肖秋菊，唐 雪，譚 曉，肖星月，童麗穎，邵歡歡，陶 向，雍 彬

(四川師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，成都 610101)

【研究意義】馬鈴薯(SolanumtuberosumL.)是世界第四大作物，其種植面積和產(chǎn)量僅次于水稻、小麥和玉米，全球消費(fèi)量僅次于水稻和小麥。作為世界上馬鈴薯種植面積最大國家之一[1-2]，中國近年已將馬鈴薯列為主糧，該作物的安全生產(chǎn)事關(guān)國家糧食安全。馬鈴薯生產(chǎn)實(shí)踐中多采用塊莖營養(yǎng)繁殖，但營養(yǎng)繁殖會(huì)造成致病菌代代相傳并不斷積累，目前已報(bào)道的馬鈴薯病害有100多種，每年因病害減產(chǎn)10%～30%，嚴(yán)重時(shí)減產(chǎn)超過70%。由致病疫霉(Phytophthorainfestans)引發(fā)的晚疫病是一種全世界范圍內(nèi)絕大多數(shù)馬鈴薯種植區(qū)均有發(fā)生的最具毀滅性的病害，曾造成1845—1950年間的愛爾蘭大饑荒[3-5]，瘡痂鏈霉菌(Streptomycesscabiei)、茄科雷爾氏菌(Ralstoniasolanacearum)等也會(huì)對(duì)馬鈴薯安全生產(chǎn)造成嚴(yán)重威脅，茄科雷爾氏菌造成的青枯病是馬鈴薯生產(chǎn)中的第二大病害[6-7]。馬鈴薯瘡痂病是一種世界性土傳病害，可由S.scabies、S.acidiscabies、S.turgidiscabies、S.galilacus等多種鏈霉菌引發(fā)[8-9]。這3種病害均對(duì)馬鈴薯安全生產(chǎn)造成嚴(yán)重威脅，有效防控病害是保障馬鈴薯產(chǎn)量及質(zhì)量的重要途徑。長期以來馬鈴薯病害防控主要依靠噴施農(nóng)藥，加上我國農(nóng)業(yè)基礎(chǔ)設(shè)施建設(shè)落后，農(nóng)民安全用藥意識(shí)薄弱，大量使用化學(xué)農(nóng)藥與化學(xué)肥料，造成嚴(yán)重的農(nóng)殘超標(biāo)、土壤殘留、病原菌抗藥性增強(qiáng)和生態(tài)環(huán)境破壞等問題，環(huán)境友好型抑菌農(nóng)藥的研制極為迫切。為此，我國在農(nóng)業(yè)“十三五”規(guī)劃中明確提出化學(xué)肥料和農(nóng)藥“雙減”目標(biāo)，推動(dòng)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展和食品安全生產(chǎn)。靶向馬鈴薯病害的化學(xué)農(nóng)藥替代品的研發(fā)與應(yīng)用可為保障我國農(nóng)業(yè)綠色生產(chǎn)及實(shí)現(xiàn)國家“雙減”目標(biāo)提供產(chǎn)品和技術(shù)支撐?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】鈦(Titanium，Ti)是一種過渡金屬元素，在地殼中的含量超過0.6%，在生物體、水體中亦廣泛存在[10]。鈦具有“親生物”特性，對(duì)人體無害，是WHO唯一允許植入人體的金屬。已有研究證明，鈦能刺激人體內(nèi)吞噬細(xì)胞提升機(jī)體免疫力，并具有一定抑菌能力[11-12]。近年來，已將鈦應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，并證明鈦能提高植物體內(nèi)多種酶的活性[13-14]，促進(jìn)植物對(duì)養(yǎng)分的吸收和利用[15]。焦湞等[16]在煙草種子中注入低劑量的鈦離子，發(fā)現(xiàn)種子的發(fā)芽率以及葉片中的鉀含量均有提升。鈦除了對(duì)農(nóng)作物的產(chǎn)量品質(zhì)、生長發(fā)育產(chǎn)生積極的影響之外，在病蟲害防治方面也發(fā)揮著重要作用。鈦可有效抑制黃瓜霜霉病菌、白粉病菌、番茄和玫瑰的細(xì)菌性葉斑病菌的生長[17-19]。然而，自然界中的鈦元素常以氧化物、硅酸鹽結(jié)合態(tài)或鈦鐵礦等形式存在，難以為植物利用[20]。而離子狀態(tài)的鈦通常是鈦與鹵素生成的易揮發(fā)高價(jià)鈦鹵化物，且存在不穩(wěn)定、遇水易發(fā)生反應(yīng)等問題。光能變價(jià)離子鈦(Titanium ion of variable valence with light energy，TIVL)中的鈦是一種穩(wěn)定的新型鈦離子制劑[專利：US8308840B2；20151077 3354.4]，其中的鈦元素以離子(Ti4+與Ti3+)形式存在，于環(huán)境友好。已有田間試驗(yàn)顯示低濃度的TIVL可以提高光合作用效率、提高作物產(chǎn)量與品質(zhì)，使大豆籽粒中的蛋白質(zhì)含量和產(chǎn)量分別增加1.61%和16.34%[21]，顯著提升煙葉的香氣、口感等[22]；低濃度的TIVL還可防止低溫冷害顯著提高牧草、煙草等植物種子的發(fā)芽率、促進(jìn)植株根系生長[23]；另外TIVL能降低作物發(fā)病率與發(fā)病癥狀，李洪浩等[24]通過田間試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)使用TIVL(675 mL/hm2)對(duì)馬鈴薯晚疫病的防效可達(dá)40%以上。據(jù)此推測TIVL具有抑制馬鈴薯致病菌生長的功能。【本研究切入點(diǎn)】擬于培養(yǎng)基中加入不同濃度的TIVL培養(yǎng)致病疫霉、茄科雷爾氏菌和瘡痂病鏈霉菌3種馬鈴薯致病菌，分析TIVL對(duì)3種致病菌的影響?！緮M解決的關(guān)鍵問題】明確TIVL是否具有抑制馬鈴薯病原菌生長的作用，尋找適宜的TIVL抑菌濃度，為TIVL應(yīng)用于馬鈴薯病害防控領(lǐng)域提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

