的成熟果皮，存放時間越久，果皮中的辛辣氣味越弱，藥用效果就越好［2］。由于陳皮具有理氣健脾，燥濕化痰的作用，在該方中為佐使藥，有理氣的作用，可增強(qiáng)脾胃的運(yùn)化功能，加強(qiáng)人體對君藥和臣藥熟地黃、制首烏的吸收，使其補(bǔ)氣養(yǎng)血功能增強(qiáng)，所以方中陳皮有著很重要的作用。陳皮藥材的來源五花八門，福橘、大紅袍、溫州蜜柑等多種柑橘植物均可入藥［3-4］。近年來陳皮藥材的價格不斷攀升，為了降低生產(chǎn)成本，陳皮藥材在成藥中出現(xiàn)少用、濫用情況，同時由于品種來源等因素導(dǎo)致陳皮藥材質(zhì)量不穩(wěn)定［5］，尋找一種簡單有效的鑒別方法顯得尤為重要。為了有效地控制制劑質(zhì)量，我們采用薄層色譜法和含量測定法對阿膠益壽口服液中陳皮進(jìn)行了定性定量研究，建立了陳皮簡便、準(zhǔn)確、重復(fù)性好、專屬性強(qiáng)的薄層色譜鑒別方法和質(zhì)量控制方法，用該方法可以控制阿膠益壽口服液的質(zhì)量，結(jié)果滿意，未見文獻(xiàn)報道此方法，現(xiàn)報道如下：

1 儀器與試藥

1.1 實驗儀器瑞士CAMAG薄層成像儀，AUTOMATIC TLC SAMPLER自動點樣儀（瑞士CAMAG公司）；ME204電子天平（萬分之一）（梅特勒-托利多公司）；KQ-500DE數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；GZX-9146MBE電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；GG-6數(shù)顯恒溫水浴鍋（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；METTLER TOLEDO ME204型分析天平（十萬分之一，梅特勒-托利多公司）；昆山KQ-500DE數(shù)控超聲波清洗器（昆山舒美儀器有限公司）；LC-20A島津高效液相色譜儀（日本島津儀器有限公司）；Waters e2695高效液相色譜儀（日本島津儀器有限公司）；HH-6國華數(shù)顯恒溫水浴鍋（日本島津儀器有限公司）；硅膠G薄層板（青島海洋化工廠，規(guī)格：200 mm×100 mm，厚度0.20 mm～0.25 mm）；硅膠G薄層板（Merck公司，規(guī)格：10 cm×20 cm）。

1.2 試藥及試劑人參、炙黃芪、制何首烏、阿膠、熟地黃、陳皮、木香、甘草經(jīng)甘肅省藥品檢驗研究院中藏藥室鑒定為正品，均符合《中華人民共和國藥典》2020年版（一部）項下規(guī)定。橙皮苷對照品（純度：96.2%，批號：110721-201818）、陳皮對照藥材（批號：120696-201510），均購于中國食品藥品檢定研究院；所用試劑均為色譜純；水為超純水。

1.3 分析樣品來源于10個不同企業(yè)的12批次樣品。見表1。

表1 阿膠益壽口服液樣品來源

2 方法與結(jié)果

2.1 定性鑒別陳皮薄層色譜（TLC）鑒別取阿膠益壽口服液10 mL，置分液漏斗中，加乙醚振搖提取2次，每次20 mL，棄去乙醚提取液，再用乙酸乙酯振搖提取3次，每次20 mL，合并乙酸乙酯提取液，置水浴鍋上蒸干，殘渣加甲醇2 mL使完全溶解，作為阿膠益壽口服液樣品溶液。取陳皮對照藥材1 g，加水50 mL，電爐上加熱煮沸30 min，濾過，取續(xù)濾液，同樣品制成方法，制成對照藥材溶液。再取橙皮苷對照品，用甲醇制成每毫升含1 mg的對照品溶液，即得。另取缺少陳皮的阿膠益壽口服液其他樣品，按處方比例和制備工藝，制備缺少陳皮的陰性樣品，照供試品溶液的制備方法，同法制成陰性樣品溶液。依照《中華人民共和國藥典》2020年版（四部）TLC試驗，分別吸取上述供試品溶液、對照品溶液、對照藥材溶液各點樣10μL，點于同一硅膠G薄層板上。以乙酸乙酯-甲醇-濃氨溶液-水（8∶3∶0.7∶1）為展開劑，上行展開，展距約8.5 cm，取出硅膠G板，室溫晾干，噴三氯化鋁試液，晾干，在紫外燈（365 nm）下檢視。結(jié)果顯示，在供試品與對照品和對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯現(xiàn)相同顏色的特征斑點，且陰性對照無干擾，結(jié)果見圖1。

圖1 阿膠益壽口服液樣品薄層色譜圖

2.2 含量測定

2.2.1 色譜條件及適應(yīng)性條件研究色譜柱：十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，安捷倫（Agilent）-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5μm），流動相為甲醇-0.2%磷酸（含0.1%的三乙胺）（35∶65）為流動相，等度洗脫，流速為1.0 mL/min，檢測波長283 nm，柱溫為25℃，進(jìn)樣量為10μL。

