楊海峰,張新乾,于興旺,郝 璞,樊俐嬌,王樹(shù)森,于鳳強(qiáng),阿拉騰蘇和

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，呼和浩特 010000;2.內(nèi)蒙古蒙草生態(tài)環(huán)境(集團(tuán))股份有限公司，呼和浩特 010000;3.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)沙漠治理學(xué)院, 呼和浩特 010000;4.鄂爾多斯林業(yè)和草原事業(yè)發(fā)展中心，內(nèi)蒙古 鄂爾多斯 017000;5.鄂爾多斯造林總場(chǎng)，內(nèi)蒙古 鄂爾多斯 017000)

【研究意義】植物在生長(zhǎng)過(guò)程中，因?yàn)樗幁h(huán)境不同而遭受各種脅迫，繼而影響植物正常生長(zhǎng)發(fā)育，使林木經(jīng)濟(jì)產(chǎn)量降低，影響農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展。研究表明，NAC 轉(zhuǎn)錄因子可通過(guò)參與植物激素信號(hào)通路來(lái)調(diào)節(jié)植物的逆境響應(yīng)。但目前對(duì)于木本植物NAC基因的抗逆研究雖有一定了解但相對(duì)滯后，因此，開(kāi)展沙柳NAC轉(zhuǎn)錄因子的抗逆研究，探究該基因在非生物脅迫下的應(yīng)答分析，將有助于進(jìn)一步增加木本植物NAC轉(zhuǎn)錄因子的分子抗逆機(jī)制研究，對(duì)于分析沙柳NAC基因功能以及探究其抗逆分子機(jī)制具有重要應(yīng)用價(jià)值。【前人研究進(jìn)展】NAC是植物細(xì)胞內(nèi)特有的轉(zhuǎn)錄因子，也是迄今為止植物基因組中發(fā)現(xiàn)的最大轉(zhuǎn)錄因子家族之一[1]。NAC轉(zhuǎn)錄因子包含5個(gè)典型的NAC子結(jié)構(gòu)域：A、B、C、D和E，由大約150個(gè)氨基酸組成[2-3]。NAC轉(zhuǎn)錄因子的命名最初源于被發(fā)現(xiàn)含有NAC結(jié)構(gòu)域的3個(gè)同源基因的首字母，即在胚胎和花朵發(fā)育中起作用的矮牽牛無(wú)頂端分生組織中克隆出來(lái)的NAM基因、ATAF1/2以及在擬南芥中克隆得到的CUC2(對(duì)于杯狀子葉)基因[4-5]。伴隨著基因組學(xué)的快速發(fā)展，目前對(duì)NAC轉(zhuǎn)錄因子的研究也已逐步深入。在擬南芥[Arabidopsisthaliana(L.) Heynh. (Cruciferae)]、水稻(OryzasativaL.)、玉米[ZeamaysL. (Gramineae)]、大豆[Glycinemax(Linn.) Merr. (Leguminosae)]、番茄[LycopersiconesculentumMill. (Solanaceae)]、菠蘿[Ananascomosus(Linn.) Merr.]、柑橘[CitrusreticulataBlanco (Rutaceae)]、沙冬青[Ammopiptanthusmongolicus(Leguminosae)]、小黑楊[Populus×xiaoheiT. S. Hwang et Liang (Salicaceae)]、柳樹(shù)(蘇柳)等植物中均證實(shí)了NAC轉(zhuǎn)錄因子的存在和功能。研究發(fā)現(xiàn)，蘇柳中SlNAC1、SlNAC2基因分別可被干旱、鹽誘導(dǎo)，且表達(dá)量均上調(diào)[6]。NAC7基因已在小黑楊中成功克隆，主要在根中表達(dá)并且對(duì)鹽脅迫有響應(yīng)[7]。在水稻和擬南芥基因組中，成功預(yù)測(cè)了149和106個(gè)NAC家族轉(zhuǎn)錄因子，這些NAC轉(zhuǎn)錄因子對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育均具有重要的調(diào)控作用[8-9]。Jeong等[10]研究發(fā)現(xiàn)，水稻中過(guò)量表達(dá)Os11g03300/OsNAC10的植株在生殖階段對(duì)干旱具有較強(qiáng)的耐受性，表明這2個(gè)NAC基因?qū)Ω珊得{迫具有重要作用。脫落酸(Abscisic Acid)ABA處理過(guò)后的少數(shù)OsNAC基因?qū)儆赟NAC亞組和NAM/CUC3亞組，并在葉片和穗中產(chǎn)生應(yīng)答反應(yīng)[11]。此外，Ooka等[12]發(fā)現(xiàn)NAM和CUC2都參與莖頂端分生組織的形成和發(fā)育，而且還在NAM和NAC1亞組中發(fā)現(xiàn)了預(yù)測(cè)的其它NAC蛋白。上述研究說(shuō)明NAC轉(zhuǎn)錄因子不僅在植物的抗逆中具有重要功能，而且也參與了植物的形態(tài)建成和發(fā)育?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】我國(guó)西部地區(qū)是典型的鹽堿地沙質(zhì)土壤，維持其植物多樣性以及生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定是重中之重?；哪参锷沉?SalixpsammophilaC. Wang et Ch. Y. Yang) 在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中，對(duì)環(huán)境的適應(yīng)和抵抗能力逐漸增強(qiáng)。沙柳的根系發(fā)達(dá)、發(fā)芽勢(shì)強(qiáng)[13]，是少數(shù)能在鹽堿地生長(zhǎng)的植物之一，維持其穩(wěn)定的生物量至關(guān)重要。因此，本研究以沙柳為實(shí)驗(yàn)材料，對(duì)沙柳NAC轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行同源克隆、生物信息學(xué)分析以及抗逆機(jī)制的研究具有重要意義?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究以沙柳為研究對(duì)象，克隆沙柳SpsNAC034基因的編碼序列(Coding Sequence, CDS)，進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并通過(guò)模擬非生物脅迫揭示該基因在沙柳經(jīng)高溫、低溫、鹽以及干旱4種逆境后的響應(yīng)特性，為探究沙柳的抗逆育種提供應(yīng)用依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

