唐毓瑋，李佳慧，毛立彥 ，龍凌云，黃秋偉，於艷萍，蘇 群，王妍虹

(1.廣西壯族自治區(qū)亞熱帶作物研究所，南寧 530001；2.廣西農業(yè)科學院花卉研究所，南寧 530007)

【研究意義】睡蓮屬(Nymphaea) 隸屬于睡蓮科(Nymphaeaceae)，是世界溫帶至熱帶地區(qū)重要的水生花卉，該屬有50多個原種(含變種)，我國分布的睡蓮屬原種(含變種)有5個[1-2]。睡蓮花朵中含有黃酮類、酚酸類、生物堿及多糖等多種活性成分，在功能性食品、化妝品和傳統(tǒng)醫(yī)藥等領域應用潛力巨大[3]。植物花朵中不同組織的活性成分存在差異，針對睡蓮花朵不同組織的代謝特點進行活性成分提取，可以降低其開發(fā)利用成本，但目前對睡蓮花朵不同組織(花瓣、雌蕊和雄蕊)的優(yōu)勢活性成分尚不了解。非靶向代謝組學技術能同時檢測樣本的數百乃至數千種代謝物(包括已知和未知代謝物)，具有耗時短及高通量特點，已在多種植物上應用[4]。因此，利用非靶向代謝組學技術對睡蓮花朵進行代謝產物的鑒定與分析，有助于全面了解睡蓮花朵不同組織的營養(yǎng)和藥用成分，對睡蓮的開發(fā)利用具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】睡蓮花朵不僅具有較高的觀賞價值，還可用于花茶和精油加工[5-6]，其茶湯和提取物具有豐富的類黃酮和較高的抗氧化活性[7-8]。睡蓮花朵在維吾爾族醫(yī)藥中應用歷史悠久，常用于感冒發(fā)熱、頭痛咳嗽和咽痛等疾病的治療[9]。新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所致力于睡蓮花朵有效成分抗肝纖維化研究，發(fā)現睡蓮花朵中總黃酮對四氯化碳(CCl4)誘導的小鼠肝纖維化具有保護作用[10]，從體外細胞試驗層面證實睡蓮中的酚類物質能減緩氧化應激造成的肝細胞損傷[11]，花朵中分離出的代謝物異窄單寧(Isostrictiniin)對Con A誘導的小鼠肝損具有保護作用[12]。睡蓮的藥用價值也引起了國外學者的關注，Laila等[13]研究發(fā)現，代謝物Nymphayol(1種睡眠藥)對乳腺癌MCF-7細胞具有明顯的抗增殖作用。Rajagopal等[14]采用不同劑量睡蓮花朵提取物開展糖尿病大鼠飼喂試驗，發(fā)現睡蓮花朵提取物對四氧嘧啶誘導的糖尿病大鼠具有降低血糖和血脂作用。Alam等[15]通過體外細胞試驗證實睡蓮花朵提取物具有一定的抗氧化能力。代謝組學是研究生物體內源代謝物種類、數量及其在不同因素作用下變化規(guī)律的一門學科，是系統(tǒng)生物學的重要組成部分[4]。植物在長期進化過程中產生了大量結構不同的小分子代謝物，這些代謝物不僅促進植物生長發(fā)育，而且是人類食物和藥物的重要來源[16]。Chen等[17]運用代謝組學技術從鐵觀音植株中鑒定到其花朵特有的代謝物三香豆酰亞精胺和雙香豆酰腐胺。Zou等[18]運用代謝組學技術鑒定了黃色和白色肉質枇杷味道差異的關鍵成分。岳文杰等[19]利用非靶向代謝組學技術揭示了白茶自然萎凋過程中類黃酮、原花青素和糖苷衍生物的變化規(guī)律?！颈狙芯壳腥朦c】目前，已有研究對睡蓮花朵進行化學成分分析，但針對睡蓮不同花器官代謝特異性的研究鮮見報道?！緮M解決的關鍵問題】以熱帶睡蓮品種‘巴拿馬’(Nymphaea‘Panama pacific’)為試驗材料，利用非靶向代謝組學技術研究睡蓮花朵不同組織的代謝特異性，為促進睡蓮花朵活性成分在提取、加工和功能食品領域中的精準應用提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2020年7月在廣西壯族自治區(qū)亞熱帶作物研究所實驗室進行，睡蓮品種‘巴拿馬’種植于廣西壯族自治區(qū)亞熱帶作物研究所睡蓮種質資源圃，該品種屬于廣熱帶亞屬睡蓮，非常適宜在熱帶和亞熱帶地區(qū)繁殖生長，其花瓣呈藍紫色，花香濃郁，是用于睡蓮花茶加工的主要品種之一。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗設計 睡蓮品種‘巴拿馬’均采用相同農藝措施種植，每天早上10：00—11：00隨機采集不同單株初開的花朵，連續(xù)采摘5 d(即5個生物學重復)。采摘后立即帶回實驗室，用自來水清洗，然后用滅菌剪刀將花朵的花瓣、雌蕊和雄蕊分離，再用PBS緩沖液沖洗，分別將不同單株上花朵的花瓣混合為一個樣品H，雌蕊混合為一個樣品C，雄蕊混合為一個樣品X，立即放入液氮中，然后轉入超低溫冰箱-80 ℃保存?zhèn)溆迷O。設5個生物學重復，共15份試驗樣品。

