王 洋，崔 帥，鑫 婷，王西西，于海男，陳世鈺，蔣亞君， 高新桃，龐忠寶，姜一曈，郭曉宇，賈 紅，朱鴻飛*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所,北京 100193；2.中國科學院微生物研究所,北京 100080； 3.中國農(nóng)業(yè)科學院生物技術研究所，北京 100081)

非洲豬瘟(African swine fever，ASF)是由非洲豬瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)引起的一種豬的急性、烈性、高度接觸性傳染病。ASFV是一種核質(zhì)巨D(zhuǎn)NA病毒，基因組全長170～193 kb，編碼150～167個開放閱讀框。自2018年傳入我國以來，非洲豬瘟疫情在全國范圍內(nèi)迅速擴散，給中國以及全球造成巨大的經(jīng)濟損失。目前，我國出現(xiàn)了基因I型ASFV，臨床表現(xiàn)為亞急性型或慢性型，嚴重增加了ASF防控難度。ASFV編碼多種蛋白質(zhì)，通過干擾宿主的天然免疫系統(tǒng)，抑制和逃避宿主的免疫應答反應，為自身的增殖、擴散創(chuàng)造有利條件。例如，MGF505-7R抑制p65的磷酸化和核轉(zhuǎn)移，與STING、TBK1和IKKα互作，抑制cGAS-STING通路介導的Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生；MGF505-11R能夠與STING互作，通過泛素化途徑降解STING，從而抑制Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生；E120R能夠與IRF3互作，抑制TBK1對IRF3的招募和IRF3的磷酸化，從而抑制Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生。

線粒體抗病毒信號蛋白(mitochondrial antiviral signaling, MAVS)是抗RNA病毒信號通路中的關鍵接頭蛋白。在病毒入侵機體時，RIG-I樣受體(RIG-I-like receptor, RLR)識別病原相關分子模式(pathogen-associated molecular patterns, PAMPs)，RIG-I與MAVS相互作用激活MAVS，進而活化下游NF-κB和IRF3的信號通路，誘導干擾素的表達。然而，在病毒進化過程中也具備了拮抗MAVS的策略，以此逃避先天性免疫系統(tǒng)。例如，日本腦炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)NS1蛋白通過抑制MAVS的表達，抑制Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生；口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus, FMDV)VP1蛋白與MAVS結合，競爭性抑制MAVS與TRAF3的結合，從而抑制Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生；登革熱病毒(dengue virus, DENV)NS4A蛋白與MAVS互作，抑制MAVS與RIG-I的結合，從而抑制IRF3的活化。

在研究ASFV多基因家族(multigene families，MGF)成員MGF360-14L對Ⅰ型干擾素通路影響的過程中，作者發(fā)現(xiàn)MGF360-14L能夠與MAVS相互作用，并且能夠抑制MAVS介導的Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生，從而逃避宿主先天性免疫反應。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞 人胚腎細胞HEK293T和豬腎細胞PK-15采用含有10%胎牛血清、1%雙抗DMEM培養(yǎng)基在5% CO和37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.1.2 質(zhì)粒 合成ASFV-18毒株360-14L全長基因(GenBank No.MH 766894)，然后亞克隆入p3×Flag-CMV-7.1質(zhì)粒和pCMV-N-eGFP質(zhì)粒；21和全長基因從PK-15細胞的cDNA中擴增，然后分別亞克隆入pcDNA3.1-Myc和pcDNA3.1-HA載體；cGAS、STING、TBK1、IRF3、IFN-β-luc和pRL-TK等表達質(zhì)粒由本實驗室保存。