該研究使用的實(shí)驗(yàn)材料沙柳(SalixpsammophilaC. Wang et Ch. Y. Yang)是來(lái)自內(nèi)蒙古鄂爾多斯達(dá)拉特旗吉格斯太鎮(zhèn)的沙柳種質(zhì)資源庫(kù)的無(wú)性系，截取長(zhǎng)勢(shì)良好植株水培備用。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 沙柳總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄cDNA的合成 使用天根RNAprep Pure Polysugar Polyphenol Plant Total RNA Extraction Kit總RNA 提取試劑盒(DP441)提取沙柳總RNA，反轉(zhuǎn)錄(FastKing gDNA Dispelling RT SuperMix)合成cDNA，儲(chǔ)存于-20 ℃冰箱備用。

1.2.2 UTR區(qū)設(shè)計(jì)特異性引物及基因克隆 利用擬南芥NAC基因與歐洲紅皮柳和毛果楊進(jìn)行同源比對(duì)分析之后，再用Primer 5.0軟件在基因UTR區(qū)設(shè)計(jì)特異性引物NAC034-F1(TTATTCGAGGCGGTCCGA)、NAC034-F2(GGAGTTGGAGTTCAAGTCTTCA AG)，送中美泰和生物公司合成。

以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，最佳退火溫度60 ℃。反應(yīng)體系20 μL: cDNA 1 μL，上下游引物各0.5 μL，A8高保真酶(2×A8 Fast HiFi PCR MasterMix)10 μL，蒸餾水補(bǔ)至20 μL。反應(yīng)程序：98 ℃預(yù)變性5 min，98 ℃變性1 min， 60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸5 min后將所得PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，凝膠成像儀顯示其與目的基因條帶一致后用Takara凝膠回收試劑盒回收目的基因。利用膠回收所得目的片段連接克隆載體(pEASY-Blunt zero Cloning Vector)后轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞。待含有相應(yīng)抗生素的固體LB板長(zhǎng)出單菌落后，挑取單菌落通過(guò)PCR檢測(cè)目標(biāo)條帶正確后送全式金生物公司測(cè)序。