1.2.2 代謝物提取與檢測 分別對-80 ℃保存的3組樣品進行液氮研磨，各稱取約0.3 g，分別置于15 mL EP管1中，加入2 mL甲醇冰浴超聲30 min，12 000 r/min離心10 min，從EP管1中取出1 mL上清液于2 mL EP管2中，在37 ℃下真空離心濃縮至干。再向EP管1中加入2 mL甲醇冰浴超聲30 min，12 000 r/min離心10 min，從EP管1中取出1 mL上清液于EP管2中，再次真空離心濃縮至干。殘渣用200 μL甲醇溶解，于12 000 r/min，4 ℃下離心10 min，取上清液進樣1 μL，使用UPLC-M檢測上清液中的代謝物。

1.2.3 液相色譜—質譜分析 利用超高液相色譜進行物質分離(Nexera UHPLC LC-30A，SHIMADZU)和串聯(lián)質譜(MASS TripleTOF5600+，AB SCIEXTM)對樣本進行分析。①色譜條件：色譜柱為Waters HILIC BEH Column(100 mm×3 mm，1.7 μm)，柱溫35 ℃，流速0.300 mL/min。流動相：水相為0.1%乙酸—水(A溶劑)，有機相為乙腈(B溶劑)。洗脫梯度：0 min比例為5%A∶95%B，10 min比例為50%A∶50%B，13 min比例為95%A∶5%B，14 mim比例為5%A∶95%B，15 min比例為5%A∶95%B。②質譜條件：分別采用電噴霧電離(ESI)正離子和負離子模式進行檢測。ESI源條件：Ion Source Gas1為50 psi，Ion Source Gas2為50 psi，Curtain Gas為25 psi，Source Tempreture為500 ℃(正離子)和450 ℃(負離子)，Ion Sapary Voltage Floating為5500 V(正離子)和4400 V(負離子)，TOF MS scan range為100～1200 Da，Product ion scan range為50～1000 Da，TOF MS scan accumulation time為0.20 s，Product ion scan accumulation time為0.01 s，二級質譜采用Information dependent acquisition(IDA)獲得，并采用High sensitivity模式，Declustering potential為±60 V，Collision Energy為(35±15)eV。

1.3 統(tǒng)計分析

1.3.1 數據預處理和多元統(tǒng)計分析 通過Analysis base file converter將液相色譜—質譜聯(lián)用儀(LC-MS)獲得的原始數據轉換成ABF格式，將ABF格式文件導入MS-DIAL 4.10[20]進行預處理，包括峰提取、去噪音、反卷積和峰對齊，導出CSV格式的三維數據矩陣[包括樣品信息、保留時間、質核比和質譜響應強度(峰面積)]。將提取的信息與數據庫進行比對，對MassBank、Respect和GNPS 3個庫進行全庫檢索，將得到的代謝組數據進行多元統(tǒng)計分析，對3組樣本進行主成分分析(PCA)，在最大程度保留原始數據的基礎上將多維復雜的數據進行降維處理，建立可靠模型對樣本的代謝特征進行歸納和總結。

