孫玲偉， 何孟纖， 戴建軍， 吳彩鳳， 張德福， 林月霞

（上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，上海 201106）

我國綿羊和山羊的飼養(yǎng)量、出欄量、肉產(chǎn)量、皮產(chǎn)量和絨產(chǎn)量均居世界前列。原產(chǎn)于我國太湖流域的湖羊，具有易舍飼、早熟、四季發(fā)情、一年二胎且多羔等優(yōu)良性狀，越來越受到市場青睞[1]。生產(chǎn)中，往往由于其多胎性易造成妊娠期營養(yǎng)攝取不足，導(dǎo)致新生羔羊出現(xiàn)宮內(nèi)生長受限（intrauterine fetal growth restriction, IUGR）[2]。IUGR是胎兒在母體內(nèi)發(fā)育障礙的總稱，主要指新生兒的出生體質(zhì)量低于同孕齡平均出生體質(zhì)量的2個標(biāo)準(zhǔn)差或低于10%，主要表現(xiàn)為新生兒體質(zhì)量和組織器官輕，肌肉系統(tǒng)、胃腸道系統(tǒng)或其他組織器官形態(tài)和功能發(fā)育不完善，不僅嚴(yán)重影響動物的健康，也給畜牧生產(chǎn)造成極大的損失[3]。IUGR一直是哺乳動物常見的產(chǎn)科并發(fā)癥之一，且多胎動物的發(fā)生概率高于單胎動物，生產(chǎn)中綿羊和豬的IUGR 現(xiàn)象尤為嚴(yán)重[4]。IUGR 新生羔羊往往自身體質(zhì)較差、生命力弱，不僅增加羊場管理難度，也易引起母羊繁殖和飼料資源的浪費(fèi)。針對IUGR，目前主要關(guān)注其對胎兒或新生兒組織器官的影響，或IUGR 的早期診斷和治療[5-6]。然而，新生兒的營養(yǎng)代謝是個復(fù)雜的動態(tài)系統(tǒng)，涉及多種物質(zhì)的代謝進(jìn)程，需要全景式地展現(xiàn)體內(nèi)代謝變化，且IUGR 新生羔羊與健康羔羊間的代謝區(qū)別也尚需深入研究。

作為代謝組學(xué)的主要技術(shù)平臺之一，一維氫譜核磁共振（proton nuclear magnetic resonance spectra ，1H-NMR）能夠?qū)ι锏难?、尿液、乳汁等體液以及多種器官組織樣本進(jìn)行分析，將正常生理狀態(tài)與病理狀態(tài)下多種小分子代謝物的表達(dá)差異進(jìn)行分析，并對物質(zhì)進(jìn)行分離和鑒定，進(jìn)一步通過生物信息學(xué)方法將研究中相關(guān)的外源性或內(nèi)源性影響因素相結(jié)合，從而建立一定的生物學(xué)聯(lián)系[7]。1H-NMR 技術(shù)可以在同一時間得到多種分子信息，不僅檢測樣品需要量少，且具有良好的檢測重現(xiàn)性。目前，1H-NMR 已被廣泛應(yīng)用于生物的代謝輪廓、藥物的作用機(jī)理、疾病的早期預(yù)防和診斷等多學(xué)科領(lǐng)域。Dessi 等[8]指出，新生兒的代謝異常可以通過應(yīng)用該技術(shù)全景式地闡釋代謝異常 過 程 。Sanz-Cortés 等[9]也 通 過1H-NMR 揭 示 了IUGR 新生兒臍靜脈血漿的特征性代謝變化。盡管已有許多關(guān)于新生兒的代謝組學(xué)研究報道，但有關(guān)綿羊新生IUGR 羔羊的血液代謝組較少。因此，本研究擬應(yīng)用1H-NMR 技術(shù)分析IUGR 新生羔羊的血液樣品，旨在篩選IUGR 羔羊的特征性代謝物，從而全面了解IUGR 引起新生羔羊的機(jī)體代謝變化，對提高湖羊生產(chǎn)和繁殖性能具有積極的意義。

