李金榮, 周彤, 林一琪, 黃祚驊, 盛亮菁, 張飛萍, 吳松青

（1.福建農(nóng)林大學(xué)林學(xué)院, 福州 350002；2.福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 福州 350002；3.福建農(nóng)林大學(xué)生態(tài)公益林重大有害生物防控福建省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 福州 350002）

松材線蟲病又稱松樹萎蔫病（pine wilt disease）, 是 由 松 材 線 蟲（Bursaphelenchus xylophilus）引起的檢疫性森林病害, 具有傳播速度快、防治難度大等特點(diǎn), 不僅給我國林業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失, 也對景觀生態(tài)造成了嚴(yán)重破壞[1]。據(jù)報道, 在松材線蟲的傳播和感染的過程中, 松墨天牛起著攜帶、擴(kuò)散和協(xié)助病原侵入寄主的關(guān)鍵性作用, 被認(rèn)定為松材線蟲病的主要媒介昆蟲[2-3]。粘質(zhì)沙雷氏菌既是松材線蟲的主要伴生細(xì)菌[4-5], 又是松墨天牛腸道的優(yōu)勢菌, 且該菌對松墨天牛具有一定的殺蟲活性[6]。一方面其可以促進(jìn)天牛生長, 另一方面又為機(jī)會致病菌。因此, 可利用該菌的伴生和致病能力對松墨天牛進(jìn)行生物防治, 具有很強(qiáng)的生防潛力。

為了進(jìn)一步開發(fā)粘質(zhì)沙雷氏菌（Serratia marcesens)的應(yīng)用潛能, 需要對其進(jìn)行大量培養(yǎng), 以滿足大規(guī)模的生產(chǎn)實(shí)踐需求, 因此, 本研究將對該菌發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行篩選與優(yōu)化。粘質(zhì)沙雷氏菌培養(yǎng)基優(yōu)化方法不一, 主要包括正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)法、單因素試驗(yàn)優(yōu)化以及與其相結(jié)合的響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)法。郝林華等[7]采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì), 優(yōu)化以葡萄糖、硫酸銨、麩皮、檸檬酸三鈉等作為粘質(zhì)沙雷氏菌的培養(yǎng)基, 最終發(fā)酵菌含量為50×108cfu·mL-1；布佐日古麗·喀迪爾等[8]采用單因素試驗(yàn)優(yōu)化了粘質(zhì)沙雷氏菌XJU-PA-6的最佳發(fā)酵條件, 最佳碳源為麥芽糖, 最佳氮源為蛋白胨, 優(yōu)化后培養(yǎng)基的菌體生物量大概為8.7 g·L-1, 是基礎(chǔ)培養(yǎng)基的3.10倍。但為了實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn), 進(jìn)一步提升其發(fā)酵水平, 加速其發(fā)酵過程, 本研究采用更為快速經(jīng)濟(jì)的培養(yǎng)基優(yōu)化方法——響應(yīng)面法[9], 對粘質(zhì)沙雷氏菌的培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化, 以期篩選出最優(yōu)化的培養(yǎng)基配方,為粘質(zhì)沙雷氏菌工程菌的規(guī)模化發(fā)酵生產(chǎn)奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌株 試驗(yàn)所用粘質(zhì)沙雷氏菌BRC-CXG2菌株由本課題組前期分離自松墨天牛二齡幼蟲腸道并保存[6]。

1.1.2 主要試劑和培養(yǎng)基 蛋白胨（分析純）、酪素（化學(xué)純）購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；麥芽提取粉、酵母提取粉（生化試劑）購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；硫酸鎂、硫酸亞鐵、硫酸銨均為分析純, 購自天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司；胰蛋白胨、酵母粉均為分析純, 購自O(shè)XOID有限公司；瓊脂粉購自北京蘭杰柯科技有限公司；黃豆餅粉購自北京鴻潤寶順科技有限公司。

