吳俁學(xué),張顯波*,閔文武,周其椿,李世凱

(1．貴州省水產(chǎn)研究所，貴州 貴陽(yáng) 550025；2．貴州省特種水產(chǎn)工程技術(shù)中心，貴州 貴陽(yáng) 550025)

0 引言

【研究意義】貴州位于我國(guó)西南部，地處云貴高原東側(cè)的大斜坡地帶，處于長(zhǎng)江和珠江兩大流域上游交錯(cuò)地段，河流數(shù)量較多，具有充沛獨(dú)特的水資源，加之豐富的地?zé)?、余熱、冷泉水等資源以及特殊的喀斯特地形，孕育了種類繁多的水生生物，魚(yú)類區(qū)系組成復(fù)雜，具有豐富的生物多樣性。月鱧(Channaasiation)屬鱸形目(Perciformes)鱧科(Channidae)鱧屬(Channa)，有七星魚(yú)、山花魚(yú)、點(diǎn)星魚(yú)、星光魚(yú)等俗稱，屬名貴淡水魚(yú)類，具有極高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和藥用價(jià)值，有保健魚(yú)之稱，為貴州原始土著魚(yú)類之一。開(kāi)展貴州月鱧自然種群的遺傳背景研究，對(duì)貴州土著魚(yú)類資源保護(hù)和開(kāi)發(fā)具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。【前人研究進(jìn)展】研究人員利用ITS序列和Cyt b序列分析比較了月鱧、烏鱧和斑鱧之間的進(jìn)化關(guān)系[1-2]，也有相關(guān)研究從形態(tài)學(xué)方面分析鱧屬魚(yú)類系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系[3]，主要是針對(duì)同屬不同種間的分析比較。Cytb基因是線粒體DNA上的編碼區(qū)之一，進(jìn)化速率適中、易擴(kuò)增，比較適合闡明種內(nèi)到種間的進(jìn)化關(guān)系[4-6]，廣泛地應(yīng)用于各類物種的系統(tǒng)發(fā)育研究[7-9]。【研究切入點(diǎn)】目前尚無(wú)關(guān)于貴州月鱧群體遺傳學(xué)研究的相關(guān)報(bào)道，因此，以貴州境內(nèi)長(zhǎng)江流域和珠江流域的4個(gè)月鱧群體為研究對(duì)象，測(cè)定和分析其Cytb基因序列，對(duì)月鱧群體的遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】弄清貴州境內(nèi)長(zhǎng)江流域和珠江流域月鱧自然群體間的遺傳關(guān)系，探究貴州兩江流域月鱧自然種群的遺傳背景，為貴州土著魚(yú)類月鱧的種質(zhì)資源保護(hù)和開(kāi)發(fā)利用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

以貴州境內(nèi)長(zhǎng)江流域和珠江流域分布的月鱧群體為主要研究對(duì)象，共收集到月鱧130尾，均為自然群體，具體采樣情況見(jiàn)表1。

表1 月鱧樣本采集情況Table 1 Sample information of C. argus populations

1.2 基因組DNA的提取與檢測(cè)

剪取月鱧樣本的尾鰭下葉組織，無(wú)水乙醇浸泡，—20℃保存?zhèn)溆?。參照改良的苯酚SDS法提取基因組DNA[10]。經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)提取的DNA進(jìn)行完整性檢測(cè)，濃度及純度由NANODROP 2000分光光度儀測(cè)定，采用TE Buffer(pH=8.0)稀釋至60 ng/μL，—20℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 線粒體Cyt b序列片段的擴(kuò)增和測(cè)序