光能變價(jià)離子鈦(TIVL)采購于鈦谷(天津)科技有限公司，該制劑未添加其他金屬元素，鈦離子濃度為4 mg/mL。致病疫霉菌(P.infestans)由四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所提供，瘡痂鏈霉菌(CGMCC 4.1765)、茄科雷爾氏菌(CGMCC 1.2839)于中國普通微生物保藏管理中心購買。

1.2 培養(yǎng)基制備

1.2.1 瘡痂鏈霉菌培養(yǎng)基(SP-2培養(yǎng)基) 稱取酵母提取物4.0 g，麥芽提取物10.0 g，葡萄糖4.0 g，以蒸餾水定容1.0 L并調(diào)節(jié)pH至7.3(固體培養(yǎng)基加瓊脂粉15.0 g)，115 ℃高壓滅菌35 min。

1.2.2 茄科雷爾氏菌培養(yǎng)基(營養(yǎng)肉汁培養(yǎng)基) 稱取蛋白胨10.0 g，牛肉浸取物3.0 g，NaCl 5.0 g，以蒸餾水定容1.0 L并調(diào)節(jié)pH至7.0(固體培養(yǎng)基加瓊脂粉15.0 g)，121 ℃高壓滅菌20 min。

1.2.3 致病疫霉菌培養(yǎng)基(黑麥培養(yǎng)基) 稱取黑麥10 g加入100 mL水中，121 ℃高壓滅菌40 min，4層紗布過濾去除殘?jiān)?，于上清液中加? g蔗糖和1.5 g瓊脂粉定容至100 mL，121 ℃再次高壓滅菌20 min。