種子液LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g·L-1, 酵母粉5 g·L-1, 氯化鈉10 g·L-1, pH 7.1~7.3, 121℃滅菌20 min；固體LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g·L-1, 酵母粉5 g·L-1, 氯化鈉10 g·L-1, 按1.5%的比例加入瓊脂粉, pH 7.1~7.3, 121℃滅菌20 min, 倒板備用；初始發(fā)酵培養(yǎng)基：黃豆餅粉5 g·L-1, 酪素10 g·L-1, 蠶 蛹 粉10 g·L-1, 磷 酸 氫 二 鉀2 g·L-1, 氯 化 鈉2 g·L-1, pH 7.1~7.3, 121℃滅菌20 min。

1.1.3 主要儀器設(shè)備MLS-3781L-PC高壓蒸汽滅菌器, 松下健康醫(yī)療器械株式會社；HYG-A全溫?fù)u瓶柜, 蘇州市培英實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；DHG-9030A電熱鼓風(fēng)干燥箱, 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；SPX-250B-Z生化培養(yǎng)箱, 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；SW-CJ-2FD潔凈工作臺, 蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；NBL 214e電子天平, 艾德姆衡器（武漢）有限公司；ST3100實(shí)驗(yàn)室pH計(jì), 奧豪斯儀器（常州）有限公司；LEICA M205 FA全自動熒光立體顯微鏡, 徠卡微系統(tǒng)有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

在無菌條件下, 取粘質(zhì)沙雷氏菌（BRCCXG2）的保存菌液按體積分?jǐn)?shù)1%的量接種于5 mL的LB液體培養(yǎng)基中, 置于30℃、200 r·min-1搖床中培養(yǎng)12 h。然后將種子液按體積分?jǐn)?shù)1%的接種量轉(zhuǎn)接到裝有50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL的錐形瓶中, 在28℃、150 r·min-1培養(yǎng)36 h后, 采用稀釋平板計(jì)數(shù)法[10], 通過LEICA M205 FA全自動立體顯微鏡統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)量。

將發(fā)酵好的菌液梯度稀釋10-1~10-15倍, 各吸取100μL均勻涂布在固體LB培養(yǎng)基上, 靜置5 min, 待培養(yǎng)基表面干燥后封口, 放入溫度為28℃生化培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)12 h, 每個梯度重復(fù)3次, 統(tǒng)計(jì)單菌落數(shù)量。

1.3 單因素試驗(yàn)

基于初始發(fā)酵培養(yǎng)基, 分別設(shè)置不同溫度（25、28、30和37℃）、不同裝液量（25、50、100 mL/250 mL）及不同轉(zhuǎn)速（150、200、230 r·min-1）, 研究發(fā)酵條件對粘質(zhì)沙雷氏菌發(fā)酵菌落數(shù)的影響。

參照初始發(fā)酵培養(yǎng)基, 設(shè)置單因素試驗(yàn)研究培養(yǎng)基成分對粘質(zhì)沙雷氏菌發(fā)酵菌落數(shù)的影響。分別設(shè)置2.5、5.0、10.0 g·L-1的碳源（葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、油酸、淀粉）；10、20、40 g·L-1的氮源（硫酸銨、酵母粉、乙酸銨、蛋白胨, 再分別添加酪素和蠶蛹粉）以及1、2、4 g·L-1的無機(jī)鹽（檸檬酸三鈉、磷酸氫二鈉、硫酸鎂、硫酸銅、硫酸亞鐵）, 固定其他成分不變, 滅菌后按體積分?jǐn)?shù)1%接種, 并在28℃、150 r·min-1的條件下培養(yǎng)36 h, 統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)量。

1.4 Plackett-Burman試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果, 采用Plackett-Burman（PB）試驗(yàn)對影響粘質(zhì)沙雷氏菌BRC-CXG2菌落數(shù)量的因素進(jìn)行評價[11]。11個因素的水平設(shè)置如表1所示, 每個因素分別設(shè)計(jì)低（-1）、高（+1）水平。X3、X6、X9表示的是虛擬變量, 用于考察試驗(yàn)誤差。試驗(yàn)次數(shù)為12次, 重復(fù)3次, 篩選出3個影響顯著的因素。