1 材料與方法

1.1 供試材料

本試驗(yàn)在上海市永輝羊業(yè)有限公司開展，選?。?0.43±0.23）月齡和體質(zhì)量（42.29±3.78）kg 的2～3 胎經(jīng)產(chǎn)母羊，分別于 2021年 1—6月采集其分娩記錄以及新生活羔體質(zhì)量，計(jì)算所有健康新生羔羊的平均體質(zhì)量和標(biāo)準(zhǔn)差，以出生質(zhì)量低于平均體質(zhì)量2個標(biāo)準(zhǔn)差作為標(biāo)準(zhǔn)[10]選擇IUGR 羔羊。2018年7月，通過對適齡母羊進(jìn)行同期發(fā)情與人工授精技術(shù)，隨機(jī)選取正常出生體質(zhì)量羔羊（normal birth weight，NBW 組）和IUGR 羔羊（IUGR組）各7只。

1.2 樣品制備

新生羔羊按照體質(zhì)量分為NBW組和IUGR組，在出生1 h 內(nèi)采集其頸動脈血液樣品，于室溫、3 000 r·min-1離心 10 min 后，將分離的血漿樣品分裝后貯存于-80°C冰箱待測。

將樣品在室溫下解凍后，每份取400 μL 血漿樣品中加入重水 200 μL（含 0.05% TSP），渦旋震蕩 30 s，4 °C、12 000 r·min-1離心 10 min。最后取550 μL上清液至5 mm 核磁共振管，待樣品充分平衡后進(jìn)行下一步檢測。

1.3 樣品1H NMR分析

將所有樣品應(yīng)用600 MHz超導(dǎo)核磁共振譜儀（德國布魯克公司）采集數(shù)據(jù)。使用自旋回波模塊采集小分子信息，使用脈沖序列采用預(yù)飽和模塊壓制血漿樣品中的水峰[11]。檢測譜寬8 000 Hz，掃描64 次，弛豫延遲2 s，采集自由感應(yīng)衰減信號96次，采樣間隔時間40 s。

1.4 1H-NMR數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用MestReNova 軟件對獲得的1H-NMR 譜進(jìn)行傅里葉自動變換，對每個樣品進(jìn)行相位和基線調(diào)整；對每個樣品的譜圖進(jìn)行峰對齊，將TSP的化學(xué)位移定標(biāo)（δ 0.00）[12]。通過 R 軟件包（http://cran.r-project.org/）進(jìn)行自動積分，積分區(qū)間 δ 為0.40～8.50，以δ 0.002 為積分間距，去除殘余的水峰（δ 4.16～6.69）。最后，對譜圖進(jìn)行分段積分，將其進(jìn)行歸一化校正，用于下一步分析。

應(yīng)用 SIMCA-P+軟件（V12.0 Umetrics AB，Umea,Sweden）對上述標(biāo)準(zhǔn)化處理的1H-NMR數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析（principal component analysis，PCA）和偏最小二乘判別分析（partial least squares discriminant analysis，PLS-DA），并進(jìn)行驗(yàn)證。

1.5 代謝物鑒定與通路分析

將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Chenomx NMR Suite 軟件（Chenomx Inc.,Edmonton,Canada）進(jìn)行譜圖歸屬，選定匹配好峰行和位移的化合物與商業(yè)數(shù)據(jù)庫（http://www.hmdb.ca 和 http://www.bmrb.wisc.edu）進(jìn)行比對，確定檢測的代謝物。將篩選到的NBW組與IUGR 組差異代謝物在KEGG（https://www.kegg.jp/）數(shù)據(jù)庫進(jìn)行代謝通路的檢索。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 13.0 軟件對2 組新生羔羊體質(zhì)量和1H-NMR 譜圖檢測的所有差異代謝物的峰面積平均值進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（Mean±SEM）表示，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 IUGR新生羔羊體質(zhì)量的變化

測定NBW 組羔羊體質(zhì)量為（3.25±0.14）kg，IUGR 組體質(zhì)量為（2.54±0.23）kg，IUGR 組新生羔羊的體質(zhì)量比NBW 組羔羊低21.85%，說明2組新生羔羊體質(zhì)量差異顯著（P＜0.05），符合IUGR的定義，可用于進(jìn)行后續(xù)分析。

