孫美麗，汪漢成，郭沫言，蔡劉體，劉亭亭，陸 寧，史彩華

(1.長江大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，湖北 荊州 434025；2.貴州省煙草科學(xué)研究院，貴州 貴陽 550081)

0 引言

【研究意義】由立枯絲核菌(RhizoctoniasolaniKühn)引起的煙草靶斑病(Tobacco target spot)是煙葉旺長期易發(fā)生的真菌性病害，造成葉片褪綠、輪紋等癥狀，嚴(yán)重時(shí)可形成連片融合病斑，病斑壞死部分易碎形成穿孔，導(dǎo)致煙葉失去經(jīng)濟(jì)價(jià)值[1-2]。立枯絲核菌除危害煙草外，還可引起煙草立枯病[3]、水稻紋枯病[4]等多種病害。該病原寄主范圍廣泛，包括煙草、水稻、馬鈴薯、甜菜等260余種作物[3-6]。2018—2021年，煙草靶斑病在云南、貴州等煙葉主產(chǎn)區(qū)危害嚴(yán)重[7]，局地?fù)p失高達(dá)80%以上，存在廣泛傳播與流行的風(fēng)險(xiǎn)，建立綠色高效的防控技術(shù)體系意義重大?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】國內(nèi)外學(xué)者分別從農(nóng)業(yè)防治[8]、生物防治[9]等不同角度研發(fā)了大量防控技術(shù)，但均存在防治成本高、防效不顯著、費(fèi)工費(fèi)時(shí)等缺陷?；瘜W(xué)防控病蟲害仍然是煙農(nóng)最青睞的方法，經(jīng)濟(jì)高效，而且省工省時(shí)，是植物病害最為經(jīng)濟(jì)、有效的防控措施。生產(chǎn)上，有機(jī)和無機(jī)殺菌劑常被用于防治立枯絲核菌引起的植物病害[10-11]，如井岡霉素(Jiangangmycin)、苯醚甲環(huán)唑(Difenoconazole)等?！狙芯壳腥朦c(diǎn)】由于我國煙草特殊的農(nóng)藥登記政策，目前，國內(nèi)煙草上登記防控?zé)煵莅邪卟〉乃巹﹥H有井岡霉素，該藥劑對靶斑病具有較好預(yù)防作用，但病情嚴(yán)重時(shí)仍難以控制。同時(shí)，煙農(nóng)習(xí)慣性將用于防控?zé)煵莩嘈遣〉木藘?Dimethachlon)和代森錳鋅(Mancozeb)用來防控包括靶斑病在內(nèi)的多種真菌性病害。【擬解決的關(guān)鍵問題】測定苯醚甲環(huán)唑、嘧菌酯、菌核凈和代森錳鋅4種殺菌劑對煙草靶斑病菌菌絲生長和菌核形成的生物活性，并在田間進(jìn)行藥效評價(jià)，為煙草靶斑病防控替代藥劑的選擇提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)地點(diǎn)及品種 田間藥劑試驗(yàn)于2020年8月中旬在貴州省畢節(jié)市黔西縣高坡村煙田進(jìn)行，供試品種為云煙87，煙草種子購自畢節(jié)市煙草公司黔西縣分公司。

1.1.2 供試菌株及培養(yǎng)基 煙草靶斑病菌菌株BEZ11、BEZ13和J203，由貴州省煙草科學(xué)研究院微生物實(shí)驗(yàn)室前期分離、鑒定。測試培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA培養(yǎng)基)。

1.1.3 供試藥劑及器械 96.80%苯醚甲環(huán)唑(Difenoconazole)原藥購自山東壽光雙星農(nóng)藥有限公司，96%嘧菌酯(Azoxystrobin)原藥購自南京百慕達(dá)生物科技有限公司，90%菌核凈(Dimethachlon)原藥購自浙江禾益農(nóng)化有限公司，85%代森錳鋅(Mancozeb)原藥購自杜邦(中國)集團(tuán)有限公司。