表1 Plackett-Burman試驗(yàn)因素水平Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman test

1.5 最陡爬坡試驗(yàn)

根據(jù)PB試驗(yàn)結(jié)果篩選出對菌株生長影響最顯著的因素, 分別為葡萄糖、蠶蛹粉和接種量。通過Design Experts 8.0.6軟件的Plackett-Burman分析功能對PB試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行顯著性分析, 從中篩選出 影 響 顯 著（P＜0.05）的 因 素, 基 于Plackett-Burman試驗(yàn)分析擬合出的顯著性方程設(shè)置最陡爬坡試驗(yàn)中3個影響因素的爬坡方向和步長間距, 以期逼近最佳響應(yīng)區(qū)域。

1.6 響應(yīng)面分析與驗(yàn)證試驗(yàn)

根據(jù)最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果確定其最適質(zhì)量濃度范圍, 運(yùn)用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì), 對培養(yǎng)基的每個因素條件進(jìn)行優(yōu)化。通過二階設(shè)計(jì)原理, 3因素（葡萄糖、蠶蛹粉及接種量）各取3水平（-1, 0, 1）, 共設(shè)計(jì)了17個組合的響應(yīng)面試驗(yàn)[12-13]。其中包括5個中心點(diǎn), 試驗(yàn)重復(fù)3次, 以確定各因素對菌株BRC-CXG2菌體生長量影響的顯著性和最適質(zhì)量濃度范圍。然后對Box-Behnken試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析, 擬合線性回歸方程。利用擬合方程得到最佳培養(yǎng)條件, 并在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。

1.7 數(shù)據(jù)處理

使用Excel 2020進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)、作圖與分析, 分別用Design Experts 8.0.6、Origin 2021、GraphPad Prism 9與IBM SPSS Statistics 22。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)條件對發(fā)酵菌落數(shù)的影響

圖1結(jié)果顯示, 溫度過高或過低都不利于粘質(zhì)沙雷菌體的生長, 溫度在28℃時菌落數(shù)最高, 為32.9×107cfu·mL-1, 因此, 28℃為最適菌株生長溫度。裝液量為50 mL時, 發(fā)酵菌落數(shù)均高于裝液量25 mL和100 mL, 因此裝液量最適體積分?jǐn)?shù)為50/250 mL；當(dāng)轉(zhuǎn)速達(dá)到230 r·min-1時該菌菌落數(shù)最高, 但考慮搖床長時間處于該轉(zhuǎn)速工作時可能出現(xiàn)的安全性問題, 故選擇150 r·min-1進(jìn)行培養(yǎng)基優(yōu)化。

圖1 不同溫度、裝液量和轉(zhuǎn)速下的粘質(zhì)沙雷氏菌菌落數(shù)Fig.1 Colonies number of Serratia marcescens under different temperatures, loading volumes and rotational speeds

2.2 單因素對菌落數(shù)量的影響

2.2.1 不同碳源對粘質(zhì)沙雷氏菌菌落數(shù)量的影響 將不同種類及質(zhì)量濃度碳源分別替換初始培養(yǎng)基中的黃豆餅粉, 對粘質(zhì)沙雷氏菌的菌落數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。結(jié)果（圖2）表明, 油酸為10.0 g·L-1的條件下菌落數(shù)最大, 為1.42×109cfu·mL-1, 但與葡萄糖的結(jié)果（1.39×109cfu·mL-1）差異并不明顯。當(dāng)碳源含量為5.0 g·L-1時, 葡萄糖對發(fā)酵菌落數(shù)量的影響明顯大于其他碳源因子?？紤]成本問題, 將葡萄糖與油酸同作為碳源加入到培養(yǎng)基中, 進(jìn)一步優(yōu)化比值。