2.2 血漿樣品的1H-NMR譜圖分析

NBW 組和IUGR 羔羊血液樣品分別進(jìn)行1H-NMR 譜的測定，經(jīng)手動調(diào)相、基線校正和譜峰對齊及定標(biāo)，得到血漿樣本的核磁圖譜。圖1為NBW組和IUGR組新生羔羊血漿樣品中具有代表性的1H-NMR 譜。譜圖中所有信號峰包含在δ 0.40～4.15和δ 6.70～8.50，為消除殘余水峰、尿素峰的影響，去掉δ 4.16～6.69 積分區(qū)間。其中，δ 6.70～8.50的區(qū)域是相對于δ 0.40～4.15的區(qū)域放大40倍以后的譜圖。

圖1 NBW組和IURG組血漿樣品代表性的600 MHz 1H-NMR圖譜Fig.1 Representative 600 MHz 1H NMR spectra of plasma samples from NBW and IURG groups

根據(jù)1H-NMR 化學(xué)位移譜庫、共享數(shù)據(jù)庫（KEGG、HMDB、METLIN）和組內(nèi)自建數(shù)據(jù)庫，對2 組血漿樣品中所含代謝物進(jìn)行歸屬和確認(rèn)，共指認(rèn)出32 種代謝物，主要包括糖類物質(zhì)（α-葡萄糖、β-葡萄糖、乳酸、乙酸鹽、N-乙酰甘露糖胺、檸檬酸、異檸檬酸）、氨基酸類物質(zhì)（亮氨酸、纈氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、酪氨酸、N-乙酰半胱氨酸、1-甲基組氨酸、3-甲基組氨酸、苯丙氨酸、脲基丙酸、肌肽、甜菜堿、尿甘酸）和脂類物質(zhì)（1-低密度脂蛋白/極低密度脂蛋白、3-羥丁酸、2-羥基異戊酸酯、磷酸膽堿、甲酸、肌酸、膽堿、甘油磷酸膽堿、2-異戊酸、丙酮、丙二酸）。

比較2 組代謝指紋波譜可見，某些化學(xué)位移值處波峰水平有明顯差異，表明2 組血漿代謝產(chǎn)物成分有明顯差異。由于檢測代謝物的峰值多，眼觀并不是分析不同組之間差異的有效手段，所獲取的信息非常有限。為了更完整地揭示2 組血漿樣品的變化，需釆用多變量統(tǒng)計(jì)方法對復(fù)雜的數(shù)據(jù)作進(jìn)一步分析。

2.3 多元統(tǒng)計(jì)分析

2.3.1 PCA 分析 本研究首先將2 組1H-NMR 數(shù)據(jù)采用非監(jiān)督的多維統(tǒng)計(jì)方法進(jìn)行建模，觀測樣品的總體代謝變化。PCA 分析后，獲得2個主成分，其中第1主成分（PC1）解釋原始數(shù)據(jù)中最大的變量，第 2 主成分（PC2）可以解釋第2 大變量，每個點(diǎn)表示1個樣本。PC1 和PC2 解釋率分別為50.29% 和18.11%，累計(jì)解釋率為68.40%。從PCA得分（圖2）可以看出，NBW 組和IUGR組樣本點(diǎn)明顯分離，分布區(qū)域完全分開，且具有分別向左上和右下分離的趨勢，代謝譜區(qū)別明顯。這說明2 組間差異在羔羊血漿代謝組層面得到一定體現(xiàn)，提示相對于健康新生羔羊，IUGR 羔羊的血液代謝譜發(fā)生了改變。為進(jìn)一步放大各組間的差異，采用PLS-DA 找到與IUGR 發(fā)生密切相關(guān)的代謝產(chǎn)物。

圖2 NBW組和IUGR組新生羔羊血漿樣品的PCA得分Fig.2 PCA score of plasma form newborn lambs in the NBW group and the IUGR group