1.2.3 沙柳SpsNAC034基因生物信息學(xué)分析 利用在線網(wǎng)站NCBI 的 ORF分析SpsNAC034基因的開(kāi)放閱讀框；同源氨基酸序列用Phytozome 11數(shù)據(jù)庫(kù)查詢；分別通過(guò)T-COFFEE(http://tcoffee.crg.cat/apps/tcoffee/index.html)、MEME Suite(http://meme-suite.org/)進(jìn)行氨基酸多序列以及結(jié)構(gòu)域的比對(duì); MEGA 6.0和ClustalX 2.0構(gòu)建進(jìn)化樹(shù); ExPASy和ExPASy-ProtParam tool分析SpsNAC034氨基酸的理化特性，包括總平均疏水指數(shù)、原子量、分子量、理論等電點(diǎn)、蛋白質(zhì)不穩(wěn)定指數(shù)等; 利用在線網(wǎng)址(http://www.cbs.dtu.dk/ services/TMHMM/)和Singal P4.1查詢確定SpsNAC034蛋白是否存在信號(hào)肽、跨膜結(jié)構(gòu)；將SpsNAC034基因的蛋白序列上傳至NPS(@https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsaautomat.pl?page=/NPSA/npsa_gor4.html)、Swiss model(http://swiss model.expasy.org/)分析蛋白質(zhì)二三級(jí)結(jié)構(gòu)；通過(guò)WOLF PSORT(http: //www.genscript.com/wolf-psort.html)進(jìn)行亞細(xì)胞定位的分析預(yù)測(cè)[14-15]。BAR(http://bar.utoronto.ca)楊樹(shù)基因數(shù)據(jù)庫(kù)在線預(yù)測(cè)基因的組織特異表達(dá)情況[16]。

1.2.4 沙柳SpsNAC034基因組織特異性表達(dá)RT-PCR分析 利用1.2.1以上提取的RNA的多糖多酚試劑盒提取沙柳各組織部位(根、葉、花、嫩莖、成熟莖、嫩芽)的RNA，并反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。再利用1.2.2克隆所得的SpsNAC034基因的CDS序列通過(guò)Primer3.0設(shè)計(jì)特異性定量引物qNAC034-F1(CTCTGATTCGGCTGATCCTC)和qNAC034-R1(TTC ATCCGTAGGACGAAACC)，送中美泰和生物公司合成。以cDNA為模板，UBQ(UBQ_F-AAGCCCAAG AAGATCAAGCA和 UBQ_R-ACCACCAGCCTTCTGGTAAA)為內(nèi)參，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析SpsNAC034基因在沙柳不同組織部位基因的相對(duì)表達(dá)量。根據(jù)公式2-ΔΔCt分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，再通過(guò)SPSS(Statistical Product and Service Solutions)軟件進(jìn)行顯著性分析。

1.2.5 沙柳SpsNAC034基因非生物脅迫處理下的定量表達(dá)分析 選取水培處理后長(zhǎng)勢(shì)良好的嫩枝，將其分別置于20%聚乙二醇6000 (PEG-6000)和250 mmol/L NaCl溶液中于25 ℃培養(yǎng)箱中模擬干旱和鹽脅迫，蒸餾水處理作為對(duì)照(CK)，同樣置于25 ℃培養(yǎng)箱。為了探究溫度脅迫對(duì)基因表達(dá)量的影響，將其分別置于低溫(4 ℃)和高溫(40 ℃)培養(yǎng)箱中模擬溫度脅迫。以上處理均提供14 h光照，10 h黑暗進(jìn)行試驗(yàn)培養(yǎng)。分別于脅迫處理1、2、3、4、6、8、12、24、48 h后，采集不同處理下包括對(duì)照組的葉片，每種處理的樣品隨機(jī)采集并混樣，3次生物學(xué)重復(fù)。采樣后置于液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