圖2 不同碳源下的粘質(zhì)沙雷氏菌菌落數(shù)量Fig.2 Colonies number of Serratia marcescens under different carbon sources

2.2.2 不同氮源對粘質(zhì)沙雷氏菌菌落數(shù)量的影響 將不同種類及濃度氮源分別替換初始培養(yǎng)基中的酪素和蠶蛹粉, 對粘質(zhì)沙雷氏菌的菌落數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。結(jié)果（圖3）表明, 初始發(fā)酵培養(yǎng)基氮源40 g·L-1時的菌落數(shù)量最大, 為9.7×108cfu·mL-1, 但從生產(chǎn)成本的角度考慮, 酪素的價格較為昂貴, 不符合大規(guī)模生產(chǎn)實(shí)踐要求, 故選擇菌落數(shù)為7.8×108cfu·mL-1的蠶蛹粉和20 g·L-1的酵母粉組合作為粘質(zhì)沙雷氏菌的最佳氮源。

圖3 不同氮源下的粘質(zhì)沙雷氏菌菌落數(shù)量Fig.3 Colonies number of Serratia marcescens under different nitrogen sources

2.2.3 不同無機(jī)鹽對粘質(zhì)沙雷氏菌菌落數(shù)量的影響 將不同種類無機(jī)鹽分別替換初始培養(yǎng)基中的磷酸氫二鉀, 對粘質(zhì)沙雷氏菌的菌落數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。結(jié)果（圖4）表明, 加入2.0 g·L-1的硫酸鎂, 發(fā)酵菌落數(shù)值最高為1.11×109cfu·mL-1。同時, 磷酸鹽類在培養(yǎng)基中起著調(diào)節(jié)pH及緩沖等重要作用。由于磷酸氫二鉀與硫酸鎂混合會生成磷酸氫鎂沉淀, 磷酸氫二鈉與硫酸鎂則不發(fā)生反應(yīng)。故用于Plackett-Burman設(shè)計(jì)的無機(jī)鹽分別是硫酸鎂和磷酸氫二鈉。

圖4 不同無機(jī)鹽下的粘質(zhì)沙雷氏菌菌落數(shù)量Fig.4 Colonies number of Serratia marcescens under different inorganic salt sources

2.3 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)與檢測結(jié)果分析

表2所示的是Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案與菌落數(shù)檢測結(jié)果。將所得到的結(jié)果進(jìn)行擬合, 方程模型如下。

表2 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案與檢測結(jié)果Table 2 Design and results of Plackett-Burman test

根據(jù)該方程可知, 因素X1（油酸）、X2（葡萄糖）、X4（蠶蛹粉）、X10（接種量）分別呈現(xiàn)不同的正（+）負(fù)（-）系數(shù), 即X1（油酸）為負(fù)效應(yīng)系數(shù), 當(dāng)加入油酸到一定量時, 則菌落數(shù)依次減??；X2（葡萄糖）、X4（蠶蛹粉）和X10（接種量）均為正效應(yīng)系數(shù), 依次增大。

方差分析（表3）表明,R2=0.983 9, 說明這個模型的結(jié)果僅有1.61%不可信。且該模型的P值為0.013 1, 模型顯著（P＜0.05）, 說明模型擬合良好。在8個變量中, 對菌落數(shù)量影響較顯著（P＜0.05）的4個因素從大到小為：蠶蛹粉＞葡萄糖＞接種量＞油酸。由于油酸生產(chǎn)成本偏高, 不再考慮優(yōu)化。因此, 確定葡萄糖、蠶蛹粉與接種量為影響菌落數(shù)量的重要因素, 進(jìn)行最陡爬坡試驗(yàn)。

表3 Plackett-Burman試驗(yàn)方差分析Table 3 Analysis of variance for the Plackett-Burman test