分別購置10%苯醚甲環(huán)唑水分散粒劑(WG，商品名：勢麗，一帆生物科技集團(tuán)有限公司)、25%嘧菌酯懸浮劑(SC，商品名：阿加西，鹽城利民農(nóng)化有限公司)、40%菌核凈可濕性粉劑(WP，商品名：禾益，江西禾益化工股份有限公司)和80%代森錳鋅可濕性粉劑(WP，商品名：大生，陶氏益農(nóng)農(nóng)業(yè)科技有限公司)，用于田間藥效試驗(yàn)。多功能噴霧施肥器(型號：DSF01A-20-100)，購自貴州黔豐源農(nóng)業(yè)科技開發(fā)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 不同藥劑對靶斑病菌菌絲生長的抑制作用 采用菌絲生長速率法[12]測定。將代森錳鋅溶于無菌水、嘧菌酯和苯醚甲環(huán)唑溶于甲醇、菌核凈溶于丙酮中，均分別配成1.0×104mg/L的母液，于4℃黑暗條件下保存，備用。殺菌劑的最終測試質(zhì)量濃度：苯醚甲環(huán)唑0 mg/L、0.31 mg/L、0.63 mg/L、1.25 mg/L、2.5 mg/L、5 mg/L；嘧菌酯0 mg/L、6.25 mg/L、12.5 mg/L、25 mg/L、50 mg/L、100 mg/L；菌核凈0 mg/L、0.16 mg/L、0.31 mg/L、0.62 mg/L、1.25 mg/L、2.5 mg/L、5 mg/L；代森錳鋅0 mg/L、9.38 mg/L、18.75 mg/L、37.5 mg/L、75 mg/L、150 mg/L、300 mg/L。以添加相同體積的甲醇、丙酮處理作為空白對照，其中甲醇、丙酮的體積分?jǐn)?shù)均小于0.25%，此濃度溶劑均不影響靶斑病病菌菌絲的生長。將供試菌株在PDA培養(yǎng)基上活化，7 d后在菌落邊緣制備直徑為5 mm的菌碟，接種于不同濃度梯度含藥平板中央，各處理3次重復(fù)，接菌后將平板置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)。待對照菌落直徑長至2/3培養(yǎng)皿直徑時(shí)，采用“十字交叉”法測量菌落直徑，計(jì)算各藥劑不同劑量下對病原菌菌絲生長的抑制率[13]。

抑制率= [(對照菌落直徑-5 mm)-(處理菌落直徑-5 mm)]/(對照菌落直徑-5 mm)× 100%

1.2.2 不同藥劑對靶斑病菌菌核形成的抑制作用 采用稱重法[14]測定，將1.2.1中培養(yǎng)的平皿繼續(xù)置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)，50 d后從各平板上挑取褐色菌核稱重，計(jì)算各藥劑不同劑量下對病原菌菌核形成的抑制率。

1.2.3 對煙草靶斑病的田間防效 選取煙株長勢一致的煙田劃分小區(qū)，隨機(jī)排列，每小區(qū)20株煙株，重復(fù)3次。10%苯醚甲環(huán)唑WP、25%嘧菌酯SC、40%菌核凈WP和80%代森錳鋅WP的田間用量分別為60 g/667m2、40 mL/667m2、120 g/667m2和200 g/667m2，于煙草靶斑病零星出現(xiàn)病斑時(shí)開始用藥，采用多功能噴霧施肥器均勻噴施葉片表面，直至液滴流失。以噴施等量清水處理為對照，小區(qū)之間設(shè)保護(hù)行。每處理施藥前在煙株相同部位分別標(biāo)記8個(gè)病斑，并量取病斑直徑。施藥后9 d，分別再次量取各標(biāo)記病斑的直徑，計(jì)算藥劑對病害擴(kuò)展的抑制率。同時(shí)各小區(qū)隨機(jī)選擇8株煙株，參照煙草靶斑病病害分級標(biāo)準(zhǔn)調(diào)查各處理的病情指數(shù)[15]，計(jì)算各藥劑對煙草靶斑病的防效。

病斑抑制率= [1-(處理區(qū)病斑直徑擴(kuò)增值/對照區(qū)病斑直徑擴(kuò)增值)]×100%

病情指數(shù)=Σ(各級病葉數(shù)×相對級數(shù)值)/(調(diào)查總?cè)~數(shù)×最高病級值)×100

防治效果= [1-(處理區(qū)病情指數(shù)增長值/對照區(qū)病情指數(shù)增長值)]×100%

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2019對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，以殺菌劑質(zhì)量濃度對數(shù)值為橫坐標(biāo)，以對病原菌菌絲生長抑制率的幾率值為縱坐標(biāo)，建立毒力回歸方程，根據(jù)毒力回歸方程計(jì)算有效抑制中濃度(EC50)值和相關(guān)系數(shù)[16]。使用DPS 7.0.5.8進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同藥劑對靶斑病菌菌絲生長的抑制作用