利用Primer blast設(shè)計(jì)該片段的引物，得到上游引物Cytb-CDS-F1:atggccaatctacgaaaaacac，下游引物Cytb-CDS-R1:ttaacctccgacgtccggtt，引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。PCR反應(yīng)在PTC-200型PCR儀上進(jìn)行，反應(yīng)體系：上下游引物各2 μL，模板DNA 4 μL，MIX 20 μL，加無(wú)菌去離子水至40 μL；反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性3 min；94℃變性45 s，55℃復(fù)性45 s，72℃延伸1 min，并進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物由生工生物工程(上海)有限公司測(cè)序。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Clustal X軟件將測(cè)序結(jié)果進(jìn)行對(duì)位排序，并輔以人工校對(duì)。利用MEGA 5.0軟件計(jì)算各種群間的遺傳距離，運(yùn)用基于遺傳距離的鄰接法(Neighbor-joining method，NJ)和基于信息位點(diǎn)的最大簡(jiǎn)約法(Maximum parsimonious criterion，MP)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，同時(shí)采用自舉檢驗(yàn)估計(jì)系統(tǒng)樹(shù)中節(jié)點(diǎn)的置信度。用DNAsp5.0軟件對(duì)各群體的單倍型多樣性(Haplotype diversity，Hd)進(jìn)行分析，估計(jì)不同種群的遺傳多樣性，并進(jìn)行Tajima’s D檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)。利用NCBI中 GenBank提供的生物信息資源共同進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 4個(gè)月鱧群體的Cyt b序列特征

對(duì)貴州境內(nèi)長(zhǎng)江流域不同區(qū)域的2個(gè)群體和珠江流域不同區(qū)域的2個(gè)群體共130尾月鱧的Cytb基因的946 bp序列分析顯示，A+T含量為53.7%，G+C含量為46.4%，其堿基組成差異不大。

長(zhǎng)江流域?yàn)踅后w和清水江群體的堿基組成特征表現(xiàn)為保守位點(diǎn)940個(gè)，占核苷酸總數(shù)的99.37%，變異位點(diǎn)6個(gè)，其中，簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)4個(gè)，單態(tài)突變位點(diǎn)2個(gè)；轉(zhuǎn)換位點(diǎn)6個(gè)，無(wú)顛換位點(diǎn)。珠江流域貓營(yíng)河群體和都柳江群體的堿基組成特征表現(xiàn)為保守位點(diǎn)939個(gè)，占核苷酸總數(shù)的99.26%，變異位點(diǎn)7個(gè)，其中，簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)7個(gè)，無(wú)單態(tài)突變位點(diǎn)；轉(zhuǎn)換位點(diǎn)6個(gè)，顛換位點(diǎn)1個(gè)。

2.2 4個(gè)月鱧群體的單倍型及核苷酸多樣性

2.2.1 群體的單倍型多樣性 從表2看出，長(zhǎng)江流域和珠江流域4個(gè)月鱧群體130個(gè)樣本共定義6種單倍型，其中，以單倍型Hap 4的個(gè)體分布最多，4個(gè)群體無(wú)共享單倍型，清水江群體獨(dú)為1個(gè)單倍型。

表2 4個(gè)月鱧群體Cyt b基因的單倍型分布Table 2 Distribution of the Cyt b haplotypes in C. argus population with four-month-age 尾

2.2.2 核苷酸多樣性 從表3看出，長(zhǎng)江流域?yàn)踅后w34個(gè)樣本定義了4種單倍型，核苷酸多樣性指數(shù)(π)為0.001 65，單倍型多樣性指數(shù)(Hd)為0.480；長(zhǎng)江流域清水江群體31個(gè)樣本僅定義1種單倍型。珠江流域貓營(yíng)河群體29個(gè)樣本定義2種單倍型，π為0.000 61，Hd為0.192；珠江流域都柳江群體36個(gè)樣本定義2種單倍型，π為0.002 04，Hd為0.386。

表3 4個(gè)月鱧群體的遺傳多樣性指數(shù)Table 3 Genetic diversity indexes of C. argus population with four-month-age

4個(gè)月鱧群體總體的π為0.001 98，Hd為0.734。長(zhǎng)江流域月鱧群體出現(xiàn)5種單倍型，珠江流域月鱧群體出現(xiàn)4種單倍型。其中，烏江群體的遺傳多樣性最豐富，有4種單倍型；清水江群體遺傳多樣性水平最低，其π和Hd均為0，且只有1種單倍型。

2.3 4個(gè)月鱧群體的遺傳距離與遺傳分化指數(shù)

2.3.1 遺傳距離 根據(jù)DNAsp的計(jì)算結(jié)果，4個(gè)月鱧群體間平均遺傳距離(D)為0.002 29。從表4看出，貓營(yíng)河-都柳江群體的D值最大，為0.003 08；烏江-貓營(yíng)河群體的D值最小，為0.001 31；烏江-清水江群體、烏江-貓營(yíng)河群體、清水江-都柳江D值低于平均水平，其他群體間的遺傳距離值均大于平均遺傳距離；但各群體間D值均小于0.01，表明群體間遺傳差異較小，推測(cè)各群體間可能存在頻繁的基因交流[11]。