1.3.2 差異代謝物篩選和富集分析 將0.5<相對含量差異倍數(Fold change，FC值)<2.0及T檢驗P<0.05的代謝物定義為差異代謝物。利用單變量分析的P和FC值篩選差異代謝物，并以TBtools[21]繪制火山圖、聚類熱圖和韋恩圖等，同時將得到的相應差異代謝物使用MBRole 2.0[22]進行京都基因和基因組百科全書(KEGG)pathway富集分析，基于KEGG的注釋進一步了解代謝物的生物學功能。以R語言Ggplot繪制富集氣泡圖。

2 結果與分析

2.1 多元統(tǒng)計分析

為了解睡蓮花朵不同組織的代謝成分差異，使用LC-MS對睡蓮的雌蕊、雄蕊和花瓣進行非靶向代謝組學分析，共檢測到1084個代謝物，其中有956個代謝物注釋到相應的分類(Ontology)。為了解不同花器官之間的代謝物積累情況，對花瓣(H)、雌蕊(C)、雄蕊(X)3個樣品進行主成分分析，從主成分分析得分圖(圖1)可看出，第一主成分(PC1)的有效解釋率R2X[1]為29.1%，第二主成分(PC2)的有效解釋率R2X[2]為26.8%，雌蕊的主成分分析位點均分布于第二象限，雄蕊的主成分分析位點均分布在第四象限，而花瓣的主成分分析位點均分布在第三象限，主成分分析位點均分布在Hotelling’s T2(95%)置信橢圓中，表明所有樣本均具有統(tǒng)計學意義，3組樣品明顯分離于不同象限，表明睡蓮花朵雌蕊、雄蕊和花瓣中代謝物的含量差異明顯。

圖1 睡蓮花朵不同組織的主成分分析得分Fig.1 Principal component analysis scores in different tissues of water lily flowers

由載荷圖(圖2)可看出，代謝物的分布明顯集中在3個區(qū)域。其中，第一簇代謝物主要集中分布在第二象限，結合主成分分析得分圖(圖1)可知，第二象限也是雌蕊主成分分析位點集中的位置，由此判斷，匯集于第二象限代謝物的相對含量在雌蕊中較高，是雌蕊的優(yōu)勢代謝物；第二簇代謝物主要集中分布在第三象限，第三象限代謝物的相對含量在花瓣中較高，屬于花瓣的優(yōu)勢代謝物；第三簇代謝物集中分布在第四象限，是睡蓮雄蕊的優(yōu)勢代謝物，與第二和第三象限的兩簇代謝物略有不同，位于第四象限的代謝物分布更集中緊密。因此，相較睡蓮的花瓣和雌蕊，雄蕊可能具有更高的代謝特異性。

圖2 睡蓮花朵不同組織的代謝產物Fig.2 Metabolites in different tissues of water lily flowers

2.2 差異代謝物的篩選

依次將花瓣(H)、雄蕊(X)、雌蕊(C)的代謝物進行兩兩比較，在雌蕊(C)與花瓣(H)的比較組中(圖3)，差異代謝物共有553個，上調的代謝物有345個，下調的代謝物有208個(C vs H下調的代謝物即為H vs C上調的代謝物，另兩個比較組同理)；在雌蕊(C)與雄蕊(X)的比較組中(圖4)，差異代謝物共有569個，上調的代謝物有240個，下調的代謝物有329個；在花瓣(H)與雄蕊(X)的比較組中(圖5)，差異代謝物共有613個，上調代謝物199個，下調代謝物414個。將各比較組的上調代謝物進行交集，可得到該樣本相對于花朵其他組織共同上調的代謝物?；ò?H)相對于雌蕊(C)和雄蕊(X)，共有138個代謝物上調，將這138個代謝物命名為H_up代謝集，并視為花瓣(H)的優(yōu)勢代謝物(圖6)。同理，雌蕊(C)相對于花瓣(H)和雄蕊(X)，有165個代謝物上調，命名為C_up代謝集，視為雌蕊(C)的優(yōu)勢代謝物(圖7)，雄蕊(X)的X_up代謝集包含206個代謝物，視為雄蕊(X)的優(yōu)勢代謝物(圖8)。可見，睡蓮花瓣(H)中的優(yōu)勢代謝物數量較少，僅138個，而雄蕊(X)中優(yōu)勢代謝物數量較多，有206個。