由表1可見，4種殺菌劑對煙草靶斑病菌菌絲生長均表現(xiàn)出不同抑菌活性，其中抑菌活性最強(qiáng)的是菌核凈，其EC50值為1.57～2.00 mg/L，平均值為(1.72±0.25)mg/L；嘧菌酯次之，其EC50值為14.13～16.68 mg/L，平均值為(15.71±1.38)mg/L；苯醚甲環(huán)唑稍弱，其EC50值為13.81～18.38 mg/L，平均值為(16.80±2.59)mg/L；代森錳鋅最弱，其EC50值為13.88～35.87 mg/L，平均值為(24.77±11.10)mg/L。

表1 供試4 種殺菌劑對煙草靶斑病菌菌絲生長的抑制作用Table 1 Inhibition effect of four fungicides against mycelium growth of R. solani

此外，煙草靶斑病菌不同菌株對同種藥劑的敏感性存在差異。其中，對代森錳鋅的敏感性差異最大，菌株J203的EC50值是菌株BEZ13的2.58倍；其次是苯醚甲環(huán)唑，菌株J203的EC50值是菌株BEZ13的1.33倍；相比而言，不同菌株對嘧菌酯和菌核凈的敏感性差異較小。

2.2 不同藥劑對靶斑病菌菌核形成的抑制作用

由表2可見，在測試濃度范圍內(nèi)，4種殺菌劑對煙草靶斑病菌菌核的形成均表現(xiàn)不同的抑制活性。在50 d菌核形成期內(nèi)，抑制活性最強(qiáng)的藥劑為菌核凈，在2.5 mg/L處理時(shí)的抑制率為100%；其次是嘧菌酯和苯醚甲環(huán)唑，嘧菌酯藥劑濃度在12.5 mg/L、50 mg/L和100 mg/L處理時(shí)的抑制率均為100%，苯醚甲環(huán)唑藥劑濃度在5 mg/L處理時(shí)的抑制率為(98.59± 2.45)%；代森錳鋅的抑制作用相對較弱，在18.75 mg/L處理時(shí)的抑制率為100%。

表2 供試4 種殺菌劑對煙草靶斑病菌菌核形成的抑制作用 Table 2 Inhibition effect of four fungicides against sclerotium formation of R. solani

2.3 不同藥劑對煙草靶斑病的田間防效

從表3看出，4種藥劑施藥后第9 天的防治效果，40%菌核凈WP 120 g/667m2、25%嘧菌酯SC 40 mL/667m2、10%苯醚甲環(huán)唑WG 60 g/667m2及80%代森錳鋅WP 200 g/667m2處理，對靶斑病的防效分別為90.59%、61.76%、52.12%和13.41%；對病斑擴(kuò)展的抑制率分別為53.55%、75.10%、64.09%和7.31%。

表3 4 種殺菌劑對煙草靶斑病的田間防效Table 3 Control efficacy of four fungicides against target spot in tobacco field

3 討論

采用生物學(xué)測定法并結(jié)合田間試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，抑制煙草靶斑病菌菌絲生長活性較強(qiáng)的殺菌劑有菌核凈、嘧菌酯和苯醚甲環(huán)唑；同時(shí)發(fā)現(xiàn)代森錳鋅、嘧菌酯和菌核凈對其菌核的形成也有較強(qiáng)的抑制活性；田間對靶斑病防效較好的殺菌劑為菌核凈、嘧菌酯和苯醚甲環(huán)唑。

抑制菌絲生長是病害防治藥劑篩選的重要依據(jù)。已有諸多關(guān)于殺菌劑對立枯絲核菌敏感性研究的報(bào)道，而對煙草靶斑病菌敏感性的研究卻報(bào)道較少。研究發(fā)現(xiàn)，菌核凈抑制煙草靶斑病菌菌絲生長的EC50值為(1.72±0.25)mg/L，與汪漢成等[17]對煙草立枯病菌的敏感性(1.31±0.14)mg/L及白慶榮等[18]對高山紅景天立枯病菌的敏感性(1.58±0.12)mg/L的測定結(jié)果基本一致；嘧菌酯抑制其菌絲生長的EC50值為(15.71±1.38)mg/L，與余嘉[19]對玉米紋枯病菌的敏感性(16.09±3.47)mg/L的測定結(jié)果基本一致；代森錳鋅抑制其菌絲生長的EC50值為(24.77±10.99)mg/L，與張燕南等[20]對融合群水平上的棉花立枯病菌的敏感性29.15 mg/L的測定結(jié)果基本一致。伏穎等[13]采用菌絲生長速率法和抑菌圈法測定煙草靶斑病菌對10種藥劑的敏感性，2種方法均發(fā)現(xiàn)菌核凈對菌絲生長的抑制作用最強(qiáng)，這與該試驗(yàn)結(jié)果一致，進(jìn)一步驗(yàn)證測定結(jié)果的正確性。