2 結(jié)果與分析

2.1 SpsNAC034基因克隆

以所提沙柳的RNA反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模板，SpsNAC034-F1和SpsNAC034-R1為特異性引物進(jìn)行目標(biāo)序列克隆。電泳結(jié)果顯示目的序列長(zhǎng)度與目標(biāo)條帶一致(圖1)。測(cè)序后獲得長(zhǎng)1797 bp的編碼序列(Coding Sequence, CDS)，編碼598個(gè)氨基酸(圖2)。

M:Trans2K DNA Marker；SpsNAC034: SpsNAC034克隆片段M: Trans2K DNA Marker; SpsNAC034: SpsNAC034 clone fragment圖1 目的基因擴(kuò)增檢測(cè)Fig.1 Target gene amplification detection

圖2 SpsNAC034基因CDS及蛋白序列Fig.2 CDS and protein sequence of SpsNAC034 gene

2.2 SpsNAC034基因的生物信息學(xué)分析

2.2.1SpsNAC034基因的氨基酸同源序列比對(duì)分析 將SpsNAC034基因與歐洲紅皮柳(SapurV1A.0003s0310.1)、毛果楊(Potri.002G182400.1)、擬南芥(AT4G35580.1)、葡萄(GSVIVT01027470001)、木薯(Manes.05G014800.1)、水稻(LOC_Os06g01230.1)、高粱(Sobic.001G290400.1)編碼的同源氨基酸序列進(jìn)行多序列比對(duì)分析(圖3)。SpsNAC034基因與以上同源氨基酸序列均具有典型的保守結(jié)構(gòu)域NAM，在線網(wǎng)址Pfam顯示SpsNAC034氨基酸序列150～279(C～E區(qū)域)為NAM結(jié)構(gòu)域。且對(duì)比分析以上氨基酸序列發(fā)現(xiàn)NAM結(jié)構(gòu)域的序列相對(duì)保守，上述預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)的典型NAM結(jié)構(gòu)域特征，表明本研究克隆基因隸屬NAC轉(zhuǎn)錄因子家族。

a: 同源氨基酸多序列比對(duì)；b: 同源結(jié)構(gòu)域比對(duì)a: Homologous amino acid multiple sequence alignment; b: Homologous domain alignment圖3 SpsNAC034基因氨基酸多序列比對(duì)和同源結(jié)構(gòu)域比對(duì)Fig.3 Amino acid multiple sequence alignment and homology domain alignment of SpsNAC034 gene

利用MEME Suite將SpsNAC034基因與以上植物的氨基酸同源序列進(jìn)行同源結(jié)構(gòu)域的分析比對(duì)，表明上述同源序列既存在相似結(jié)構(gòu)域，也存在一定的差異結(jié)構(gòu)域(圖3)。由圖3-a的同源氨基酸多序列比對(duì)和圖3-b的同源結(jié)構(gòu)域比對(duì)可知，SpsNAC034基因與以上同源序列均具有C、D、E 3個(gè)同源區(qū)域，該區(qū)域主要為NAM結(jié)構(gòu)域，具有較強(qiáng)保守性；但也存在較大的差異區(qū)域，其中A、B、F、G、H、I區(qū)域?yàn)槟颈局参锱c草本植物的差異區(qū)域，表明可能木本和草本植物存在分化差異，尤其是A、B區(qū)域?yàn)樯沉蜌W洲紅皮柳特有的結(jié)構(gòu)域，其他物種不具有，表明這可能是柳屬分化的一個(gè)特征區(qū)域。

2.2.2SpsNAC034基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建 將 SpsNAC034氨基酸序列和其他物種的同源序列構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)。表明，SpsNAC034基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)共分為木本植物和草本植物兩個(gè)大類。木本植物聚為一個(gè)大類，其中SpsNAC034基因與歐洲紅皮柳、毛果楊的NAC034基因[17]聚為一類；草本植物聚為另一個(gè)大類，將同為禾本科以及單子葉植物的高粱和水稻聚為一亞類，其它草本植物各為一亞類。表明，楊柳科植物的NAC034同源基因的親緣關(guān)系更密切，與草本植物同源基因的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。推測(cè)NAC034基因在木本和草木本植物間存在一定的分化，該結(jié)果與上述氨基酸同源序列分析的結(jié)果一致。

