尚耀民，邢寶春?，胡旭，周曉蕾，梁瑞霞，張一

（1.河南省胸科醫(yī)院，河南 鄭州 450000；2.河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450000）

呼吸道合胞病毒（RSV）是引起下呼吸道感染的主要病原體，可引起病毒性肺炎，其中支氣管上皮細(xì)胞是RSV感染的主要場(chǎng)所。RSV感染呼吸道上皮細(xì)胞后誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生大量細(xì)胞因子，引起上皮細(xì)胞損傷，誘導(dǎo)氣道上皮屏障功能出現(xiàn)障礙，從而導(dǎo)致支氣管炎、肺炎、哮喘等呼吸道疾病的發(fā)生［1-4］。目前針對(duì)RSV感染尚無(wú)安全有效的特異性防治措施及特效藥物，而研究表明中醫(yī)藥對(duì)呼吸道病毒的抑制作用明顯，可減輕炎癥反應(yīng)，改善肺功能［5-6］。阿爾泰金蓮花是毛茛科金蓮花屬多年生草本植物，金蓮花與其是同屬植物，其所含的黃酮類(lèi)成分有抗氧化、抗炎、抗病毒的活性［7-8］。研究發(fā)現(xiàn)，阿爾泰金蓮花總黃酮提取物可能通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)、抗氧化損傷對(duì)大氣細(xì)顆粒物（PM2.5）誘導(dǎo)的BEAS-2B 細(xì)胞急性損傷具有一定的保護(hù)作用［9］。阿爾泰金蓮花總黃酮對(duì)PM2.5 致大鼠肺纖維化也有一定的防治作用［10］。但阿爾泰金蓮花總黃酮對(duì)RSV 感染支氣管上皮細(xì)胞分子機(jī)制尚不清楚。研究發(fā)現(xiàn)，重癥肺炎患兒中miR-23b-3p 低表達(dá)［11］，miR-23b-3p 靶向PALM3 抑制肺炎鏈球菌誘導(dǎo)的A549 細(xì)胞損傷［12］，說(shuō)明miR-23b-3p 與肺部炎癥反應(yīng)有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)旨在研究阿爾泰金蓮花總黃酮對(duì)RSV 感染支氣管上皮細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)的影響及是否與miR-23b-3p 有關(guān)，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

人支氣管上皮細(xì)胞16-HBE、呼吸道合胞病毒（RSV）（深圳市豪地華拓生物科技有限公司）；DMEM培養(yǎng)基（江蘇齊氏生物科技有限公司，批號(hào)：CB3955688）；CCK-8 試劑盒（批號(hào)：CA1210）、凋亡檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：G1120）（北京索萊寶科技有限公司）；蛋白裂解液（上海貝博生物科技有限公司，批號(hào)：BB-3201）；TNF-α ELISA 試劑盒（批號(hào)：E-EL-H0109c）、IL-6 ELISA 試劑盒（批號(hào)：E-EL-H6156）、IL-1α ELISA 試劑盒（批號(hào)：E-EL-H0088c）（武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司）；熒光定量PCR試劑盒［天根生化科技（北京）有限公司，批號(hào)：FP402-02］。

1.2 阿爾泰金蓮花總黃酮的制備

阿爾泰金蓮花藥材購(gòu)自新疆藥材市場(chǎng)。取適量干燥阿爾泰金蓮花藥材，加30倍體積70%乙醇，加熱、回流2 次，1.5 h/次，收集2 次濾液，蒸干后用培養(yǎng)基定容，配置成實(shí)驗(yàn)所需濃度備用。

1.3 細(xì)胞處理與分組

16-HBE 細(xì)胞用DMEM 培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)，用呼吸道合胞病毒（RSV）感染16-HBE細(xì)胞作為RSV組，正常培養(yǎng)的細(xì)胞作為NC 組；分別用8.0、16.0、32.0 μg/mL的阿爾泰金蓮花總黃酮處理RSV 感染的16-HBE 細(xì)胞，記為RSV+低、中、高劑量組；將miR-23b-3p 模擬物及陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染至RSV 感染的16-HBE 細(xì)胞，記為RSV+miR-23b-3p 組、RSV+miR-NC 組；將miR-23b-3p 抑制劑及陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染至RSV 感染的16-HBE 細(xì)胞后用32.0 μg/mL 的阿爾泰金蓮花總黃酮處理，記為anti-miR-23b-3p+RSV+高劑量組、anti-miR-NC+RSV+高劑量組。