1.3 供試菌種活化

將4 ℃冰箱保存的瘡痂鏈霉菌和茄科雷爾氏菌分別劃線接種至固體SP-2和營養(yǎng)肉汁培養(yǎng)基，置于28和30 ℃培養(yǎng)，待長出單菌落后備用。從4 ℃冰箱保存的致病疫霉菌黑麥平板切取直徑5 mm的菌餅接種到黑麥培養(yǎng)基中央，18 ℃黑暗培養(yǎng)5～7 d。

1.4 菌液濃度選擇

挑取瘡痂鏈霉菌和茄科雷爾氏菌單菌落于1 mL無菌水中，以移液器吹打使之分散均勻，記為103倍稀釋菌液；依次吸取100 μL菌液加入900 μL無菌水中，吹打均勻，梯度稀釋至1010倍。分別取每個(gè)稀釋梯度下的菌液100 μL均勻涂布于固體SP-2或營養(yǎng)肉汁培養(yǎng)基，置于28和30 ℃培養(yǎng)至長出單菌落，選擇可清晰統(tǒng)計(jì)單菌落數(shù)量的梯度稀釋菌液作為最適稀釋濃度用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.5 平板抑菌實(shí)驗(yàn)

固體培養(yǎng)基經(jīng)高壓滅菌后冷卻至50 ℃左右，分別添加濃度為4 mg/mL的TIVL母液，使TIVL濃度為0、4、8、16 mg/L，輕輕搖勻后倒平板。

挑取瘡痂鏈霉菌單菌落于1 mL無菌水中，經(jīng)梯度稀釋并涂布于SP-2培養(yǎng)基，發(fā)現(xiàn)1010倍稀釋菌液培養(yǎng)60 h后可清晰統(tǒng)計(jì)單菌落數(shù)量，因此選擇1010倍稀釋菌液用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

挑取茄科雷爾氏菌單菌落于1 mL無菌水中，經(jīng)梯度稀釋并涂布于營養(yǎng)肉汁平板培養(yǎng)基，發(fā)現(xiàn)茄科雷爾氏菌單菌落稀釋1010倍后，涂布于營養(yǎng)肉汁平板培養(yǎng)3～4 d能清晰統(tǒng)計(jì)單菌落數(shù)量，因此選擇1010倍稀釋菌液用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。分別取最適稀釋濃度的瘡痂鏈霉菌和茄科雷爾氏菌各100 μL均勻涂布于含不同濃度TIVL的固體培養(yǎng)基上，置于相應(yīng)溫度條件下培養(yǎng)(瘡痂鏈霉菌28 ℃培養(yǎng)60 h，培茄科雷爾氏菌30 ℃培養(yǎng)108 h)，于不同時(shí)間拍照記錄菌落生長情況。

從4 ℃冰箱保存的致病疫霉菌黑麥平板切取直徑5 mm的菌餅，接種到含有不同濃度TIVL的黑麥平板中央，18 ℃黑暗培養(yǎng)5～7 d，拍照記錄致病疫霉菌圈生長情況。以田間生產(chǎn)中常用的馬鈴薯晚疫病防治農(nóng)藥福帥得(氟啶胺500 g/L，日本石原產(chǎn)業(yè)株式會(huì)社)對(duì)致病疫霉的抑制效果作為對(duì)照，分析TIVL的抑菌效果：黑麥培養(yǎng)基中加入稀釋1000倍(0.5 g/L氟啶胺)和500倍(1.0 g/L氟啶胺)的福帥得，并切取5 mm直徑的菌餅置于平板中央，18 ℃黑暗培養(yǎng)7 d，拍照記錄致病疫霉菌圈生長情況。