2.2.3 SpsNAC034氨基酸的理化特性分析 SpsNAC034蛋白在第183個(gè)氨基酸處疏水性最強(qiáng)，最大值達(dá)3.056，第225個(gè)氨基酸處親水性最強(qiáng)，最小值達(dá)-3.078，總平均疏水指數(shù)(GRAVY)達(dá)到-0.510，屬于親水性蛋白。其蛋白分子式為C2866H4478N788O928S31，總原子量9091，分子量65 815.66 kDa，理論等電點(diǎn)(pI)5.32，在氨基酸成分中，絲氨酸(Ser)的含量最高，為14.0%。SpsNAC034蛋白攜帶正、負(fù)電荷氨基酸殘基(Arg+Lys、Asp+Glu)總數(shù)分別為50和73。 預(yù)測(cè)結(jié)果顯示蛋白質(zhì)半衰期是30 h，不穩(wěn)定指數(shù)為56.83，將其歸類為不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)。

圖4 SpsNAC034 基因系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.4 SpsNAC034 gene phylogenetic tree

圖5 SpsNAC034蛋白親水疏水性分析Fig.5 Hydrophobicity analysis of SpsNAC034 protein

同時(shí)，psNAC034蛋白沒(méi)有跨膜結(jié)構(gòu)和信號(hào)肽。

2.2.4 SpsNAC034蛋白二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 在線預(yù)測(cè)SpsNAC034蛋白的二級(jí)蛋白結(jié)構(gòu)(圖6)發(fā)現(xiàn)，其主要包括延伸鏈(Extended strand)、α螺旋(Alpha helix)以及無(wú)規(guī)則卷曲(Random coil)，分別占18.73%、16.72%、64.55%。無(wú)規(guī)則卷曲為主要結(jié)構(gòu)，α螺旋占比最小，其中N端二級(jí)結(jié)構(gòu)主要以延伸鏈為主， C端以無(wú)規(guī)則卷曲為主要結(jié)構(gòu)。

藍(lán)色：α螺旋；紫色：無(wú)規(guī)則卷曲；紅色:延伸鏈 Blue: Alpha helix;Purple: Random coil;Red: Extended strand圖6 SpsNAC034蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.6 Secondary structure of SpsNAC034 protein

通過(guò)SWISS-MODEL預(yù)測(cè)SpsNAC034蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)(圖7)，預(yù)測(cè)結(jié)果顯示GMQE(全局模型質(zhì)量評(píng)估)為0.13，覆蓋率為0.26；SpsNAC034蛋白與3ulx.1.A的相似度最高，3ulx.1.A為應(yīng)激誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子 NAC1，是水稻處于逆境時(shí)響應(yīng) NAC1 保守結(jié)構(gòu)域的晶體結(jié)構(gòu)，SpsNAC034蛋白與其相似度達(dá)到40%，表明SpsNAC034 蛋白與NAC1很可能存在一定的功能相似性。

圖7 SpsNAC034蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.7 Tertiary structure of SpsNAC034 protein

2.2.5 亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè) 根據(jù)亞細(xì)胞定位軟件WOLF PSORT對(duì)SpsNAC034蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位(表1)。鑒于它位于細(xì)胞核 (NUC) 中，準(zhǔn)確率為 85%，對(duì)該蛋白的初步分析其可能在細(xì)胞核中起作用。

表1 SpsNAC034亞細(xì)胞定位

2.3 SpsNAC034基因的組織特異性表達(dá)預(yù)測(cè)與定量表達(dá)分析

根據(jù)楊樹(shù)基因組在線表達(dá)分析數(shù)據(jù)庫(kù)BAR，以SpsNAC034基因在毛果楊中的同源基因Potri.002G182400.1為依據(jù)進(jìn)行檢索，預(yù)測(cè)其在楊樹(shù)不同組織內(nèi)的表達(dá)特異性(圖8)。從預(yù)測(cè)結(jié)果推測(cè)，SpsNAC034基因在花中相對(duì)表達(dá)量最高，在韌皮部、葉和根中均少量表達(dá)，其他部位表達(dá)不明顯。