1.4 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞活性

各組培養(yǎng)48 h 細(xì)胞，加10 μL CCK-8 試劑，孵育2 h，酶標(biāo)儀檢測(cè)各組細(xì)胞450 nm吸光度值（A）。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h，預(yù)冷PBS漂洗，與500μL的結(jié)合緩沖液混勻；先加10μL Annexin V-FITC，再加5μL PI，避光孵育10 min；流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.6 Western blot法檢測(cè)蛋白表達(dá)

提取細(xì)胞總蛋白，定量后進(jìn)行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)移至PVDF，封閉后加CyclinD1、Cleaved Caspase-3、Bax一抗，4 ℃孵育過(guò)夜，加二抗室溫孵育2 h，曝光顯影，定影，測(cè)定蛋白條帶的灰度值。

1.7 ELISA法檢測(cè)TNF-α、IL-6、IL-1α水平

各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后取上清測(cè)定TNF-α、IL-6、IL-1α水平，具體按照試劑盒操作進(jìn)行檢測(cè)。

1.8 RT-qPCR法檢測(cè)miR-23b-3p表達(dá)水平

提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，每個(gè)樣品重復(fù)3次，相對(duì)表達(dá)量采用2-△△Ct法計(jì)算。miR-23b-3p 上游引物：5'-CAGGCAAGATGCTGTT GCA-3'，下游引物：5'-GCGAGCACAGAATTAATACGA CTC-3'。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料用±s表示，兩組比較行t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞活性和凋亡情況比較

RSV 組細(xì)胞活性較NC 組降低，凋亡率較NC 組升高（P＜0.01）；RSV+低、中、高劑量組細(xì)胞活性較RSV組升高，凋亡率較RSV組降低（P＜0.01）。見(jiàn)圖1，表1。

表1 各組細(xì)胞活性和凋亡情況的比較（±s）

表1 各組細(xì)胞活性和凋亡情況的比較（±s）

注：與NC組比較，*P ＜0.01；與RSV組比較，#P ＜0.01。

凋亡率（%）8.04±0.61 23.94±2.06**17.93±1.51##11.86±1.02##8.94±0.73##組別NC組RSV組RSV+低劑量組RSV+中劑量組RSV+高劑量組n 9 9 9 9 9 A值1.083±0.09 0.536±0.05**0.691±0.06##0.836±0.08##1.061±0.10##

2.2 各組細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)情況比較

RSV 組CyclinD1 表達(dá)水平較NC 組降低，Cleaved Caspase-3、Bax 表達(dá)水平較NC 組升高（P＜0.01）；RSV+低、中、高劑量組CyclinD1 表達(dá)水平較RSV 組升高，Cleaved Caspase-3、Bax 表達(dá)水平較RSV 組降低（P＜0.01）。見(jiàn)圖2，表2。

表2 各組細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)的比較（±s）

表2 各組細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)的比較（±s）

注：與NC組比較，**P ＜0.01；與RSV組比較，##P ＜0.01。

組別CyclinD1 Bax NC組RSV組RSV+低劑量組RSV+中劑量組RSV+高劑量組n 9 9 9 9 9 0.32±0.03 0.72±0.07**0.61±0.05##0.45±0.04##0.40±0.04##0.83±0.08 0.39±0.03**0.51±0.05##0.68±0.06##0.80±0.08##Cleaved Caspase-3 0.44±0.04 0.93±0.09**0.81±0.07##0.65±0.06##0.48±0.04##

2.3 各組細(xì)胞炎癥因子表達(dá)情況比較

RSV 組TNF-α、IL-6、IL-1α 水平較NC 組升高（P＜0.01）；RSV+低、中、高劑量組TNF-α、IL-6、IL-1α水平較RSV組降低（P＜0.01）。見(jiàn)表3。

表3 各組細(xì)胞炎癥因子表達(dá)的比較（±s）

表3 各組細(xì)胞炎癥因子表達(dá)的比較（±s）

注：與NC組比較，**P ＜0.01；與RSV組比較，##P ＜0.01。

IL-1α（pg/mL）136.94±11.65 248.73±21.04**209.56±16.15##159.75±12.64##124.31±9.68##組別NC組RSV組RSV+低劑量組RSV+中劑量組RSV+高劑量組n 9 9 9 9 9 TNF-α（pg/mL）51.96±4.62 217.93±18.56**176.94±15.33##129.73±11.03##89.67±7.56##IL-6（pg/mL）89.03±8.14 193.66±17.54**154.71±14.03##119.63±10.16##93.24±8.75##