2.4 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

本試驗(yàn)將培養(yǎng)基成分設(shè)計(jì)了6個水平（表4）, 隨著葡萄糖、蠶蛹粉和接種量值的增加, 發(fā)酵菌落數(shù)呈現(xiàn)先升高后下降的變化趨勢, 4號的菌落數(shù)達(dá)到最大值34.37×108cfu·mL-1, 因此確定為因子的最大響應(yīng)值響應(yīng)區(qū)域, 然后圍繞此區(qū)域設(shè)計(jì)Box-Behnken試驗(yàn)的中心點(diǎn)。

表4 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 4 Design and results from the steepest ascent experiment

2.5 響應(yīng)面分析優(yōu)化培養(yǎng)基組成與方差分析結(jié)果

根據(jù)PB設(shè)計(jì)和最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果（表5）, 分別確定3個最重要因素和最佳質(zhì)量濃度范圍, 以菌落數(shù)（Y）為響應(yīng)值,X1（葡萄糖）、X4（蠶蛹粉）、X10（接種量）為自變量, 采用中心組合設(shè)計(jì)進(jìn)行Box-Behnken試驗(yàn)。通過響應(yīng)面分析可以得到多元二次回歸方程。

表5 響應(yīng)面分析法試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 5 Experimental design and results of response surface analysis method

結(jié)合回歸分析（表6）, 該模型的P值為0.000 5（P＜0.01）, 失擬項(xiàng)影響不顯著（P=0.611 7＞0.05）,相 關(guān) 系 數(shù)（R2）為0.957 0, 校 正 系 數(shù)（Radj2）為0.901 7, 說明模型的擬合度較好。模型顯著性由大到小排序：X（1葡萄糖）＞X（4蠶蛹粉）＞X1（0接種量）。一次項(xiàng)X（1葡萄糖）和二次項(xiàng)X12、X42、X102對響應(yīng)值Y（菌落數(shù)）影響極顯著（P＜0.01）, 交互項(xiàng)X1X4和X4X10顯著影響Y值（P＜0.05）, 一次項(xiàng)X4和X10與交互項(xiàng)X1X10對菌落數(shù)影響不顯著（P＞0.05）。

表6 響應(yīng)面方差分析的回歸模型Table 6 Regression model for response surface analysis of variance

由圖5可知, 各個因素交互作用對菌落數(shù)影響的響應(yīng)曲面為拋物線狀, 形狀輪廓圖則表示獨(dú)立變量間的顯著性。輪廓圖呈橢圓形, 說明各個因素之間相互作用會影響Y（菌落數(shù)）。

如圖5A所示,X1（0接種量）值固定不變,X（1葡萄糖）和X（4蠶蛹粉）對發(fā)酵菌落數(shù)的影響表明, 當(dāng)X1值為最低質(zhì)量濃度時,Y值先隨著X4值的升高而增加；當(dāng)X1的值超過最適質(zhì)量濃度時,Y值隨著X4值的升高而下降,Y值的響應(yīng)面呈現(xiàn)峰值, 即邊界的設(shè)置包含最優(yōu)點(diǎn)。如果沒有得到完整的橢圓形狀的等高線圖, 說明邊界的設(shè)計(jì)不包含最優(yōu)點(diǎn)。當(dāng)X4值保持不變時,X1和X10對Y值的影響如圖5B所示。X1值較低時, 隨著X10的提高,Y的值呈明顯的拋物線狀, 先增加達(dá)到最優(yōu)時最大, 后下降。同理,X1值不變,X2和X3均出現(xiàn)各自的最優(yōu)值, 使Y達(dá)到峰值（圖5C）。而3個曲面的頂點(diǎn)反映菌落數(shù)的最高點(diǎn)即最佳培養(yǎng)基成分與最佳用量。

圖5 各因素交互作用下菌落數(shù)的響應(yīng)面及等高線Fig.5 Response surface and contour plots of colony number under the interaction of various factors