圖8 SpsNAC034表達(dá)量預(yù)測(cè)Fig.8 SpsNAC034 expression prediction

通過(guò)RT-PCR檢測(cè)分析SpsNAC034基因在沙柳各組織部位的相對(duì)表達(dá)量，NAC034基因在花中的相對(duì)表達(dá)量最高，其次在成熟莖、葉片、根以及嫩芽中的表達(dá)量依次降低(圖9)。此結(jié)果與上述楊樹(shù)基因數(shù)據(jù)庫(kù)BAR在線預(yù)測(cè)SpsNAC034基因表達(dá)特異性一致。推測(cè)SpsNAC034基因在不同組織中相對(duì)表達(dá)量存在差異可能是由于該基因?qū)ι沉煌M織發(fā)育或抗逆的生理調(diào)控有關(guān)。

不同小寫(xiě)字母代表P<0.05水平差異顯著Different lowercase letters represent significant differences at the level of P<0.05圖9 SpsNAC034基因在不同組織部位的相對(duì)表達(dá)Fig.9 Relative expression of SpsNAC034 gene in different tissues

2.4 SpsNAC034基因非生物脅迫處理下的定量表達(dá)分析

從圖10可知，經(jīng)高溫、低溫、鹽以及干旱脅迫處理，SpsNAC034基因均有響應(yīng)。其中經(jīng)低溫和高溫脅迫后，基因表達(dá)量迅速積累，其表達(dá)水平分別在1和2 h處達(dá)到高峰，隨后下降，基本與對(duì)照組維持在同一水平；鹽處理后，前8 h其基因表達(dá)相對(duì)穩(wěn)定，而在8 h之后其表達(dá)量開(kāi)始逐漸增高，并在48 h處達(dá)到最高; PEG模擬干旱條件下，其表達(dá)水平迅速增加，在1 h時(shí)達(dá)到峰值，之后緩慢下降，維持在較低水平。表明SpsNAC034基因在低溫、高溫、鹽和干旱脅迫下均顯著上調(diào)，說(shuō)明該基因在非生物脅迫下有顯著響應(yīng)，其可能在對(duì)這些環(huán)境刺激的反應(yīng)中發(fā)揮一定作用。

*代表P<0.05水平差異顯著* represents a significant difference at the level of P<0.05圖10 SpsNAC034基因在不同逆境下的相對(duì)表達(dá)量Fig.10 Relative expression of SpsNAC034 gene under different adversities

3 討 論

本研究將SpsNAC034基因與其同源序列進(jìn)行氨基酸多序列及結(jié)構(gòu)域比對(duì)、進(jìn)化樹(shù)聚類分析，結(jié)果表明沙柳的NAC034基因與木本植物間NAC034基因的相似度較高，與草本植物間存在一定差異，造成此差別的原因可能是由于木本和草本在漫長(zhǎng)的進(jìn)化過(guò)程中對(duì)不斷變化的環(huán)境適應(yīng)的結(jié)果。全基因組重復(fù)(WGD)又稱多倍化(Polyploid)，使染色體數(shù)目加倍，導(dǎo)致數(shù)百數(shù)千個(gè)重復(fù)基因被保留，并最終影響物種多樣化[18]。WGD存在于多種真核生物的進(jìn)化歷程中，程強(qiáng)等[19]通過(guò)分析楊樹(shù)基因組內(nèi)8000個(gè)旁系同源基因，推測(cè)楊樹(shù)在進(jìn)化過(guò)程中截至目前至少經(jīng)歷了3次基因組重復(fù)事件。研究發(fā)現(xiàn)毛果楊和小葉楊都存在WGD事件[20]； WGD 擴(kuò)展了眾多楊樹(shù)基因家族[21]；由此推測(cè)可能是由于楊樹(shù)基因組重復(fù)事件致使木本和草本植物的基因序列呈現(xiàn)差異，而且在漫長(zhǎng)的進(jìn)化過(guò)程中，導(dǎo)致基因的多態(tài)性增加，基因結(jié)構(gòu)不斷發(fā)生變異，從而使草本和木本植物的同源NAC034基因之間的差異不斷增大，進(jìn)而形成不同的基因結(jié)構(gòu)，最終可能導(dǎo)致功能出現(xiàn)一定的分化。本研究中進(jìn)化樹(shù)以及同源結(jié)構(gòu)域比對(duì)結(jié)果同樣印證了NAC034基因結(jié)構(gòu)在木本和草本植物間的差異。