表4 基于序列分析月鱧群體間的遺傳分化Table 4 Genetic differentiation among C. argus populations based on sequence analysis

2.3.2 遺傳分化 參照群體遺傳分化標(biāo)準(zhǔn)(遺傳分化指數(shù)Fst>0.25)[12]，長(zhǎng)江流域群體與珠江流域群體間基因存在一定的遺傳分化。根據(jù)一般判斷標(biāo)準(zhǔn)(Fst<1)[12]，群體間未出現(xiàn)生殖隔離，各群體間僅烏江-貓營(yíng)河群體的基因流(Nm)>1。根據(jù)線粒體DNA堿基突變率每百萬(wàn)年(Ma)1%～2.5%估算[13]，種群間分化時(shí)間以貓營(yíng)河-都柳江群體的分化時(shí)間最早(0.06 Ma～0.15 Ma)，烏江-貓營(yíng)河群體最晚(0.03 Ma～0.07 Ma)，各群體間分化時(shí)間交叉在0.06 Ma～0.07 Ma。

2.4 4個(gè)月鱧群體的聚類

利用Genbank中斑鱧(Channamaculata，GenBank：MN057083.1)、烏鱧(Channaargus，GenBank：KU852447.1)作為同屬外群同源序列，對(duì)所有月鱧單倍型進(jìn)行NJ聚類和UPMGA聚類(圖1)。從單倍型NJ樹(shù)可看出，6個(gè)倍型分別聚為2支，其中，Hap3、Hap4、Hap5聚為1支，Hap1、Hap2、Hap6聚為1支，最后2支聚在一起。以布展值50為劃分標(biāo)準(zhǔn)，長(zhǎng)江流域與珠江流域月鱧種群內(nèi)部單倍型遺傳分化不明顯，結(jié)合各群體單倍型分布情況及各群體間遺傳距離的分析結(jié)果，長(zhǎng)江流域及珠江流域月鱧群體之間種群分化不明顯。月鱧群體與同屬外種群明顯分開(kāi)，但與斑鱧遺傳關(guān)系更近，與楊春英等[14]的研究結(jié)果一致。

圖1 4個(gè)月鱧群體基于cytb單倍型的NJ樹(shù)及UPGMA樹(shù)Fig.1 NJ tree and UPGMA tree of C. argus population with four-month-age based on Cyt b haplotype

月鱧單倍型UPGMA樹(shù)聚類趨勢(shì)和NJ樹(shù)聚類趨同，均支持貴州月鱧種群的遺傳關(guān)系劃分為兩大支系。

3 討論

核苷酸多樣性指數(shù)是判斷群體遺傳多樣性水平的重要指標(biāo)。研究結(jié)果顯示，貴州境內(nèi)長(zhǎng)江流域(烏江、清水江)和珠江流域(都柳江、貓營(yíng)河)4個(gè)月鱧群體遺傳多樣性水平呈烏江群體>貓營(yíng)河群體>都柳江群體>清水江群體，總體呈長(zhǎng)江流域>珠江流域。從單倍型數(shù)量上看，烏江群體出現(xiàn)4種單倍型，貓營(yíng)河群體與都柳江群體均為2種單倍型，而清水江群體僅1種。根據(jù)GRANT等[15]對(duì)核苷酸多樣性指數(shù)(π)<0.005則群體遺傳多樣性水平低的判斷，貴州月鱧群體(π=0.001 98)整體遺傳多樣性處于較低水平。從近年來(lái)對(duì)相關(guān)水系魚(yú)類遺傳多樣性的研究結(jié)果看，貴州境內(nèi)月鱧遺傳多樣性低于小口白甲魚(yú)[16]、清水江鯉[17]、都柳江鲇、光倒刺鲃[18]等經(jīng)濟(jì)魚(yú)類。生物種群瓶頸效應(yīng)、建群效應(yīng)、棲息地破碎化以及遺傳漂變等因素都有可能引起生物遺傳多樣性偏低，20世紀(jì)90年代有水產(chǎn)科技人員指出，月鱧面臨資源衰減的困境[19]。根據(jù)本次對(duì)貴州月鱧采樣的分布結(jié)果看，月鱧的保有數(shù)量相比20年前大大減少，人類活動(dòng)很大程度上影響月鱧種群數(shù)量，這有可能是造成月鱧遺傳多樣性水平低的原因。清水江月鱧種群的主要遺傳多樣性參數(shù)數(shù)值均為0，且倍型單一，除人類活動(dòng)外可能與采集到的月鱧為稻田養(yǎng)殖區(qū)的樣本有關(guān)。黔東南地區(qū)月鱧主要在稻田養(yǎng)殖區(qū)，稻田養(yǎng)魚(yú)相較河流有更大的局限性，造成月鱧群體的小范圍地理隔離，從而影響群體遺傳多樣性水平。目前沒(méi)有貴州月鱧遺傳多樣性的相關(guān)研究報(bào)道，隨著長(zhǎng)江流域開(kāi)展“十年禁捕”工作，相信月鱧資源會(huì)得到一定恢復(fù)，今后可適時(shí)增加樣品采集地以及使用其他分子標(biāo)記如CoI、D-loop、ITS等再次對(duì)月鱧遺傳多樣性開(kāi)展研究。

