賈睿琪, 郭子昂, 姚晨, 李璞, 臘貴曉, 陸夏梓, 郭虹妤, 李烜楨*

（1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院, 鄭州 450002；2.河南省地質(zhì)環(huán)境勘查院, 鄭州 450051；3.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所, 鄭州 450002）

鎘（Cd）是土壤中常見的重金屬之一, 在全國土壤污染調(diào)查點位中超標(biāo)率為7.0%[1-2]。土壤中鎘易被作物吸收, 進(jìn)而進(jìn)入食物鏈并威脅人體健康[3-4]。研究表明, 植物對鎘的吸收能力不僅與作物種類有關(guān)[5-8], 也與土壤條件有關(guān), 如理化性質(zhì)、養(yǎng)分等[9-10]。磷（P）是作物所需的大量元素[11]之一, 在石灰性土壤中, 無機(jī)磷（Pi）約占土壤總磷的75%~85%, 主要存在于磷酸鈣礦物中[11-12]。植物根系只能吸收可溶態(tài)正磷酸鹽（Pi、H2PO-4或HPO2-4), 而土壤中的可溶態(tài)Pi很容易吸附在酸性土壤中的鋁和鐵氧化物上, 或與石灰性土壤中的鈣結(jié)合[13]。尤其在石灰性土壤中, 由于pH通常大于7.5, 因此磷的生物有效性較低[11,14]。為了應(yīng)對低磷脅迫, 植物可以通過一系列策略來獲取磷[15-18], 包括增加根系長度和根毛數(shù)量等。此外, 植物還可以提高質(zhì)子、羧酸根和磷酸酶根際釋放量, 以活化無機(jī)磷（Pi）和有機(jī)磷（Po）[19-21], 這些分泌物有助于溶解難溶態(tài)Pi, 或從Po化合物中釋放Pi, 從而提高磷的生物有效性。

黃淮海平原是小麥（Triticum aestivum L.）的主產(chǎn)區(qū)之一, 一般認(rèn)為黃淮海平原農(nóng)田屬于石灰性土壤, 鎘生物有效性較低, 然而有調(diào)查發(fā)現(xiàn)該地區(qū)的小麥存在鎘超標(biāo)現(xiàn)象[22]。有研究表明, 土壤供磷水平可影響植物對鎘的活化和吸收, 例如Ma等[23]發(fā)現(xiàn)低磷水平較高磷水平更易促進(jìn)小麥對鎘的吸收, 可能與低磷脅迫下小麥的根系分泌物有關(guān), 但機(jī)制尚不明確。為進(jìn)一步闡明供磷水平對小麥吸收鎘的影響, 本研究通過砂培試驗揭示低磷脅迫對小麥生物量以及對磷和鎘吸收的影響, 并分析根系分泌物特征, 為通過調(diào)控磷素生物有效性來降低小麥中鎘含量提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試小麥品種為鄭麥1860, 種子購于河南秋樂種業(yè)科技股份有限公司；供試石英砂購于上海麥克林生化科技有限公司, 粒徑0.55~1.00 mm, 主要成分為99.9%的SiO2, 分析純（AR）。

所 用Hoagland營 養(yǎng) 液 成 分 為：5 mmol·L-1CaNO3·4H2O, 5 mmol·L-1KNO3, 1 mmol·L-1NH4NO3, 1 mmol·L-1KH2PO4, 2 mmol·L-1MgSO4·7H2O, 0.5 mg·L-1H3BO4, 4 mg·L-1FeSO4, 0.5 mg·L-1ZnSO4, 0.5 mg·L-1MnCl2, 0.02 mg·L-1CuSO4和0.01 mg·L-1(NH4)6Mo7O, 使用1 mol·L-1NaOH調(diào)節(jié)營養(yǎng)液pH至6.8。