1.6 透射電子顯微鏡樣品制備與觀察

將含有8 mg/L TIVL的致病疫霉固體培養(yǎng)基上生長的致病疫霉的菌絲輕輕刮下，置于1.5 mL尖底EP管內(nèi)。菌絲體積不小于米粒大小，沿管壁加入由Sorensen緩沖液配置的5%的戊二醛固定液，不沖散菌絲，于4 ℃冰箱內(nèi)固定過夜，0.1 mol/L磷酸緩沖液清洗3次，置入1%鋨酸后固定1.5 h，磷酸緩沖液漂洗3次，經(jīng)50%、70%、80%、90%乙醇逐級(jí)脫水(每次15 min)，90%丙酮脫水15 min，再經(jīng)100%丙酮脫水3次(每次15 min)，Embed 812樹脂滲透并包埋，60 ℃高溫聚合24 h后修塊，采用超薄切片機(jī)(徠卡UC7)切片，經(jīng)2%醋酸雙氧鈾染色液——檸檬酸鉛染色液雙重染色法染色(各25 min，每種染色劑染色后均用蒸餾水漂洗數(shù)次)，晾干，置于Tecnai G2 F20 S-TWIN透射電鏡觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 TIVL對(duì)致病疫霉菌的抑制作用

切取致病疫霉菌餅接種至含有不同濃度TIVL的黑麥培養(yǎng)基上，培養(yǎng)第5天時(shí)，0 mg/L TIVL平板上致病疫霉已有較好的長勢，而4和8 mg/L TIVL的平板上致病疫霉菌才開始生長，且長勢較弱，16 mg/L TIVL平板上未見病菌生長跡象(圖1)。經(jīng)測量，培養(yǎng)5 d時(shí)0、4、8 mg/L TIVL黑麥平板上菌圈直徑分別為(3.77±0.06)、(3.67±0.12)和(3.13±0.15)cm；培養(yǎng)6 d時(shí)菌圈直徑分別為(4.83±0.15)、(4.60±0.10)和(4.03±0.15)cm；培養(yǎng)第7天時(shí)菌圈直徑達(dá)到(6.40±0.10)、(6.17±0.06)和(5.20±0.36)cm(表1)。16 mg/L TIVL黑麥平板直至第7天時(shí)仍未見菌圈。添加了福帥得的黑麥培養(yǎng)基培養(yǎng)第7天時(shí)同樣未見明顯的致病疫霉菌圈形成。表明TIVL可顯著抑制致病疫霉的生長，當(dāng)TIVL濃度達(dá)到16 mg/L時(shí)，抑菌效果與福帥得相當(dāng)。

圖1 不同濃度TIVL與Fluazinam對(duì)致病疫霉生長的影響Fig.1 Effect of different TIVL and fluazinam concentrations on the growth of Phytophthora infestans

表1 不同濃度TIVL對(duì)3種病原菌的菌落數(shù)和菌圈直徑的影響

2.2 TIVL對(duì)瘡痂鏈霉菌的抑制作用

將瘡痂鏈霉菌涂布在含有不同TIVL濃度的平板上，其生長狀況如圖2所示，培養(yǎng)36 h時(shí)，含0和4 mg/L TIVL的培養(yǎng)基上瘡痂鏈霉菌生長趨勢差別較小，分別含有(217±23)、(221±24)個(gè)菌落；含8 mg/L TIVL的培養(yǎng)基上菌落則明顯少于0和4 mg/L的TIVL平板，只有(165±17)個(gè)單菌落；而含16 mg/L TIVL的培養(yǎng)基上則未見單菌落長出(表1)。培養(yǎng)48 h時(shí)，0和4 mg/L TIVL平板上部分單菌落已出現(xiàn)“融合”現(xiàn)象，而8 mg/L的平板上仍可清晰分辨單菌落，菌落數(shù)分別為(375±31)、(227±15)和(174±19)個(gè)(表1)。培養(yǎng)60 h時(shí)，8 mg/L的平板上亦出現(xiàn)單菌落的融合，而16 mg/L TIVL平板上仍未見單菌落長出，表明TIVL可顯著抑制瘡痂鏈霉菌的生長。