1.1.3 主要試劑 兔抗TBK1/NAK、P-TBK1、IRF3、P-IRF3、GAPDH、eGFP-Tag、HA-Tag抗體和HRP標記的羊抗兔IgG抗體以及鼠抗Myc和Flag標簽抗體購自Cell Signaling Technology公司；轉(zhuǎn)染試劑(JetPRIME Kit)購自Polyplus Transfection公司。雙熒光素酶檢測試劑盒購自北京全式金生物技術股份有限公司；HRP標記羊抗鼠IgG抗體、蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑購自康為世紀生物科技股份有限公司；免疫共沉淀試劑盒(Pierce Crosslink Magnetic IP/Co-IP Kit)購自Thermo公司；羊抗鼠IgG H&L(Alexa Fluor488)和羊抗兔IgG H&L(Alexa Fluor594)熒光二抗購自Abcam公司；RNA提取試劑盒(TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit)和反轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScriptRT Master Mix)購自寶生物(TaKaRa)公司。

1.2 方法

1.2.1 實時熒光定量PCR(RT-qPCR) 收集細胞提取總RNA，然后將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，具體操作步驟參見RNA提取試劑盒(TaKaRa)和反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa)。使用SYBR熒光染料和ABI7900HT熒光定量PCR儀進行樣品的檢測。PCR體系：95 ℃ 1 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s和72 ℃ 45 s，40個循環(huán)，每個樣本進行3次重復檢測。RT-qPCR的引物序列:pig-GAPDH-F：5′-CGTCCCTGAGACACGATGGT-3′，pig-GAPDH-R：5′-GGAACATGTAGACCATGTAG-3′；pig-IFN-β-F：5′-GTGGAACTTGATGGGCAGAT-3′，pig-IFN-β-R：5′-TTCCTCCTCCATGATTTCCTC-3′。

1.2.2 雙熒光素酶檢測 首先將HEK293T細胞傳代培養(yǎng)，然后鋪48孔細胞培養(yǎng)板，待細胞密度達到70%左右時轉(zhuǎn)染質(zhì)粒。將IFN-β-luc和pRL-TK與cGAS、STNG、TBK1、MGF360-14L、TRIM21、MAVS或空載共轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染24 h后收集細胞，進行雙熒光素酶檢測，具體操作步驟參見雙熒光素酶說明書(北京全式金生物技術股份有限公司)。

1.2.3 免疫共沉淀試驗(Co-IP) HEK293T細胞傳代培養(yǎng)于6孔細胞培養(yǎng)板中，待細胞密度達到70%左右，依據(jù)具體試驗轉(zhuǎn)染p3×Flag-MGF360-14L、p-CMV-eGFP-MGF360-14L、pcDNA3.1-Myc-TRIM21、pcDNA3.1-HA-MAVS、p3×Flag-MAVS、pCDEF-HA-Ub或空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)。轉(zhuǎn)染后24 h，細胞用預冷的PBS洗3次，然后用含有蛋白酶和磷酸酶抑制劑的IP裂解液裂解細胞，在4 ℃條件下，12 000×離心10 min，取上清，4 ℃保存?zhèn)溆?。將磁珠與標簽抗體Flag或HA在旋轉(zhuǎn)器上室溫孵育1 h，然后清洗結合了抗體的磁珠，再將制備好的細胞上清與磁珠4 ℃過夜孵育，清洗磁珠后用洗脫液洗脫，洗脫下來的樣品加入loading buffer 100 ℃煮10 min，進行SDS-PAGE分析。

1.2.4 間接免疫熒光試驗(IFA) HEK293T細胞鋪于激光共聚焦培養(yǎng)皿上，待細胞密度達到70%左右，轉(zhuǎn)染p3×Flag-MGF360-14L和pcDNA3.1-HA-MAVS質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染24 h后，用4%的多聚甲醛固定細胞20 min，然后0.1% Triton X-100透膜15 min，5%的BSA封閉1 h，一抗分別采用鼠抗Flag和兔抗HA標簽抗體4 ℃過夜孵育，二抗分別采用羊抗鼠IgG H&L(Alexa Fluor488)和羊抗兔IgG H&L(Alexa Fluor594)抗體37 ℃孵育1 h，最后用DAPI著染細胞核，置熒光顯微鏡下觀察。