1.2 試驗設(shè)計

本研究采用砂培試驗, 具體步驟為：在塑料量杯（高度14.5 cm, 直徑11.0 cm）中填充600 g石英砂, 并加入180 mL Hoagland營養(yǎng)液?？紤]到Ca3(PO4)2是土壤中磷的主要存在形式[24], 因此在低磷脅迫處理中, Hoagland營養(yǎng)液中的磷源采用等量的Ca3(PO4)2置換KH2PO4, 每個處理4個重復(fù), 以采用正常Hoagland營養(yǎng)液的處理作為對照（CK）。為了分析不同供磷水平對Cd吸收的影響, 并考慮到石灰性土壤中鎘主要以CdCO3形式存在[23], 因此對照和低磷處理中均混入12.3 mg·L-1的CdCO3。

培養(yǎng)試驗在光照培養(yǎng)箱（HPG-320BX, 哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司）中進(jìn)行。具體步驟為：挑選籽粒飽滿的小麥種子, 在5%次氯酸鈉溶液中浸泡15 min, 用去離子水沖洗干凈后置于燒杯中浸泡8 h, 將泡好的種子均勻擺放在墊有3層濕濾紙的育苗盤中, 25℃黑暗中發(fā)芽72 h, 然后播種9粒發(fā)芽種子在塑料量杯中。小麥整個生長期光照時間為晝14 h/夜10 h, 溫度為晝25℃/夜22℃。每天補(bǔ)充10 mL營養(yǎng)液（補(bǔ)充總量控制為120 mL, 保持處理間獲取相同總量的磷）, 并補(bǔ)充水分至石英砂的飽和含水量, 種植14 d后收獲小麥進(jìn)行分析。

1.3 樣品采集和處理

將小麥植株完整取出, 用去離子水將根系沖洗干凈, 濾紙吸干表面水分, 通過根系掃描儀對根系進(jìn)行掃描, 用于分析根系形態(tài)指標(biāo)；使用滅菌不銹鋼剪刀分離地上、地下部, 取0.5 g根部鮮樣置于滅菌研缽中, 冰浴研磨出汁液, 用于測定根中小分子有機(jī)酸含量[25]；剩余樣品置于烘箱中105℃殺青30 min后, 65℃烘干至恒重, 測定小麥地上部和地下部干重；然后將樣品通過球磨機(jī)磨碎, 消解測定小麥樣品中的磷和鎘含量；通過抽濾裝置收集種植小麥后砂培中剩余營養(yǎng)液, 用于測定培養(yǎng)基pH和有機(jī)酸含量。

1.4 指標(biāo)測定

通 過 離 子 色 譜（IC5000, Thermo Fisher Scientific）測定培養(yǎng)基和小麥根中有機(jī)酸（草酸根、蘋果酸根）含量；小麥樣品通過HNO3-H2O2(7∶1, V/V)進(jìn)行微波消解, 消化液采用鉬銻抗比色法, 通過紫外可見分光光度計（UV2400, 上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）測定總磷含量；通過火焰原子吸收分光光度計（900T, PerkinElmer）測定總鎘含量；培養(yǎng)基pH通過pH計測定。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Excel 2016和SPSS 25.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析, 采用獨立樣本t檢驗分析不同處理間數(shù)據(jù)的差異顯著性；采用WinRHIZO軟件對根系掃描儀掃描圖像進(jìn)行分析；采用Origin 2019b進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 低磷脅迫對小麥生長的影響

通過分析不同處理小麥干重和根系形態(tài)指標(biāo)發(fā)現(xiàn)（圖1）, 低磷處理的小麥地上部干重與對照無顯著差異, 但地下部干重較對照顯著降低, 降幅達(dá)27.3%（P＜0.05）, 且低磷處理根系的總根長、根表面積、根體積較對照也顯著降低, 降幅分別達(dá)51.3%、42.1%和29.9%（P＜0.05）。低磷處理根系的根平均直徑較對照增加21.8%, 但未達(dá)到顯著水平?？偟膩碚f, 低磷脅迫抑制了根系的生長。

圖1 低磷脅迫對小麥干重及根系形態(tài)指標(biāo)的影響Fig.1 Effects of low phosphorus stress on wheat biomass and root morphological indicators