2.4 各組細(xì)胞miR-23b-3p表達(dá)情況比較

RSV 組miR-23b-3p 表達(dá)水平較NC 組降低（P＜0.01）；RSV+低、中、高劑量組miR-23b-3p 表達(dá)水平較RSV組升高（P＜0.01）。見(jiàn)表4。

表4 各組細(xì)胞miR-23b-3p表達(dá)情況比較（±s）

表4 各組細(xì)胞miR-23b-3p表達(dá)情況比較（±s）

注：與NC組比較，**P ＜0.01；與RSV組比較，##P ＜0.01。

miR-23b-3p 1.00±0.11 0.41±0.04**0.57±0.05##0.72±0.07##0.92±0.09##組別NC組RSV組RSV+低劑量組RSV+中劑量組RSV+高劑量組n 9 9 9 9 9

2.5 miR-23b-3p 對(duì)RSV 感染的支氣管上皮細(xì)胞16-HBE活性，凋亡，蛋白表達(dá)和炎癥因子水平的影響

RSV+miR-23b-3p 組miR-23b-3p 表達(dá)水平、細(xì)胞活性和CyclinD1 表達(dá)水平較RSV+miR-NC組高，凋亡率、Cleaved Caspase-3、Bax 表達(dá)水平、TNF-α、IL-6、IL-1α 水平較RSV+miR-NC 組低（P＜0.05）。見(jiàn)圖3，表5和表6。

表5 miR-23b-3p對(duì)RSV感染的支氣管上皮細(xì)胞（16-HBE）活性、凋亡影響（±s）

表5 miR-23b-3p對(duì)RSV感染的支氣管上皮細(xì)胞（16-HBE）活性、凋亡影響（±s）

注：與RSV+miR-NC組比較，**P ＜0.01。

組別RSV+miR-NC組RSV+miR-23b-3p組Bax 0.73±0.07 0.35±0.03**n 9 9 miR-23b-3p 1.00±0.10 2.69±0.24**A值0.54±0.05 1.03±0.09**凋亡率（%）23.89±2.11 9.21±0.85**CyclinD1 0.41±0.04 0.79±0.07**Cleaved Caspase-3 0.94±0.09 0.48±0.03**

表6 miR-23b-3p對(duì)RSV感染的支氣管上皮細(xì)胞（16-HBE）炎癥因子水平的影響（±s）

表6 miR-23b-3p對(duì)RSV感染的支氣管上皮細(xì)胞（16-HBE）炎癥因子水平的影響（±s）

注：與RSV+miR-NC組比較，**P ＜0.01。

組別RSV+miR-NC組RSV+miR-23b-3p組IL-1α（pg/mL）247.91±22.53 119.14±9.68**n 9 9 TNF-α（pg/mL）218.16±17.59 73.94±6.85**IL-6（pg/mL）194.08±16.91 72.11±7.04**

2.6 anti-miR-23b-3p 對(duì)阿爾泰金蓮花總黃酮作用的RSV 感染的支氣管上皮細(xì)胞16-HBE 活性、凋亡和炎癥因子水平的影響

anti-miR-23b-3p+RSV+高劑量組miR-23b-3p 表達(dá)水平、細(xì)胞活性和CyclinD1 表達(dá)水平較anti-miR-NC+RSV+高劑量組降低（P＜0.01），凋亡率、Cleaved Caspase-3、Bax 表達(dá)水平、TNF-α、IL-6、IL-1α 水平較anti-miR-NC+RSV+高劑量組升高（P＜0.01）。見(jiàn)圖4，表7和表8。

表7 anti-miR-23b-3p對(duì)阿爾泰金蓮花總黃酮作用的RSV感染的支氣管上皮細(xì)胞（16-HBE）活性、凋亡影響（±s）

表7 anti-miR-23b-3p對(duì)阿爾泰金蓮花總黃酮作用的RSV感染的支氣管上皮細(xì)胞（16-HBE）活性、凋亡影響（±s）

注：與anti-miR-NC+RSV+高劑量組比較，**P ＜0.01。

組別anti-miR-NC+RSV+高劑量組anti-miR-23b-3p+RSV+高劑量組Bax 0.39±0.04 0.76±0.07**n 9 9 miR-23b-3p 1.00±0.11 0.45±0.04**A值1.06±0.09 0.53±0.05**凋亡率（%）8.91±0.81 22.04±1.96**CyclinD1 0.81±0.08 0.41±0.04**Cleaved Caspase-3 0.47±0.04 0.89±0.08**