2.3.2 PLS-DA 分析 PLS-DA 是一種多因變量對多自變量的回歸建模方法，在代謝組學(xué)中主要用于回歸建模，是模型變量篩選的有效工具。相對于PCA 可以獲得更好的分類效果。利用PLS-DA采用PLS-DA 提取矩陣X（1H-NMR 數(shù)據(jù)）中的相關(guān)信息，預(yù)測變量Y（分組信息）的值，模型的模解釋度（R2Y）是84%，預(yù)測度（Q2）是64%。由圖3可見，2 組沿t[1]軸顯著分開，呈現(xiàn)最大化分離，而NBW組與IUGR組內(nèi)部樣品比較集中，說明組內(nèi)代謝差異較小。之后，對PLS-DA 模型進(jìn)行500 次的排列驗(yàn)證，Q2和R2的回歸線分別與y軸交點(diǎn)在負(fù)半軸和正半軸，且Q2和R2在最右端接近，說明該試驗(yàn)的數(shù)據(jù)模型建立成功，即2組新生羔羊的血漿樣品的代謝物存在顯著差異。

圖3 2組新生羔羊血漿樣品的PLS-DA分析Fig.3 PLS-DA plot of newborn lambs in the NBW and the IUGR groups

2.4 差異代謝物與代謝通路分析

為進(jìn)一步分析NBW組與IUGR組新生羔羊的血液代謝組差異，對與IUGR 疾病相關(guān)的差異代謝物進(jìn)行篩選，獲得2 組間差異表達(dá)的代謝物共16個（表1）。與健康新生羔羊?qū)Ρ?，IUGR 羔羊血漿中多個代謝物濃度發(fā)生改變，主要涉及脂代謝、氨基酸代謝、糖代謝等多條代謝通路。相較于NBW 羔羊，IUGR 羔羊血漿中多種脂代謝物均出現(xiàn)變化，主要包括低密度/極低密度脂蛋白（LDL/VLDL）、2-羥基異戊酸、膽堿、磷酸膽堿和甘油磷酸膽堿的表達(dá)上調(diào)，以及異戊酸的表達(dá)下調(diào)。IUGR 羔羊血漿中多種氨基酸和糖類含量均顯著降低，主要包括葡萄糖、乳酸、亮氨酸、纈氨酸、丙氨酸、酪氨酸、3-甲基組氨酸和N-乙酰半胱氨酸，進(jìn)一步揭示IUGR 胎兒機(jī)體內(nèi)氨基酸來源不足或利用增加。

表1 1H-NMR檢測的兩組間有顯著變化的代謝物峰強(qiáng)度Table 1 Peak intensity of significantly changed metabolites between the two groups based on 1H-NMR

3 討論

人類和動物流行病學(xué)研究證實(shí)，由于胎兒在母體內(nèi)出現(xiàn)營養(yǎng)失衡（營養(yǎng)不足/過多）或代謝紊亂引發(fā)IUGR，會對其出生后的兒童和成年時期產(chǎn)生持續(xù)的影響，例如出現(xiàn)糖尿病、心血管疾病、神經(jīng)精神疾病的發(fā)病風(fēng)險[13]。目前，臨床上IUGR預(yù)斷和治療方法皆存在不足，例如確診時間晚、準(zhǔn)確性不高或治療效果差等，均會對母體和胎兒造成不利影響等。因此，掌握IUGR 的發(fā)生機(jī)制，從而獲得準(zhǔn)確性高的診斷方法和治療方式非常重要。本研究應(yīng)用代謝組學(xué)的1H-NMR 檢測平臺分析IUGR 新生羔羊的血液代謝組，結(jié)果顯示，與健康新生羔羊?qū)Ρ龋琁UGR羔羊血漿中多個代謝物濃度發(fā)生改變，主要涉及脂代謝、氨基酸代謝、糖和能量代謝等多條代謝通路。

3.1 脂代謝分析

宮內(nèi)生長的胎兒需要將獲得的營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)化為脂肪組織，以保證出生的存活；同時，也將脂類物質(zhì)轉(zhuǎn)化為能量物質(zhì)，為其在宮內(nèi)生長代謝提供能源。以往研究證實(shí)，IUGR胎兒在宮內(nèi)脂肪合成出現(xiàn)抑制，引發(fā)脂質(zhì)代謝紊亂[15]。