圖2 不同濃度TIVL對(duì)瘡痂鏈霉菌生長的影響Fig.2 Effect of different TIVL concentrations on the growth of Streptomyces scabiei

2.3 TIVL對(duì)茄科雷爾氏菌的抑制作用

將茄科雷爾氏菌涂布于含有不同TIVL濃度的平板上觀察菌落生長情況(圖3)。培養(yǎng)36 h時(shí)，0 mg/L的TIVL平板上有菌落(690±40)個(gè)，4和8 mg/L TIVL濃度下均未見明顯菌落；培養(yǎng)60 h時(shí)，0 mg/L的TIVL平板上長出(678±26)個(gè)單菌落，4 mg/L TIVL濃度下有菌落(323±31)個(gè)，而8 mg/L TIVL平板上單菌落數(shù)仍為0個(gè)；84 h時(shí)，8 mg/L濃度下亦可見菌落長出，數(shù)量為(76±7)個(gè)，但明顯少于0 mg/L[(704±21)個(gè)]和4 mg/L[(329±9)個(gè)]；108 h時(shí)，3種TIVL濃度下的菌落數(shù)分別為(554±38)、(359±15)、(204±6)個(gè)。表明TIVL可顯著抑制茄科雷爾氏菌的生長。

圖3 不同濃度TIVL對(duì)茄科雷爾氏菌生長的影響Fig.3 Effect of different TIVL concentrations on the growth of Ralstonia solanacearum

2.4 TIVL對(duì)致病疫霉影響的顯微特征觀察

以透射電鏡觀察含8 mg/L TIVL的培養(yǎng)基培養(yǎng)致病疫霉菌，在2000倍放大倍數(shù)下可見加入8 mg/L TIVL黑麥平板培養(yǎng)的致病疫霉菌體的形態(tài)、大小均發(fā)生改變，多數(shù)菌體變得不規(guī)則(圖4-A，4-D)；放大至25 000倍時(shí)，可觀察到菌絲的細(xì)胞質(zhì)發(fā)生收縮，液泡變大(圖4-B，4-E)；在50 000倍放大倍數(shù)下，可見致病疫霉細(xì)胞質(zhì)和周質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)較多黑點(diǎn)(圖4-C，4-F)。上述結(jié)果表明TIVL的抑菌作用可能因?yàn)殁侂x子進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)并破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)。

A、D.放大2000倍；B、E.放大25 000倍；C、F.放大50 000倍A, D.2000 times magnification; B, E.25 000 times magnification; C, F.50 000 times magnification圖4 TIVL對(duì)致病疫霉細(xì)胞結(jié)構(gòu)的影響Fig.4 Effect of TIVL on the cellular structure of Phytophthora infestans