2.2.2 供試品溶液的制備方法精密量取阿膠益壽口服液10 mL，置25 mL量瓶中，加甲醇適量，超聲處理樣品溶液30 min，放冷，加甲醇至量瓶刻度線，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.2.3 對照品溶液的制備方法精密稱取橙皮苷對照品（中國食品藥品檢定院，批號：110721-201818）23.60 mg，置100 mL量瓶中，加甲醇至量瓶刻度線，搖勻，即得橙皮苷對照品溶液。

2.2.4 陰性樣品溶液制備方法按阿膠益壽口服液處方中各藥味比例及制備工藝，采用“2.2.2”項下方法制成不含陳皮的陰性對照溶液，即得。

2.2.5 專屬性試驗取橙皮苷對照品溶液、供試品（批號：181203）溶液及陰性樣品溶液，以“2.2.2”橙皮苷含量測定項下的色譜條件進(jìn)行測定，結(jié)果陰性樣品色譜在與混合對照品出峰位置相應(yīng)保留時間處無干擾峰出現(xiàn)，表明陰性樣品無干擾，方法專屬性好，見圖2—4。

圖2 陰性對照溶液色譜圖

圖3 橙皮苷對照品溶液色譜圖

圖4 樣品（181203）溶液色譜圖

2.2.6 線性關(guān)系考察研究按“2.2.2”項下制備方法，精密稱取橙皮苷對照品21.17 mg，置50 mL錐形瓶中，加甲醇至錐形瓶刻度，搖勻，作為貯備液（貯備液濃度0.4073 mg/mL）。精密量取上述貯備液4、2、1、0.5、0.25、0.125 mL，置10 mL錐形瓶中，加甲醇至錐形瓶刻度，精密進(jìn)樣10μL，記錄橙皮苷的峰面積。以橙皮苷對照品進(jìn)樣的量（μg）為橫坐標(biāo)（X），橙皮苷測定的峰面積A為縱坐標(biāo)（Y），進(jìn)行線性回歸分析。結(jié)果顯示橙皮苷的回歸方程為y=2028 574.4357x+36 488.8934，r2=0.999 6，表明橙皮苷在0.025 46～1.629 2μg范圍內(nèi)線性良好。見表2、圖5。

表2 橙皮苷標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)

圖5 橙皮苷標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

2.2.7 精密度試驗研究精密吸取“2.2.3”項下制備好的橙皮苷對照品（濃度20.34μg/mL）溶液，按2.2.1色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，每次進(jìn)樣10μL，記錄6次測定橙皮苷的峰面積，結(jié)果連續(xù)進(jìn)樣6次測得橙皮苷的峰面積RSD為0.3%，由實驗結(jié)果可見所用儀器精密度良好。見表3。

表3 橙皮苷精密度結(jié)果

2.2.8 穩(wěn)定性試驗研究取阿膠益壽口服液（批號：181203）溶液，按照“2.2.2”項下樣品制備方法制樣，分別在0、4、8、12、16、24 h進(jìn)樣10μL，記錄上述時間點測定橙皮苷的色譜峰面積，計算上述6個時間點測得橙皮苷峰面積的RSD為1.0%，由穩(wěn)定性實驗可見阿膠益壽口服液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好，能夠滿足試驗需求。見表4。

表4 阿膠益壽口服液穩(wěn)定性試驗結(jié)果

2.2.9 重復(fù)性試驗按“2.2.2”項中供試品溶液的制備方法，取阿膠益壽口服液（批號：181203），分別制備6份供試品溶液，進(jìn)樣10μL測定。樣品中橙皮苷的RSD為0.72%，試驗結(jié)果表明含量測定方法的重復(fù)性良好。見表5。

表5 重復(fù)性試驗結(jié)果

2.2.1 0加樣回收率試驗精密量取1 mL濃度為0.4073 mg/mL橙皮苷對照品溶液置25 mL量瓶中，用氮?dú)獯蹈扇軇?，精密加入阿膠益壽口服液（批號：181203），按“2.2.2”項下橙皮苷含量測定項下供試品溶液的制備方法制備加樣回收樣品溶液。精密進(jìn)樣l0μL，計算橙皮苷平均回收率為100.25%，RSD值為0.80%，試驗結(jié)果表明，測定方法回收率良好。見表6。

表6 回收率試驗結(jié)果

2.3 樣品測定按“2.2.2”項下的方法制樣，對12批樣品進(jìn)行含量測定，測定結(jié)果：橙皮苷含量在0.0106～0.2272 mg/mL之間，平均0.1209 mg/mL。見表7。