LDL 和VLDL 分別是機(jī)體內(nèi)運(yùn)輸內(nèi)源性甘油三酯和膽固醇的主要形式，IUGR胎兒的臍靜脈血中LDL/VLDL 含量均高于健康新生兒，主要原因可能是由于機(jī)體內(nèi)營養(yǎng)不足，引發(fā)體內(nèi)脂質(zhì)被過度動員分解[16]。膽堿及其膽堿化合物（磷酸膽堿和甘油磷酸膽堿）是哺乳動物細(xì)胞雙層膜的主要組成物質(zhì)，本研究中IUGR 組羔羊膽堿及其膽堿化合物含量升高，表明細(xì)胞對其攝取減少而堆積在血漿中，這些改變可能引起細(xì)胞膜損傷或細(xì)胞增殖合成減慢，進(jìn)一步引發(fā)某些器官生長發(fā)育受限[17]。2-羥基異戊酸是一種有機(jī)酸，在機(jī)內(nèi)氧化應(yīng)激狀態(tài)下會升高，新生兒大腦發(fā)育異常與機(jī)體內(nèi)2-羥基異戊酸的異常升高有關(guān)，也進(jìn)一步提示，在IUGR新生羔羊可能會出現(xiàn)大腦發(fā)育異常[18]。

3.2 氨基酸代謝分析

氨基酸是胎兒生長發(fā)育的重要營養(yǎng)底物，一方面用于合成蛋白質(zhì)進(jìn)行供能，另一方面競爭性合成葡萄糖。宮內(nèi)胎兒氨基酸物質(zhì)的獲得主要通過胎盤和胎兒間存在氨基酸的水平梯度，由母體通過胎盤轉(zhuǎn)運(yùn)至胎兒血液[19]。研究顯示，IUGR 胎兒由于機(jī)體內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)不足，胎兒會優(yōu)先動員自身體內(nèi)氨基酸轉(zhuǎn)化為能量和糖類物質(zhì)，以滿足自身的生長需求[20]。

亮氨酸、纈氨酸和丙氨酸屬于升糖氨基酸，也被證明機(jī)體通過額外補(bǔ)充，能夠促進(jìn)胎兒宮內(nèi)的葡萄糖水平[21]。亮氨酸是機(jī)體的必需氨基酸，在蛋白質(zhì)和能量代謝、緩解氧化應(yīng)激以及機(jī)體免疫力等方面具有重要作用。此外，機(jī)體內(nèi)的亮氨酸也能通過胰島素依賴機(jī)制進(jìn)一步增強(qiáng)葡萄糖攝取能力。Fowden 等[22]研究也表明，IUGR 仔豬中亮氨酸水平顯著降低。纈氨酸作為哺乳動物體內(nèi)的主要支鏈氨基酸之一，其通過氧化分解而產(chǎn)生能量的效率比非支鏈氨基酸高[23]。丙氨酸是葡萄糖代謝途徑中的重要調(diào)節(jié)劑，也能夠作為原料通過丙酮酸轉(zhuǎn)化產(chǎn)生能量。本研究中IUGR組的纈氨酸和丙氨酸含量低于對照組，表明新生羔羊機(jī)體由于營養(yǎng)不良，過量分解氨基酸用于維持自身能量需求。作為酪胺、多巴胺、腎上腺素和去甲腎上腺素等多種蛋白質(zhì)合成和能量產(chǎn)生的重要基質(zhì)，酪氨酸在胎兒發(fā)育中調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)功能，同時也在應(yīng)激中具有一定作用[24-25]。本研究中酪氨酸含量的降低，說明羔羊由于IUGR阻礙了神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育。

目前，3-甲基組氨酸已經(jīng)被證明與丙酸血癥等多種先天性代謝病相關(guān)，且其含量在臨床中也被作為肌肉蛋白質(zhì)分解速率的指標(biāo)[26]。以往的研究中也證實(shí)了通過檢測3-甲基組氨酸在羊水中的水平，可以作為人類IUGR的產(chǎn)前檢測指標(biāo)[27]。