菌核是煙草靶斑病菌越冬和翌年初侵染的主要組織[21]，抑制菌核形成也是煙草靶斑病防治藥劑篩選的重要依據(jù)。已有諸多關(guān)于殺菌劑對立枯絲核菌菌核形成的研究報(bào)道，然而對煙草靶斑病菌菌核形成研究卻報(bào)道較少。研究發(fā)現(xiàn)，菌核凈5 mg/L處理對菌核形成的抑制率高達(dá)100%，與汪漢成等[17]對煙草立枯病菌的菌核抑制率測定結(jié)果(100%)一致；嘧菌酯50 mg/L處理對菌核形成的抑制率高達(dá)100%，與KUMARI等[22]測定嘧菌酯對立枯絲核菌生防的菌核抑制率(96%)結(jié)果基本一致；苯醚甲環(huán)唑5 mg/L處理對菌核形成的抑制率高達(dá)98.59%，與汪漢成等[17]對煙草立枯病菌的菌核抑制率(97.97±2.64)%測定結(jié)果基本一致。18.75 mg/L代森錳鋅處理對菌核形成的抑制率高達(dá)100%，而目前對代森錳鋅抑制立枯絲核菌菌核形成的研究較少，代森錳鋅質(zhì)量濃度為9.38 mg/L處理的抑制率為58.35%，與汪漢成等[17]研究代森錳鋅質(zhì)量濃度為10 mg/L時(shí)對立枯絲核菌菌核生長抑制率為(43.58±31.87)%的結(jié)果基本一致。綜上，4種殺菌劑對煙草靶斑病菌菌核形成的抑制準(zhǔn)確可靠。

田間藥效試驗(yàn)是檢驗(yàn)藥劑防治病害的重要環(huán)節(jié)。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，嘧菌酯40 mL/667m2處理的防效可達(dá)90.59%，與馬鈴薯每100 kg種薯施用20 mL 25%嘧菌酯SC防控黑痣病的防效86%結(jié)果接近[5]。菌核凈常被用于赤星病的防控，少有關(guān)于其對煙草靶斑病的防效評價(jià)，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其田間對煙草靶斑病也具有較好的防效，在120 g/667m2處理時(shí)防效高達(dá)90.59%。苯醚甲環(huán)唑在60 g/667m2處理時(shí)防效達(dá)64.09%，與4.5 g/667m2的30%苯醚甲環(huán)唑·丙環(huán)唑SC對水稻紋枯病的防效71.43%接近[23]。代森錳鋅是多作用位點(diǎn)殺菌劑，對包括立枯絲核菌的諸多病害具有預(yù)防作用[20，24-25]，研究發(fā)現(xiàn)，在靶斑病開始發(fā)生后，200 g/667m2劑量時(shí)的防效較低，為此，該藥劑不適合在病害發(fā)生后使用。此外，基于煙草靶斑病病斑擴(kuò)展的抑制率與基于病情指數(shù)防效評價(jià)，獲得的4種殺菌劑對煙草靶斑病的防效基本一致，病情指數(shù)調(diào)查工作量較大，且易存在人為誤差；相比而已，基于病斑擴(kuò)展的調(diào)查方法操作簡便、更為精準(zhǔn)，可以用于今后其他藥劑的田間藥效評價(jià)。

4 結(jié)論

苯醚甲環(huán)唑、嘧菌酯、菌核凈和代森錳鋅4種殺菌劑對靶斑病菌菌絲生長和菌核形成的具有抑制作用，對靶斑病具有一定的田間防效。研究結(jié)果豐富了用于煙草靶斑病防治藥劑選擇的種類，考慮到菌核凈和代森錳鋅存在超標(biāo)的風(fēng)險(xiǎn)，建議相關(guān)農(nóng)藥企業(yè)或煙草農(nóng)藥登記管理部門將苯醚甲環(huán)唑和嘧菌酯納入煙草靶斑病防控的候選藥劑。