1.2.5 Western blot分析 轉(zhuǎn)染了相應質(zhì)粒的HEK293T細胞被含有蛋白酶和磷酸酶抑制劑的細胞裂解液裂解后，在4 ℃ 12 000×離心10 min，收集裂解液上清。采用BCA蛋白定量試劑盒(Thermo)對收集的裂解液進行蛋白定量。裂解液加入SDS-PAGE loading buffer后100 ℃煮沸10 min，上樣進行SDS-PAGE，并進行轉(zhuǎn)膜。用5%脫脂乳封閉后，分別用對應蛋白或標簽的抗體孵育，然后進行二抗孵育，最后進行ECL顯色。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析 本研究中的試驗均進行3次獨立的重復，使用GraphPad Prism 8軟件對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析分析方法采用Student’s-test(.<0.05；.<0.01；.<0.001)。

2 結 果

2.1 ASFV MGF360-14L抑制MAVS介導的Ⅰ型干擾素通路

已有研究表明，ASFV MGF的一些成員能夠抑制Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生。為了確定MGF360-14L對Ⅰ型干擾素的影響，將MGF360-14L-Flag質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293T細胞，并用5 μg·mL的poly(I:C)誘導干擾素的產(chǎn)生。RT-qPCR檢測結果顯示，MGF360-14L能夠明顯抑制poly(I:C)誘導的-β mRNA的產(chǎn)生(圖1A)，熒光素酶試驗結果顯示MGF360-14L能夠抑制MAVS誘導的IFN-β啟動子活性(圖1B)。

A.HEK293T細胞轉(zhuǎn)染MGF360-14L-Flag蛋白表達質(zhì)粒和poly(I:C)后24 h收集細胞，用RT-qPCR檢測IFN-β mRNA；B. 雙熒光素酶檢測MAVS誘導的IFN-β啟動子活性，并進行相對應的Western blot檢測A. HEK293T cells were co-transfected with the MGF360-14L-expressing plasmid and poly(I:C) for 24 h and then harvested for RT-qPCR assay to determine IFN-β mRNA levels; B. Double luciferase was used to detect IFN-β promoter activity induced by MAVS, expression of MAVS-HA and MGF360-14L-Flag was analyzed by Western blot圖1 ASFV MGF360-14L蛋白基因?qū)AVS信號通路的抑制Fig.1 MGF360-14L inhibited IFN-β mRNA production and IFN-β promoter activity

2.2 MGF360-14L與MAVS互作

由于MGF360-14L能夠抑制MAVS介導的IFN-β的產(chǎn)生，為確定其具體作機制，作者將MGF360-14L-Flag和MAVS-HA質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293T細胞，進行Co-IP試驗，結果表明，MGF360-14L能夠與MAVS結合(圖2A)，反過來MAVS同樣能夠與MGF360-14L結合(圖2B)。并且共定位試驗表明，MGF360-14和MAVS存在胞質(zhì)內(nèi)共定位(圖2C)。

A、B. MGF360-14L-Flag和MAVS-HA共轉(zhuǎn)染HEK293T細胞中，轉(zhuǎn)染后24 h收集細胞進行Co-IP試驗；C.將MGF360-14L-Flag和MAVS-HA共轉(zhuǎn)染鋪有HEK293T細胞進行IFA試驗，標尺為25 μmA, B. HEK293T cells were co-transfected with MGF360-14L-Flag and MAVS-HA plasmids, the cells were collected 24 h after transfection for Co-IP assay; C. HEK293T cells were transfected with MGF360-14L-Flag and MAVS-HA plasmids for laser confocal test. The scale is 25 μm圖2 ASFV MGF360-14L蛋白與MAVS互作Fig.2 MGF360-14L interacts with MAVS