表7 樣品中橙皮苷含量的測定結(jié)果

3 討論

3.1 提取方法和時間橙皮苷含量測定方法中，考察了用超聲提取的方法和加熱水浴回流提取的兩種常見方法，量?。ň埽?份樣品，每份樣品10 mL，置25 mL的量瓶中，加適量甲醇溶液，超聲時間為10、20、30、40、50、60 min，或70℃加熱回流0.5、1、2 h后分別測定橙皮苷的含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，回流和超聲效率相近，但用超聲的方法處理更加簡捷、高效，且較容易操作，所以選用超聲提取法為樣品制備方法，這與文獻(xiàn)報道一致。超聲處理10 min提取峰面積最小，超聲20 min的峰面積與超聲處理30 min的峰面積相比，稍微小一些，超聲處理30、40、50、60 min的峰面積和超聲處理30 min的峰面積基本一致，在提取效果近似相同的情況下，為使試驗過程更精簡，更環(huán)保、更經(jīng)濟(jì)，選用超聲30 min為提取時間。

3.2 色譜條件的確定取阿膠益壽口服液和橙皮苷對照品，在190～400 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，結(jié)果表明，橙皮苷在220、280、283、284、300 nm都有吸收，參考《中華人民共和國藥典》2020年版陳皮品種項下橙皮苷的測定方法及相關(guān)文獻(xiàn)，最后選擇283 nm為檢測波長。在此檢測波長下對照品和樣品都能得到較好的圖譜。參考《中華人民共和國藥典》2020年版陳皮品種及有關(guān)文獻(xiàn)［2-14］，考察了兩種流動相：1）甲醇為流動相A，0.2%的磷酸（含0.1%的三乙胺）為流動相B，甲醇：0.2%的磷酸（含0.1%的三乙胺）為（35∶65），等度洗脫；2）乙腈為流動相A，0.2%的磷酸（含0.1%的三乙胺）為流動相B，乙腈：0.2%的磷酸（含0.1%的三乙胺）為（35∶65），等度洗脫。對測定結(jié)果進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，當(dāng)采用甲醇∶0.2%的磷酸（含0.1%的三乙胺）（35∶65）為流動相進(jìn)行洗脫時，得到較好的峰形和分離度。

3.3限度規(guī)定12批樣品中橙皮苷的含量在0.0106～0.227 2 mg/mL之間，均值0.109 2 mg/mL，均值的80%為0.096 72 mg/mL。《中華人民共和國藥典》2020年版（一部）陳皮項下橙皮苷的含量規(guī)定為3.5%，本品處方中共有陳皮254 g，入制劑調(diào)整為10 000 mL，按藥材含量折算，每1 mL的含量為0.889 mg，該值遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于12批樣品中的含量的限度值，這與本品中橙皮苷的提取方式和本品的生產(chǎn)工藝有關(guān)，所以不能參考《中華人民共和國藥典》2020年版（一部）陳皮項下的含量限度制定本品每1 mL橙皮苷的限度值。應(yīng)以12批樣品含量平均值的80%作為橙皮苷含量的限度值，含量低于該值的企業(yè)有4家，其中2家企業(yè)含量遠(yuǎn)低于測量平均值，嚴(yán)重影響限度的制定，為了更科學(xué)地制定橙皮苷的含量限度值，不考慮這2家企業(yè)對12批樣品含量合格率的影響，所以以此值作為本品中橙皮苷的含量限度值，擬定本品中含陳皮以橙皮苷計，每1 mL不低于90μg。

阿膠益壽口服液現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中僅有一個化學(xué)鑒別項和常規(guī)檢查項，不能有效控制制劑質(zhì)量，本研究依據(jù)《中華人民共和國藥典》2020年版（一部）藥材項下相關(guān)方法并結(jié)合文獻(xiàn)［6-9］，建立了陳皮的薄層色譜鑒別方法和含量測定方法，該方法用陳皮對照藥材和橙皮苷兩個對照物質(zhì)控制處方中陳皮藥材，色譜圖斑點清晰，分離度好，陰性無干擾，有效地控制了中成藥中只加提取物而不用藥材的可能，杜絕了中藥制劑的不法添加。在定性鑒別中，參考《中華人民共和國藥典》2020年版（一部）藥材項下含量測定方法及相關(guān)文獻(xiàn)［10-14］，建立了制劑中橙皮苷的含量測定方法，該方法簡便、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好，可為阿膠益壽口服液中質(zhì)量控制提供參考，為安全用藥和有力監(jiān)管制劑質(zhì)量提供科學(xué)依據(jù)。

由于傳統(tǒng)觀念認(rèn)為陳皮其功效品質(zhì)“陳久者良”，但歷代本草對其陳化年限語焉不詳，文獻(xiàn)報道也不多，但是陳皮的“陳”是有限度的［15-16］。特別是廣陳皮，不同儲藏期的廣陳皮揮發(fā)油成分在物質(zhì)種類上基本一致，但在含量上大有不同［17-18］，這將是之后研究的重點。所以建議企業(yè)在選料投料中，能夠理智地選擇藥材，不要盲目地認(rèn)為陳皮越久越好，從而選擇年份久的陳皮入藥。