2.2 低磷脅迫對小麥富集磷和鎘的影響

通過分析小麥磷和鎘含量發(fā)現(xiàn), 低磷處理中小麥地上部和地下部磷含量均顯著低于對照, 分別下降35.4%和23.1%（P＜0.05）（圖2）, 但培養(yǎng)14 d后低磷處理小麥對磷的總活化量較培養(yǎng)0 d（初始）顯著增加, 增幅達(dá)1 515.0%（P＜0.05）（圖3）, 表明低磷脅迫降低了小麥對磷的吸收, 但促進(jìn)了小麥對磷的活化。在低磷脅迫下, 小麥地上部和地下部鎘含量較對照分別顯著增加172.1%和192.8%（P＜0.05）（圖2）, 培養(yǎng)14 d后小麥對鎘的總活化量較對照也顯著增加, 增幅達(dá)71.6%（P＜0.05）（圖3）, 表明低磷脅迫可促進(jìn)小麥對鎘的活化與吸收。總的來說, 低磷處理顯著降低了小麥對磷的吸收, 但促進(jìn)了對磷的活化, 同時促進(jìn)了對鎘的活化與吸收。

圖2 低磷脅迫對小麥磷和鎘含量的影響Fig.2 Effect of low phosphorus stress on phosphorus and cadmium contents in wheat

圖3 低磷脅迫對小麥-培養(yǎng)基體系中磷和鎘含量的影響Fig.3 Effect of low phosphorus stress on the distribution of phosphorus and cadmium in wheat-culture medium system

2.3 低磷脅迫對小麥根系酸化能力的影響

通過分析培養(yǎng)基pH（圖4）發(fā)現(xiàn), 低磷處理培養(yǎng)0 d（初始）培養(yǎng)基pH較對照高0.1, 但差異未達(dá)到顯著水平；在培養(yǎng)14 d后, 低磷處理較對照降低了0.3, 但差異未達(dá)到顯著水平。通過分析培養(yǎng)基和小麥根中2種有機(jī)酸含量（圖4）發(fā)現(xiàn), 不同處理培養(yǎng)基中草酸根和蘋果酸根含量無顯著差異, 但是低磷處理小麥根中草酸根和蘋果酸根含量顯著高于對照, 增幅達(dá)1 588.1%和37.7%（P＜0.05）?？偟膩碚f, 低磷脅迫增加了小麥根中草酸根和蘋果酸根含量, 同時一定程度上降低了培養(yǎng)基pH。

圖4 低磷脅迫對培養(yǎng)基pH、有機(jī)酸含量及小麥根中有機(jī)酸含量的影響Fig.4 Effect of low phosphorus stress on medium pH, organic acid and organic acids in wheat roots