2.3 MGF360-14L抑制TRIM21和MAVS誘導的IRF3磷酸化及IFN的產(chǎn)生

三重基序蛋白21(tripartite motif protein 21, TRIM21)能夠促進線粒體抗病毒信號蛋白(MAVS)的K27多聚泛素化從而增強TBK1的招募和活化IRF3，從而啟動Ⅰ型干擾素的表達。為了確定MGF360-14L是否能夠抑制TRIM21和MAVS引起的Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生，作者將不同濃度的MGF360-14L、TRIM21、MAVS以及啟動子報告基因IFN-β-luc和內(nèi)參報告基因pRL-TK共轉(zhuǎn)染HEK293T細胞，進行雙熒光素酶檢測。結果顯示，MGF360-14L能夠抑制TRIM21和MAVS共同誘導的IFN-β啟動子活性，且呈劑量依賴性(圖3A)。已有研究表明，TRIM21通過與MAVS作用，促進IRF3的磷酸化，促進Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生。作者將MGF360-14L-Flag、TRIM21-Myc和MAVS-HA共轉(zhuǎn)染HEK293T細胞后，進行Western blot分析，結果顯示，MGF360-14L對MAVS和TRIM21誘導的TBK1和IRF3磷酸化具有抑制作用(圖3B)。

A. 雙熒光素酶檢測不同濃度的ASFV MGF360-14L蛋白對MAVS/TRIM21誘導的IFN-β啟動子活性的抑制作用；B. Western blot 檢測MGF360-14L蛋白對MAVS誘導的TBK和IRF3的抑制作用A. Dual luciferase assay was used to detect the inhibitory effect of different concentrations of ASFV MGF360-14L on MAVS/ TRIM21-induced IFN-β promoter activity; B. TRIM21-Myc,TBK1, P-TBK1, IRF3, P-IRF3, MAVS-HA and MGF360-14L-Flag were analyzed by Western blot圖3 ASFV MGF360-14L抑制MAVS誘導的TBK1和IRF3的磷酸化Fig.3 MGF360-14L inhibits the phosphorylation of TBK1 and IRF3

2.4 MGF360-14L競爭性結合MAVS

前期研究結果表明，MGF360-14L和TRIM21互作，并且TRIM21與MAVS也具有相互作用。為了探究MGF360-14L蛋白、TRIM21和MAVS三者之間的相互作用，將TRIM21-Myc和MAVS-Flag質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293T細胞，或者不同濃度的MGF360-14L-eGFP與TRIM21-Myc和MAVS-Flag表達質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293T細胞，Co-IP競爭試驗結果顯示，MAVS與TRIM21結合，在轉(zhuǎn)染MGF360-14L質(zhì)粒后，MAVS能與MGF360-14L互作，且MGF360-14L存在時MAVS與TRIM21的互作被減弱(圖4A)。將TRIM21-Myc、MAVS-Flag和Ub-HA共轉(zhuǎn)染HEK293T細胞或者MGF360-14L-eGFP、TRIM21-Myc、MAVS-Flag和Ub-HA共轉(zhuǎn)染HEK293T細胞，Western blot檢測結果表明，TRIM21能夠促進MAVS的泛素化，MGF360-14L對TRIM21促進MAVS的泛素化有抑制作用(圖4B)。綜上所述，作者推測MGF360-14L通過與TRIM21競爭結合MAVS，抑制了TRIM21誘導的MAVS的泛素化，從而抑制Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生。

A. 將ASFV MGF360-14L-eGFP、MAVS-Flag和TRIM21-Myc蛋白表達質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293T細胞，進行Co-IP和Western blot檢測；B. 將MGF360-14L-eGFP、MAVS-Flag、RIM21-Myc和Ub-HA蛋白表達質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293T細胞，進行Co-IP試驗以及Western blot檢測A. HEK293T cells were transfected with MGF360-14L-eGFP, TRIM21-Myc, MAVS-Flag. Co-IP and Western blot were performed 24 h after transfection; B. HEK293T cells transfected with MGF360-14L-eGFP, TRIM21-Myc, MAVS-Flag and Ub-HA, Co-IP and Western blot were performed 24 h after transfection圖4 ASFV MGF360-14L抑制MAVS的泛素化Fig.4 MGF360-14L inhibits the ubiquitination of MAVS