通過分析等高線圖可得到預(yù)測最優(yōu)值。預(yù)測最 優(yōu) 條 件 為：23.27 g·L-1葡 萄 糖、22.37 g·L-1蠶蛹粉和4.73 %接種量, 預(yù)估的菌落數(shù)為5.67×109cfu·mL-1。故最終培養(yǎng)基成分及培養(yǎng)條件為：23.27 g·L-1的葡萄糖、22.37 g·L-1的蠶蛹粉、10 g·L-1酵母粉、2 g·L-1硫酸鎂、3 g·L-1磷酸氫二鈉、2 g·L-1氯化鈉, 28℃、150 r·min-1條件下發(fā)酵36 h, 培養(yǎng)基裝液量體積分?jǐn)?shù)為50 mL/250 mL, 接種4.73%的菌液。

2.6 優(yōu)化后培養(yǎng)基的發(fā)酵結(jié)果

按所得到的最優(yōu)培養(yǎng)基配方進(jìn)行發(fā)酵, 驗(yàn)證所預(yù)測的菌落數(shù)是否準(zhǔn)確。試驗(yàn)所獲得的平均菌落數(shù)是6.0×109cfu·mL-1, 與預(yù) 測菌落數(shù)結(jié)果（5.67×109cfu·mL-1）非常接近。因此, 可以證明這個模型準(zhǔn)確性較高, 可預(yù)測實(shí)際發(fā)酵情況。此外, 結(jié)果表明, 最優(yōu)培養(yǎng)基發(fā)酵的菌落數(shù)（6.0×109cfu·mL-1）在現(xiàn)有的最佳培養(yǎng)基基礎(chǔ)上（6.37×108cfu·mL-1）提 高 了9.42倍, 達(dá) 到 預(yù) 期目標(biāo)。

3 討論

優(yōu)化發(fā)酵微生物培養(yǎng)基是提高生物防治效果的重要手段[14]。優(yōu)化內(nèi)容主要包括培養(yǎng)基的組成成分與培養(yǎng)條件, 如溫度、pH、發(fā)酵時間、裝液量等因素對發(fā)酵菌體生物量有著不同程度的影響, 有研究發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基的主要成分以及各因素之間的相互作用對粘質(zhì)沙雷氏菌發(fā)酵具有極其重大的影響[7,15-16], 與此同時培養(yǎng)溫度在菌體生長過程中也發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。

郝林華等[7]對分離于濕地鹽堿灘地土壤的粘質(zhì)沙雷氏菌進(jìn)行發(fā)酵, 主要是對該菌培養(yǎng)基的碳、氮源及無機(jī)鹽進(jìn)行優(yōu)化, 其優(yōu)化培養(yǎng)基配方中碳、氮源與無機(jī)鹽的成分含量分別是葡萄糖10 g·L-1, 硫酸銨5 g·L-1, 麩皮50 g·L-1, 檸檬酸三鈉1 g·L-1, 最終發(fā)酵菌數(shù)為50×108cfu·mL-1, 發(fā)現(xiàn)碳氮源及兩因素之間的交互作用對菌體生長影響較大, 而無機(jī)鹽次之。薛建等[15]研究的粘質(zhì)沙雷氏菌篩選于光合細(xì)菌菌劑, 對該菌培養(yǎng)基種類和用量進(jìn)行優(yōu)化發(fā)現(xiàn), 5 g·L-1的黃豆粉作為碳源時,菌體生長量是原來基礎(chǔ)培養(yǎng)基的1.72倍, 以10 g·L-1酪素和蠶蛹粉作為氮源, 生物量比原來分別提升了2.04和2.16倍, 以2 g·L-1磷酸氫二鉀作為無機(jī)鹽, 發(fā)現(xiàn)菌體產(chǎn)量是之前的1.15倍。由此說明, 對該菌發(fā)酵菌液影響最大的是氮源, 其次為碳源和無機(jī)鹽。李元芳等[16]優(yōu)化粘質(zhì)沙雷氏菌產(chǎn)2,3-丁二醇培養(yǎng)基時發(fā)現(xiàn)80 g·L-1蔗糖、5 g·L-1酵母粉及0.07 g·L-1硫酸錳及10 g·L-1檸檬酸對菌體生物量的提高起著重要作用, 按影響從大到小依次排序?yàn)闄幟仕幔窘湍阜郏玖蛩徨i＞蔗糖。即檸檬酸和氮源對發(fā)酵產(chǎn)量影響最大, 其次為無機(jī)鹽和碳源。