表8 anti-miR-23b-3p對(duì)阿爾泰金蓮花總黃酮作用的RSV感染的支氣管上皮細(xì)胞（16-HBE）炎癥因子水平的影響（±s）

表8 anti-miR-23b-3p對(duì)阿爾泰金蓮花總黃酮作用的RSV感染的支氣管上皮細(xì)胞（16-HBE）炎癥因子水平的影響（±s）

注：與anti-miR-NC+RSV+高劑量組比較，**P ＜0.01。

組別anti-miR-NC+RSV+高劑量組anti-miR-23b-3p+RSV+高劑量組IL-1α（pg/mL）125.03±10.06 233.19±20.01**n 9 9 TNF-α（pg/mL）89.57±8.46 177.36±14.02**IL-6（pg/mL）93.31±8.97 206.03±16.34**

3 討論

呼吸系統(tǒng)疾病是嚴(yán)重威脅人類(lèi)生命的常見(jiàn)病、多發(fā)病，支氣管上皮細(xì)胞是機(jī)體對(duì)外保護(hù)的第一道屏障，可以對(duì)抗?jié)撛诓≡w和外來(lái)顆粒性引起的損傷，是氣道的物理保護(hù)壁，支氣管上皮細(xì)胞損傷可誘導(dǎo)氣道炎癥，而炎癥又可引起氣道上皮反復(fù)損傷，進(jìn)而造成呼吸系統(tǒng)疾病的發(fā)生［13-15］。中藥及其活性成分在一系列肺相關(guān)疾病中可抑制感染、炎癥［16-17］。研究發(fā)現(xiàn)阿爾泰金蓮花浸膏粉對(duì)PM2.5 致大鼠急性肺損傷有保護(hù)作用［18］。金蓮花總黃酮提取物對(duì)LPS致大鼠急性肺損傷具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與其抗氧化作用和減少炎癥因子的釋放有關(guān)［19］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，不同劑量阿爾泰金蓮花總黃酮處理后，能增加細(xì)胞活性和CyclinD1 表達(dá)水平，降低凋亡率、Cleaved Caspase-3、Bax 表達(dá)水平，表明阿爾泰金蓮花總黃酮可抑制RSV感染的16-HBE 細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞存活。TNF-α、IL-6、IL-1α 是促炎細(xì)胞因子，其水平升高可促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生［20-21］。經(jīng)阿爾泰金蓮花總黃酮處理，可降低16-HBE 細(xì)胞TNF-α、IL-6、IL-1α 水平，表明阿爾泰金蓮花總黃酮可抑制RSV 感染的16-HBE 細(xì)胞炎癥反應(yīng)。提示，阿爾泰金蓮花總黃酮對(duì)RSV 感染的16-HBE細(xì)胞損傷具有一定的保護(hù)作用。

研究表明miRNA 可參與調(diào)控RSV 引起的支氣管上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)［22］。研究發(fā)現(xiàn)皮肌炎患者血清中miR-23b-3p 下調(diào)表達(dá)，參與皮肌炎的發(fā)病過(guò)程［23］。過(guò)表達(dá)miR-23b-3p 可降低類(lèi)固醇引起的股骨頭壞死大鼠促炎細(xì)胞因子水平［24］。表明miR-23b-3p 參與炎癥反應(yīng)的發(fā)生和發(fā)展。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，RSV 感染的16-HBE 細(xì)胞中miR-23b-3p 表達(dá)水平降低；過(guò)表達(dá)miR-23b-3p 可升高16-HBE 細(xì)胞活性、CyclinD1 表達(dá)水平，降低凋亡率、Cleaved Caspase-3、Bax 表達(dá)水平、TNF-α、IL-6、IL-1α 水平，表明過(guò)表達(dá)miR-23b-3p 抑制RSV 感染的16-HBE 細(xì)胞損傷。本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，阿爾泰金蓮花總黃酮可增加miR-23b-3p 水平，而抑制miR-23b-3p 表達(dá)可逆轉(zhuǎn)阿爾泰金蓮花總黃酮對(duì)RSV 感染的16-HBE 細(xì)胞活性，凋亡和炎癥因子水平的影響。

綜上所述，阿爾泰金蓮花總黃酮可能通過(guò)上調(diào)miR-23b-3p 表達(dá)抑制RSV 感染的支氣管上皮細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)。