3 討論

3.1 低磷脅迫促進(jìn)小麥根系對磷的活化

植物根系可通過多種策略應(yīng)對低磷脅迫, 包括形成根毛和叢生根、增加根系分泌物（如磷酸酶和羧酸根）、提高磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性、提高菌根定殖率等[16,26-27]。本研究低磷脅迫顯著降低了小麥地下部干重、總根長、根表面積和根體積, 即低磷脅迫抑制了根系生長。這與已有研究結(jié)果相似, 例如Manske等[28]發(fā)現(xiàn), 在墨西哥中部高地的缺磷火山灰土中, 低磷對小麥根系生長有強(qiáng)烈的抑制作用, 另外的一些盆栽和田間試驗也發(fā)現(xiàn)了類似的現(xiàn)象[29-30]。磷是植物必需的大量元素, 約占植物干重的0.05%~0.50%, 在植物生長發(fā)育過程中具有重要的生理功能, 是DNA、RNA、ATP以及生物膜磷脂的重要成分, 與光合作用、能量代謝等多種生化反應(yīng)相關(guān)[31]。缺磷易導(dǎo)致植株矮小、根系發(fā)育遲緩等現(xiàn)象, 因此本研究所觀察到的低磷脅迫造成的植物根系指標(biāo)降低的現(xiàn)象可能與磷營養(yǎng)供應(yīng)不足有關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn), 低磷處理小麥地上部和地下部磷含量均顯著低于對照, 表明以Ca3(PO4)2為磷源來表征低磷脅迫是可行的。同時還發(fā)現(xiàn), 低磷脅迫顯著提高了小麥對磷的活化量, 表明小麥對磷具有有效的活化機(jī)制。有研究表明, 根系分泌物（質(zhì)子或羧酸根）是植物改善磷獲取的有效策略[32-36]。為了進(jìn)一步闡明低磷脅迫小麥對磷的活化機(jī)制, 本研究分析了培養(yǎng)基中pH和有機(jī)酸含量, 結(jié)果表明低磷脅迫一定程度上促進(jìn)了小麥根系對質(zhì)子的分泌, 造成培養(yǎng)基pH的下降；同時還發(fā)現(xiàn)低磷脅迫下培養(yǎng)液中羧酸根含量雖未顯著提高, 但根中的草酸根和蘋果酸根含量顯著提高。質(zhì)子可以導(dǎo)致難溶態(tài)磷Ca3(PO4)2的溶解, 而羧酸根可以與Ca3(PO4)2中的Ca發(fā)生螯合, 從而釋放磷酸根, 這2個過程都可以提高磷的有效性, 最終增加植物對磷的吸收[37-38]。此外, 本研究發(fā)現(xiàn)盡管小麥根中的草酸根和蘋果酸根含量顯著提高, 但低磷脅迫下培養(yǎng)液中羧酸根含量并未顯著提高, 這可能是羧酸根分泌到根外后, 與低磷處理中Ca3(PO4)2發(fā)生反應(yīng)并形成了羧酸-Ca沉淀[39]。

3.2 低磷脅迫提高小麥對鎘的活化和吸收

本研究還發(fā)現(xiàn), 低磷脅迫提高了小麥植株鎘含量, 還促進(jìn)了鎘的活化。這種現(xiàn)象很有可能是低磷脅迫導(dǎo)致小麥根系分泌物改變造成的。有研究發(fā)現(xiàn)了相似的現(xiàn)象, 例如Yang等[40]發(fā)現(xiàn), 在砂培條件下低磷處理（以磷酸鐵和磷酸鋁作為磷源）中菜心（Brassica campestris L.ssp.chinensis var.utilis Tsen et Lee）可通過分泌有機(jī)酸促進(jìn)Cd溶解進(jìn)而增加植物吸收。Edayilam等[41]發(fā)現(xiàn)在砂培條件下低磷處理可促進(jìn)弗吉尼亞須芒草（A.virginicus）對硅鈣石中鈾的溶解, 而這種溶解度的提高是通過增加羧酸根實現(xiàn)的。根系分泌的質(zhì)子可導(dǎo)致根際環(huán)境酸化并直接溶解沉淀態(tài)的鎘[40], 而羧酸根可與鎘螯合, 提高其生物有效性, 增加植物對鎘的吸收[14]。由此可見, 低磷脅迫促進(jìn)了小麥根系對質(zhì)子的分泌可能是造成鎘活化的原因之一。此外, 羧酸根的存在能夠促進(jìn)碳酸鹽的溶解[42], 羧酸根與CdCO3中的Cd發(fā)生螯合作用活化鎘, 增大了鎘的溶出量[43-45], 導(dǎo)致在低磷處理檢測到了更高的鎘活化量, 這也有可能是促進(jìn)鎘活化的原因之一?？偟膩碚f, 低磷脅迫可能導(dǎo)致根系質(zhì)子和羧酸根分泌增加促進(jìn)鎘的活化。

綜上所述, 低磷脅迫降低了小麥地下部干重, 并降低了總根長、根表面積、根體積等指標(biāo), 在這種情況下, 小麥可通過分泌質(zhì)子和羧酸根（草酸根和蘋果酸根）來溶解難溶態(tài)磷, 并促進(jìn)小麥對磷的吸收。同時, 低磷脅迫提高了小麥植株鎘含量, 這是由于低磷脅迫刺激了小麥根系質(zhì)子和羧酸根分泌, 在活化了磷的同時也活化了鎘, 最終導(dǎo)致了小麥鎘吸收增加。