本研究中發(fā)酵的粘質(zhì)沙雷氏菌分離自松墨天牛幼蟲腸道, 影響因素重要性由大到小分別為氮源＞碳源＞無機(jī)鹽, 這與郝林華等[7]和薛建等[15]的研究結(jié)果一致。與李元芳等[16]的研究結(jié)果區(qū)別在于碳源與無機(jī)鹽對發(fā)酵生物量影響程度的差異, 其研究表明無機(jī)鹽對菌體生長的重要性大于碳源因子, 而本研究結(jié)論與之相反, 原因可能是由于試驗(yàn)?zāi)康牟町愋? 前者研究目的是如何使粘質(zhì)沙雷氏菌產(chǎn)大量2,3-丁二醇, 所以對培養(yǎng)基的成分選擇上更多的考慮如何促進(jìn)2,3-丁二醇的產(chǎn)量, 而非提高菌體自身生物量, 其研究表明無機(jī)鹽在細(xì)胞代謝過程中起著至關(guān)重要的作用, 因此2,3-丁二醇的產(chǎn)出對無機(jī)鹽營養(yǎng)需求大于對碳源的需求量。然而, 本研究以提高菌體自身產(chǎn)量為目標(biāo), 這與郝林華等[7]研究目的一致, 由于碳源作為生命體生長繁殖所必需的基本營養(yǎng)物質(zhì), 在菌體自身繁殖與合成中起著非常關(guān)鍵的作用。所以, 菌體對碳源的需求要大于無機(jī)鹽。

另外, 本研究發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)條件也是影響菌體生長的關(guān)鍵因素。尤其是溫度對菌體自身繁殖起著極其重要的作用[17-18]。譚文章等[19]報道, 粘質(zhì)沙雷氏菌在4~37℃的環(huán)境下均能生長, 但在37℃的條件下生長最佳。還有學(xué)者探究溫度對菌體生長的影響表明該菌的生存范圍為20~40℃[20], 但趙銀娟等[17]研究發(fā)現(xiàn), 從土壤中分離到的粘質(zhì)沙雷氏菌最適生長溫度為28~30℃；祁正華等[21]對粘質(zhì)沙雷氏菌培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化, 該菌株于健康人皮膚分離且經(jīng)過生物技術(shù)誘導(dǎo), 該菌最佳生長溫度為30℃。前人對菌體生長影響因素的重要性及最佳培養(yǎng)溫度報道不一, 其原因可能是不同產(chǎn)地不同來源的菌株間存在特異性, 故菌株所需的營養(yǎng)成分含量和培養(yǎng)條件也會存在差異。

綜上所述, 本研究得到最優(yōu)配方與培養(yǎng)條件為23.27 g·L-1的葡萄糖, 22.37 g·L-1的蠶蛹粉, 10 g·L-1酵母粉, 2 g·L-1硫酸鎂, 3 g·L-1磷酸氫二鈉, 2 g·L-1氯化鈉；在28℃、150 r·min-1條件下發(fā)酵36 h, 裝入50 mL/250 mL培養(yǎng)基, 接種量為4.73 %, pH 7.1~7.3, 菌落數(shù)達(dá)到60×108cfu·mL-1。郝林華等[7]優(yōu)化后的活菌數(shù)為50×108cfu·mL-1, 與之相比不僅產(chǎn)量上有所提升, 而且發(fā)酵時間也縮短了一半, 從而大大節(jié)約了時間成本, 使發(fā)酵過程變得更加高效、高產(chǎn), 為后續(xù)粘質(zhì)沙雷氏菌生物工程菌劑的應(yīng)用提供重要技術(shù)支撐。