圖3 睡蓮雌蕊(C)與花瓣(H)差異代謝物Fig.3 Differential metabolites between pistil(C)and petal(H)of water lily

圖4 睡蓮雌蕊(C)與雄蕊(X)差異代謝物Fig.4 Differential metabolites between pistil(C) and stamen(X) of water lily

圖5 睡蓮花瓣(H)與雄蕊(X)的差異代謝物Fig.5 Differential metabolites between petals(H)and stamens(X)of water lily

圖6 睡蓮花瓣(H)優(yōu)勢代謝物Fig.6 Water lily petals specific metabolites

圖7 睡蓮雌蕊(C)的優(yōu)勢代謝物Fig.7 Water lily pistil(C) specific metabolites

圖8 睡蓮雄蕊(X)優(yōu)勢代謝物Fig.8 Water lily stamen(X) specific metabolites

2.3 優(yōu)勢代謝物的代謝通路分析

分別將H_up、C_up和X_up 3個代謝集上傳至MBRole 2.0進行KEGG id轉化。其中，C_up的165個代謝物中有72個獲得相應的KEGG id，H_up的138個代謝物中有56個獲得相應的KEGG id，X_up的206個代謝物中有86個代謝物獲得相應的KEGG id。結果(圖9)顯示，在C_up的代謝集中，代謝物顯著富集在煙酸和煙酰胺代謝(富集因子=0.068)(P<0.05，下同)、苯丙烷類化合物生物合成(富集因子=0.062)、氰基氨基酸代謝(富集因子=0.073)和類黃酮生物合成(富集因子=0.058)通路，H_up顯著富集在苯丙烷類化合物生物合成(富集因子=0.082)、TCA循環(huán)(富集因子=0.100)和類黃酮生物合成(富集因子=0.073)通路，X_up代謝集顯著富集在吲哚生物堿生物合成(富集因子=0.063)、黃酮和黃酮醇生物合成(富集因子=0.090)及植物激素生物合成(富集因子=0.059)通路。

富集因子為差異代謝物位于該Pathway的數量與全部有注釋代謝物位于該Pathway的代謝物總數的比值Rich factor is the ratio of the number of differential metabolites located in the pathway to the total number of metabolites with all annotated metabolites located in the pathway圖9 睡蓮花朵不同組織優(yōu)勢代謝物的KEGG富集Fig.9 KEGG enrichment of dominant metabolites in different tissues of water lily flowers

由表1可知，睡蓮雌蕊和花瓣的較多優(yōu)勢代謝物共同參與苯丙烷類化合物的生物合成，其中包括富馬酸、阿魏酸、松柏醛、金雀異黃素、表兒茶素、羅漢松樹脂酚、蘋果酸、異檸檬酸、山奈酚和矢車菊素等14種活性物質。此外，雌蕊中天冬氨酸的相對含量分別約為雄蕊的2.25倍和花瓣的9.01倍，酪氨酸的相對含量分別約為雄蕊的5.20倍和花瓣的2.78倍，谷氨酸的相對含量分別約為雄蕊的2.79倍和花瓣的6.14倍；雄蕊中四氫鴨腳木堿和長春新堿等生物堿成分的相對含量較高，其中，四氫鴨腳木堿的相對含量分別約為雌蕊的2.06倍和花瓣的5.09倍，而長春新堿的相對含量遠高于雌蕊和花瓣，分別約為雌蕊的1192.00倍和花瓣的553.00倍?？梢?，雌蕊中含有較高的氨基酸類物質，雄蕊中含有較高的生物堿物質。