3.3 糖和能量代謝分析

糖類物質(zhì)是哺乳動物胎兒在宮內(nèi)發(fā)育的重要營養(yǎng)元素。葡萄糖是胎兒在宮內(nèi)維持細(xì)胞能量代謝的重要原料，對胎兒組織器官的生長發(fā)育具有重要作用[28]。胎兒宮內(nèi)生長發(fā)育所需的葡萄糖主要是通過母體和胎兒兩者中的葡萄糖含量梯度，完成母體-胎盤-胎兒的運(yùn)輸。胎兒在生長發(fā)育過程中通過胎盤攝取的外源性葡萄糖含量不足時，會通過內(nèi)源性葡萄糖生成系統(tǒng)，分解自身儲備的營養(yǎng)物質(zhì)為糖原，以維持自身的葡萄糖含量[29]。乳酸是機(jī)體維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的信號分子，也是機(jī)體內(nèi)能量平衡和組織含氧量的評價指標(biāo)之一[30]。當(dāng)機(jī)體內(nèi)葡萄糖含量不足時，乳酸能夠由乳酸脫氫酶轉(zhuǎn)化為丙酮酸，之后通過糖異生途徑進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為葡萄糖，為機(jī)體提供能量。本研究結(jié)果說明，羔羊由于營養(yǎng)不良，已經(jīng)出現(xiàn)體內(nèi)糖代謝紊亂，且由于葡萄糖含量降低，大量的乳酸也被用于合成葡萄糖。

3.4 氧化應(yīng)激代謝分析

哺乳動物因營養(yǎng)或其他外界因素導(dǎo)致體內(nèi)氧化和抗氧化系統(tǒng)失衡，機(jī)體會產(chǎn)生大量活性氧自由基，而過量的自由基蓄積導(dǎo)致機(jī)體無法清除時，會造成氧化應(yīng)激。哺乳動物胎兒宮內(nèi)生長發(fā)育不良不僅會引起糖類、脂類、氨基酸類等多種物質(zhì)代謝的變化，也會引起胎兒的抗氧化能力下降[31]。張崇志等[32]報道，過IUGR會引發(fā)綿羊胎兒的氧化應(yīng)激，影響其肝臟等組織器官的生長發(fā)育。本研究中，IUGR 羔羊血漿中N-乙酰半胱氨酸含量均顯著低于NBW 羔羊，而IUGR 組甜菜堿含量顯著高于NBW 組。N-乙酰半胱氨酸是L-半胱氨酸的衍生物，也是機(jī)體內(nèi)形成抗氧化劑谷胱甘肽的前體，對細(xì)胞的抗氧化和抗炎癥均具有重要作用[33]。IUGR羔羊的N-乙酰半胱氨酸降低，說明機(jī)體由于IUGR，發(fā)生氧化應(yīng)激增多，而N-乙酰半胱氨酸作為“抗氧化劑”被過多的消耗。以往研究也顯示，N-乙酰半胱氨酸的處理能夠改善由脂多糖誘導(dǎo)的小鼠胎兒IUGR，并提高胎兒存活率[34]。甜菜堿，又稱為N,N,N-三甲基甘氨酸，是機(jī)體內(nèi)的甲基化供體，而胎兒的甲基化進(jìn)程等表觀遺傳修飾能夠指導(dǎo)重構(gòu)胚胎的正常發(fā)育[35]。本研究中，IUGR 組羔羊甜菜堿的血漿濃度顯著升高，可能影響了胎兒在宮內(nèi)的生長發(fā)育及胎盤分化。

基于代謝組學(xué)技術(shù)的1H-NMR 檢測方法能夠全面反映健康羔羊與IUGR 羔羊的血液代謝輪廓。本研究通過檢測與數(shù)據(jù)的生物信息學(xué)分析結(jié)合，鑒別了IUGR 羔羊血液一些潛在的小分子代謝輪廓，為復(fù)雜的IUGR 發(fā)病機(jī)理與診療提供了新的方向。試驗(yàn)結(jié)果顯示，IUGR羔羊的血液代謝主要涉及氨基酸、糖類、脂類物質(zhì)等代謝通路。該結(jié)果有助于更好地理解IUGR 發(fā)生機(jī)理，并為進(jìn)一步尋找IUGR診斷標(biāo)示物提供了理論基礎(chǔ)。