研究顯示，貴州境內(nèi)長(zhǎng)江流域和珠江流域月鱧群體有一定的遺傳分化，但群體間遺傳距離不大，種群分化不明顯。根據(jù)種群間分岐時(shí)間估算，貴州月鱧群體間分化時(shí)間最早在15萬(wàn)年前，晚于苗嶺山脈成為長(zhǎng)江流域和珠江流域諸水系分水嶺的時(shí)間[20]，說(shuō)明地理隔離是造成兩江流域月鱧群體遺傳分化的重要因素。烏江月鱧群體和貓營(yíng)河月鱧群體之間遺傳分化程度不高，存在一定程度的基因交流，這可能是因?yàn)樨垹I(yíng)河處于珠江流域和長(zhǎng)江流域分水嶺，兩流域水系時(shí)有相互掠水現(xiàn)象，地理隔離不明顯；也可能與貴州境內(nèi)曾經(jīng)開(kāi)展過(guò)月鱧的人工養(yǎng)殖有關(guān)，推測(cè)造成兩群體遺傳分化的主要原因可能是生殖隔離。月鱧遺傳分化程度高，基因交流不頻繁，還可能與其生活習(xí)性相關(guān)。月鱧是廣溫、雜食性魚(yú)類，對(duì)環(huán)境適應(yīng)能力強(qiáng)，游泳距離短，不需要生殖洄游、索餌洄游及越冬洄游，甚至在稻田里面就能生存，造成一定范圍的地理隔離和生殖隔離。

4 結(jié)論

采用PCR技術(shù)對(duì)貴州境內(nèi)長(zhǎng)江流域(烏江、清水江)和珠江流域(都柳江、貓營(yíng)河)的4個(gè)月鱧群體(共130尾月鱧樣本)進(jìn)行遺傳關(guān)系及遺傳背景研究。結(jié)果表明，貴州月鱧Cytb基因946 bp序列的A+T含量為53.7%，高于G+C含量(46.3%)，其堿基組成表現(xiàn)為C的含量最高、G的含量最低，呈較強(qiáng)的反G偏倚性。在130個(gè)月鱧樣本中存在6種單倍型，總體核苷酸多樣性指數(shù)為0.001 98，單倍型多樣性指數(shù)為0.734。4個(gè)月鱧群體間平均遺傳距離為0.002 29，以貓營(yíng)河-都柳江群體的遺傳距離最大(0.003 08)，烏江-貓營(yíng)河群體的最小(0.001 31)?？傮w看，貴州兩江流域境內(nèi)月鱧遺傳多樣性水平低，長(zhǎng)江流域和珠江流域月鱧各群體種群分化不明顯。可以利用各月鱧群體間遺傳分化程度高的有利條件，加強(qiáng)各群體間親本的交叉繁殖，盡量避免群體內(nèi)部近親繁殖，提升月鱧整體遺傳多樣性水平，達(dá)到保護(hù)貴州土著魚(yú)類資源及開(kāi)發(fā)利用的目的。