表1 睡蓮花朵不同組織特異性代謝物顯著富集的代謝通路

3 討 論

睡蓮花色豐富，形態(tài)多樣，在水生園林景觀中應用廣泛[23]，除觀賞價值外，睡蓮的食用和藥用價值也已逐漸得到挖掘[3]。睡蓮花型較大，單花直徑可達15～20 cm，對其活性成分的高效提取存在一定困難，因此，需充分了解不同花器官的優(yōu)勢活性成分。Zhu等[24]對35個不同色系熱帶睡蓮的花瓣進行檢測，鑒定出飛燕草素、矢車菊素等花青素及其衍生物。本研究中，通過非靶向代謝組學技術從藍色系睡蓮‘巴拿馬’的花瓣、雌蕊和雄蕊中檢測到相應的代謝物，其中，矢車菊素在花瓣中的相對含量更高，而飛燕草素在雌蕊中含量可能更高；雌蕊和花瓣的優(yōu)勢代謝物雖然不同，但是均顯著富集到苯丙烷類化合物生物合成和類黃酮生物合成2條代謝通路，說明雌蕊和花瓣2個花器官可能具備相同的生物學功能。苯丙烷代謝途徑是生物體內次生代謝的重要途徑，一切含苯丙烷骨架的苯丙烷類化合物都是該途徑的直接或間接產物，該途徑中的化合物在生物體內具有多種多樣的生理功能[25]。黃酮類化合物主要由本丙烷類化合物衍生，經不同合成途徑形成，如本研究中睡蓮雌蕊的優(yōu)勢代謝物表兒茶素由苯丙烷化合物的生物合成途徑形成，花瓣的優(yōu)勢代謝物柚皮素、山奈酚和矢車菊素由類黃酮生物合成途徑合成，雄蕊的優(yōu)勢代謝物蘆丁由黃酮和黃酮醇的生物合成途徑合成。

雌蕊是產生雌配子、接受花粉和孕育子代的重要組織。郭玉華等[26]研究發(fā)現，睡蓮子房提取物中含有17種氨基酸，且絕大多數氨基酸含量顯著高于睡蓮其他組織。本研究也得到相似的結果，天冬氨酸、酪氨酸和谷氨酸是睡蓮雌蕊的優(yōu)勢代謝物，其含量高于睡蓮花朵的其他組織。這些氨基酸不僅在植物、人體生長發(fā)育中發(fā)揮重要生理作用，還可用于食品增味劑等輕工業(yè)領域[27]。

熱帶睡蓮花朵中約有70%的揮發(fā)性物質來源于雄蕊[28]，因此雄蕊主要應用于精油研究和開發(fā)。黃秋偉等[6]通過超臨界CO2工藝萃取睡蓮精油，并從精油中分離出42種揮發(fā)性物質。郭玉華等[29]報道，海南野生延藥睡蓮(NymphaeastellataWilld.)花的主要揮發(fā)成分是二十一烷(Heneicosane)、香葉基香葉醇(Geranylgeraniol)、二十四烷(Tetracosane)和二十八烷(Octacosane)。關于睡蓮揮發(fā)性物質的研究已有較多報道，但關于睡蓮雄蕊非揮發(fā)性成分的研究鮮見報道。本研究發(fā)現，睡蓮雄蕊中的長春新堿和四氫鴨腳木堿含量相對較高。吲哚類生物堿是迄今發(fā)現最多的一種生物堿類型，主要通過莽草酸途徑生成色氨酸后經過次生代謝而合成[30]，其中長春新堿為目前應用最廣的天然抗癌藥物，主要用于治療急性淋巴白血病、何杰金氏病、乳腺癌和惡性淋巴瘤等疾病[31]。因此，睡蓮的雄蕊作為天然原料在醫(yī)藥領域具有一定的開發(fā)潛力。

非靶向代謝組學技術屬于高通量檢測方法，可用于代謝物的初步挖掘，但準確性相對較低，因此，還需進一步運用靶向代謝組學技術對本研究挖掘到的長春新堿、表兒茶素、矢車菊素、蘆丁、柚皮素和山奈酚等多種具有抗氧化、抗炎和抗癌作用的活性成分[32-34]進行絕對定量研究，為睡蓮花朵活性成分的提取、加工及在功能食品領域中的精準應用提供科學依據。

4 結 論

睡蓮花朵不同組織間的代謝物含量差異明顯，優(yōu)勢代謝物顯著富集到苯丙烷類化合物生物合成、類黃酮生物合成、黃酮和黃酮醇生物合成及吲哚生物堿生物合成等8個代謝通路。利用非靶向代謝組學技術能初步篩選睡蓮花朵不同組織的優(yōu)勢代謝產物。