3 討 論

作為WHO唯一允許植入人體的金屬，鈦在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域具有較好的應(yīng)用前景。近年來，已有研究證明鈦不僅具有一定的促生作用[13-15]，在作物病害防控方面也能發(fā)揮作用[17-19]。本研究所用的TIVL中鈦以離子形式存在，相比自然存在的氧化物、硅酸鹽結(jié)合態(tài)或鈦鐵礦形式，易于被植物吸收利用。已有的研究表明TIVL同樣具有較好的促生和抑菌作用[21-24]，但目前尚未見TIVL抑制馬鈴薯致病菌生長的報(bào)道。本研究以含有4、8、16 mg/L的TIVL的培養(yǎng)基培養(yǎng)致病疫霉、瘡痂鏈霉菌、茄科雷爾氏菌3種馬鈴薯病原菌，發(fā)現(xiàn)16 mg/L的TIVL完全抑制3種病原菌的生長。其中16 mg/L TIVL對(duì)致病疫霉的抑菌效果與馬鈴薯大田生產(chǎn)中常用的農(nóng)藥福帥得(有效成分氟啶胺)的抑菌效果相當(dāng)：固體培養(yǎng)基培養(yǎng)5～7 d，無菌圈長出。針對(duì)馬鈴薯瘡痂病和青枯病病原菌，含16 mg/L TIVL的固體培養(yǎng)基分別培養(yǎng)60和108 h，均未見單菌落。范延芬等[25]曾以不同濃度TIVL的固體營養(yǎng)肉汁培養(yǎng)基培養(yǎng)茄科雷爾氏菌，同樣發(fā)現(xiàn)16 mg/L TIVL對(duì)茄科雷爾氏菌有顯著的抑菌作用。但范延芬等所用茄科雷爾氏菌分離自黃瓜青枯病株，該菌株能否引發(fā)馬鈴薯青枯病尚不得而知。因此，本研究選用能引發(fā)馬鈴薯青枯病的茄科雷爾氏菌為材料，通過抑菌實(shí)驗(yàn)證明TIVL濃度越大對(duì)馬鈴薯青枯病病原菌的生長的抑制效果越明顯，濃度達(dá)到16 mg/L時(shí)完全抑制病菌的生長，說明TIVL能有效抑制馬鈴薯病原菌，具有作為農(nóng)用殺菌劑在田間生產(chǎn)中推廣應(yīng)用的前景。

抑菌劑通常是通過破壞細(xì)胞壁、細(xì)胞膜等細(xì)胞結(jié)構(gòu)或干擾新陳代謝而達(dá)到抑菌效果。TIVL作為一種新型農(nóng)用制劑，其抑菌機(jī)理鮮見報(bào)道。但TiO2抑菌相關(guān)研究已取得一定進(jìn)展：TiO2具有光催化活性，可催化產(chǎn)生O2-及·OH等活性自由基，在溶液中O2-可與2分子·OH產(chǎn)生的H2O2反應(yīng)，生成·OH、OH-與O2，而·OH 與O2可將有機(jī)質(zhì)氧化成CO2與H2O，這種氧化能力可破壞微生物細(xì)胞膜導(dǎo)致細(xì)胞破裂，從而達(dá)到抑菌效果[26-28]。TIVL中的鈦以Ti4+與Ti3+形式存在，接收光能后鈦可在三價(jià)和四價(jià)之間發(fā)生價(jià)位跳躍，產(chǎn)生活性自由基，形成強(qiáng)氧化能力。因此推測TIVL對(duì)致病疫霉、茄科雷爾氏菌和瘡痂鏈霉菌的抑菌作用機(jī)理可能與TiO2相似。楊薇薇等[29]在假單胞菌中添加鈦離子后通過透射電子顯微鏡圖可觀察到細(xì)胞質(zhì)和周質(zhì)內(nèi)均有黑點(diǎn)產(chǎn)生，通過EDS對(duì)納米粒子分析證明黑點(diǎn)為鈦粒子。在本研究中以含有TIVL的培養(yǎng)基培養(yǎng)的致病疫霉胞內(nèi)亦有黑點(diǎn)出現(xiàn)，表明鈦離子已進(jìn)入到致病疫霉胞內(nèi)，并在胞內(nèi)通過氧化還原反應(yīng)對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)造成破壞，發(fā)揮抑菌作用。

4 結(jié) 論

TIVL對(duì)致病疫霉、茄科雷爾氏菌和瘡痂病鏈霉菌3種馬鈴薯致病菌均有較好的抑菌作用，當(dāng)TIVL 濃度達(dá)到16 mg/L時(shí)3種供試菌株已完全不能生長。TIVL進(jìn)入致病菌胞內(nèi)，通過氧化還原反應(yīng)破壞細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)，抑制病菌正常生長，實(shí)現(xiàn)抑菌作用。本研究可為馬鈴薯綠色生產(chǎn)和實(shí)現(xiàn)化學(xué)肥料與化學(xué)農(nóng)藥“雙減”目標(biāo)提供產(chǎn)品和技術(shù)支撐。