沙柳NAC034基因響應(yīng)多種非生物脅迫。研究發(fā)現(xiàn)沙柳經(jīng)高溫和低溫脅迫后，NAC034基因分別在1和2 h表達(dá)上調(diào)，而后降至對(duì)照組水平，表明低溫和高溫均可誘導(dǎo)SpsNAC034基因的迅速表達(dá)，且該基因在溫度脅迫僅1和2 h呈現(xiàn)高表達(dá)，這表明其很可能是在溫度脅迫下促使基因表達(dá)的早期重要調(diào)控因子。鹽和干旱脅迫也誘導(dǎo)SpsNAC034基因的高表達(dá)。本研究分別在鹽處理8 h以及干旱處理1 h后，SpsNAC034表達(dá)均有明顯上調(diào)，只是在應(yīng)答快慢上有所差異。上述研究表明，沙柳NAC034基因響應(yīng)了多種非生物脅迫。在其他相關(guān)物種研究中，NAC基因也響應(yīng)了多種非生物脅迫。柑橘CsNAC基因在低溫、干旱、鹽脅迫下，其表達(dá)水平均上調(diào)[22]，鷹嘴豆CarNAC1、CarNAC5基因分別在低溫和高溫脅迫下均可被誘導(dǎo)表達(dá)，且表達(dá)量顯著增加[23-24]；硬粒小麥經(jīng)高溫和干旱、鹽處理后，TaNAC69-1基因均顯著表達(dá)，分別在24和48 h達(dá)到峰值[25]; 菠蘿NAC轉(zhuǎn)錄因子基因AcoNAC1經(jīng)低溫、干旱處理后分別在24和12 h表達(dá)量最高[26]。研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥中ANAC019、ANAC055、ANAC072基因可被干旱和鹽誘導(dǎo)，其過(guò)量表達(dá)使轉(zhuǎn)基因植株的耐旱性顯著增加[27]；小麥NAC型轉(zhuǎn)錄因子基因TaNAC4和TaNAC8分別經(jīng)鹽、低溫和干旱處理后，表達(dá)量均明顯增強(qiáng)[28-29]；SNAC1[30]和SNAC2[31]基因?qū)γ{迫產(chǎn)生應(yīng)答，在轉(zhuǎn)基因水稻植株中的過(guò)表達(dá)大大增強(qiáng)了其耐旱和耐鹽性。辣椒的CaNAC61基因經(jīng)鹽、干旱、高溫等處理后表達(dá)量均顯著上調(diào)[32]。本研究的SpsNAC034基因同樣對(duì)多種非生物脅迫有響應(yīng)，表明該基因參與了沙柳的多種非生物脅迫應(yīng)答反應(yīng)，對(duì)增加植物的抗逆育種具有重要應(yīng)用價(jià)值。

4 結(jié) 論

本研究獲得了具有NAC基因家族典型結(jié)構(gòu)域的沙柳SpsNAC034基因，隸屬NAC基因家族；該基因在木本和草本植物間存在一定的分化；在沙柳中呈現(xiàn)組織特異性表達(dá)，花中表達(dá)量最高；SpsNAC034基因?qū)Χ喾N非生物脅迫均具有應(yīng)答反應(yīng)。預(yù)計(jì)該基因?qū)ξ磥?lái)研究木本植物的抗逆調(diào)控機(jī)理具有一定參考價(jià)值，也可能對(duì)提高木本植物的抗逆性具有重要作用。