3 討 論

MGF360-14L為ASFV的一種非結構蛋白，位于ASFV基因組左側(cè)可變區(qū)。已有文獻報道，當缺失強毒株Georgia/2007的6個MGF基因(包括MGF360-14L)，以及缺失強毒株ASFV HLJ/18的7個基因(包括MGF360-14L)后，缺失株ASFV-G-MGF和HLJ/18-7GD免疫豬均能完全抵抗強毒株的攻擊。但僅缺失強毒株Georgia/2007的MGF360-13L和MGF360-14L并未影響ASFV在細胞上的復制水平和對豬的致病性，提示MGF360-14L可能不是ASFV的毒力基因。但我們的前期研究結果表明，MGF360-14L能夠與IRF3互作，并通過招募TRIM21介導IRF3的K63位多聚泛素化，從而抑制IFN-β的產(chǎn)生，由此推測MGF360-14L可能參與ASFV逃避宿主先天性免疫系統(tǒng)，促進ASFV的感染。

雖然MAVS作為RNA病毒抑制Ⅰ型干擾素的靶基因，也有相關文獻報道某些DNA病毒能與MAVS互作，從而抑制Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生。例如，卡波氏肉瘤相關皰疹病毒(Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus，KSHV)的外膜蛋白ORF33與STING和MAVS互作，招募PPM1G促進STING和MAVS的去磷酸化，從而促進KSHV逃避先天性免疫反應；I型單純皰疹病毒(herpes simplex virus 1, HSV-1)的US11蛋白能夠與RIG-I相互作用，抑制RIG-I和MAVS的互作，從而下調(diào)Ⅰ型干擾素的表達；人皰疹病毒6B(human herpesvirus 6B, HHV-6B)的U26蛋白能夠降解MAVS，抑制RIG-I/MAVS信號通路介導的先天性免疫反應。也有研究表明，在病毒感染過程中，E3泛素連接酶TRIM21能夠靶向MAVS的K27多聚泛素化，促進TBK1的招募，從而上調(diào)Ⅰ型干擾素的表達，提高機體先天性免疫反應抵抗病毒入侵。

為了探討MGF360-14L是否通過MAVS途徑抑制Ⅰ型干擾素，從而逃避宿主先天性免疫系統(tǒng)，本研究采用雙熒光素酶試驗檢測MGF360-14L對MAVS誘導的IFN-β啟動子活性的影響，Co-IP和共定位檢測MGF360-14L與MAVS的互作關系，及Western blot分析MGF360-14L對MAVS和TRIM21誘導的TBK1和IRF3磷酸化的影響。研究結果顯示，MGF360-14L能抑制MAVS所誘導的IFN-β mRNA水平和啟動子活性(圖1A、B)。Co-IP試驗表明，MGF360-14L與MAVS具有相互作用，但并未進行內(nèi)源性的互作研究，而共定位試驗顯示，二者存在胞質(zhì)內(nèi)的共定位(圖2A～C)。進一步的研究表明，MGF360-14L能夠抑制TRIM21和MAVS共同誘導的IFN-β啟動子活性，并且對MAVS和TRIM21誘導的TBK1和IRF3磷酸化也具有抑制作用(圖3A和B)，作者初步推斷MGF360-14L與MAVS互作從而抑制IFN-β的產(chǎn)生。此外，MGF360-14L可能通過與TRIM21競爭結合MAVS，抑制TRIM21對MAVS的泛素化作用(圖4A和B)。本研究進一步探討了MGF360-14L的逃避宿主先天性免疫的作用機制，為ASF疫苗的研制提供線索。

4 結 論

非洲豬瘟病毒MGF360-14L通過與MAVS互作，抑制了TRIM21誘導的MAVS的泛素化，從而抑制Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生。