吳萍萍， 肖慧琳， 宋曉丹， 黃麗英*

(1.福建醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，福建福州 350122)(2.福建省立醫(yī)院，福建福州 350001)

結(jié)直腸癌(colorectal,CRC)是常見的消化道惡性腫瘤之一，在我國的發(fā)病率呈逐年上升的趨勢[1]，尋找新穎的腫瘤標(biāo)志物對惡性腫瘤的早期預(yù)警具有十分重要的意義。尿液中的修飾核苷排放量可反映機體中tRNA的降解速率，進(jìn)而確定機體內(nèi)細(xì)胞增殖的情況。當(dāng)腫瘤患者體內(nèi)的腫瘤細(xì)胞迅速增長時會加快tRNA的合成速度，尿液中的修飾核苷的排放量也隨之相應(yīng)升高[2]。因此尿中修飾核苷的含量測定，對于腫瘤的早期診斷、治療和預(yù)后情況跟蹤具有重要的臨床意義。研究發(fā)現(xiàn)[3 - 5]，結(jié)直腸癌患者血清、組織和尿液中8-羥基脫氧鳥苷(8-OHdG，8-hydroxy-2-deoxyguanosine)較正常對照組顯著增加，8-OHdG水平升高是早期結(jié)腸癌與結(jié)直腸腺瘤的危險因素。馮波等[6]對結(jié)直腸癌患者尿液中的14種修飾核苷進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)假尿苷和1-甲基鳥苷(M1G,1-methylguanosine)具有較高敏感性,且與腫瘤大小與病理分期相關(guān),更具臨床應(yīng)用前景。

目前，尿中8-OHdG和M1G的檢測方法主要包括生物檢測法和色譜法等，其中色譜法是現(xiàn)在最普遍的方法。生物檢測法主要是酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)[3],該方法操作簡單，重現(xiàn)好，但是抗體間容易存在交叉反應(yīng)，可能導(dǎo)致檢測值相較于真實值偏高。色譜分析法主要包括高效液相色譜法(HPLC)[7]、高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS)[8]和超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC-MS)[9]。雖然HPLC-MS和UPLC-MS具有較高靈敏度和選擇性，但是存在儀器成本和技術(shù)要求較高等缺點，限制了其廣泛應(yīng)用。

人體尿液中化學(xué)成分十分復(fù)雜，修飾核苷含量較低且種類多，采用HPLC法檢測前往往需要進(jìn)行預(yù)處理。分子印跡聚合物(Molecular Imprinting Polymers,MIPs)是一種人工合成的高分子材料，具有高特異性、性質(zhì)穩(wěn)定、制備簡單和成本低廉等優(yōu)點[10]。將其作為分散固相微萃取(Dispersive Solid Phase Extraction,DSPE)的吸附劑，能夠更好地除去基質(zhì)干擾，選擇性地從復(fù)雜的樣品中分離和富集目標(biāo)分析物，有效提高分析方法的準(zhǔn)確度和靈敏度。本次研究以8-羥基脫氧鳥苷分子印跡聚合物作為分散固相微萃取吸附劑，將其用于結(jié)直腸癌患者尿液中的8-OHdG和M1G分離與富集，并結(jié)合HPLC對其含量進(jìn)行測定。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

LC-15C高效液相色譜儀(日本島津公司);Agilent TC-C18色譜柱(4.6×250 mm,5 μm)(美國安捷倫科技有限公司)；BS124S電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)；SZ-93自動雙重水蒸餾器(上海亞榮生化儀器廠)；IKA Vortex Genius 3渦旋振蕩器(德國艾卡集團(tuán))；KQ-250DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；FD-1-50凍干機(北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司)；eppendorf 5430r高速冷凍離心機(德國艾本德股份公司)。

肌酐(標(biāo)準(zhǔn)品，99%)、乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)(98%)、十二烷醇(99%)和2，2-偶二氮二異丁腈(AIBN)購自阿拉丁試劑有限公司；甲基丙烯酸(MAA)(99%)購自damas-beta；二甲基亞砜(DMSO)購自上海滬試化工有限公司、1-甲基鳥苷(標(biāo)準(zhǔn)品，98%)和8-羥基脫氧鳥苷(標(biāo)準(zhǔn)品，95%)購自上海源葉生物科技有限公司；乙酸銨和NaCl購自西隴科學(xué)股份有限公司；甲醇(色譜級)購自Sigma-Aldrich試劑公司；除特別說明外，其它試劑均為分析純，實驗室用水為二次蒸餾水。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)品工作液配制

肌酐標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液：精密稱取0.100 g肌酐標(biāo)準(zhǔn)品粉末，用水定容至10 mL容量瓶(10.00 mg/mL)，置于4 ℃保存?zhèn)溆?，根?jù)需要將儲備液用水稀釋到一定濃度的標(biāo)準(zhǔn)品工作液。1-甲基鳥苷標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液：精密稱取0.0100 g 1-甲基鳥苷標(biāo)準(zhǔn)品粉末，用水定容至10 mL容量瓶(1.000 mg/mL)置于-20 ℃冷凍保存?zhèn)溆谩?-羥基脫氧鳥苷標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液：精密稱取0.0100 g 8-羥基脫氧鳥苷標(biāo)準(zhǔn)品粉末，用水定容至10 mL容量瓶(1.000 mg/mL)置于-20 ℃冷凍保存?zhèn)溆?。使用時根據(jù)需要將8-OHdG和M1G兩種標(biāo)準(zhǔn)品儲備液用水稀釋至一定溶度的混合標(biāo)準(zhǔn)品工作液。

1.3 液相色譜分析條件

色譜柱：Agilent TC-C18(4.6×250 mm,5 μm)；流動相：A為0.03% 乙酸-5 mmol/L乙酸銨，B為甲醇。梯度洗脫程序為：0～5 min，2%B；5～10 min，2%～8%B；10～35 min，8%B；35～40 min，8%～2%B。流速：1.0 mL/min；檢測波長：254 nm；柱溫：30 ℃，進(jìn)樣量：20 μL。

1.4 分子印跡聚合物的制備

實驗參考文獻(xiàn)報道方法[11,12]，采用本體聚合法制備。在50 mL的EP管中加入15 mL的DMSO和12 mL十二烷醇溶液，加入模板分子8-羥基脫氧鳥苷(0.5 mmol)、功能單體MAA(2 mmol)超聲混勻孵育15 min，形成模板分子-功能單體復(fù)合物。隨后加入交聯(lián)劑EGDMA(10 mmol),超聲混勻后加入引發(fā)劑AIBN(30 mg)，超聲脫氣5 min，通氮氣5 min除氧，密封，放入60 ℃恒溫水浴鍋中恒溫聚合24 h，得到塊狀固體聚合物。經(jīng)研磨后，加入甲醇-乙酸(90∶10,V/V)渦旋洗脫模板分子，7 830 r/min下離心2 min，棄去洗脫液，重復(fù)多次，直至洗脫液在高效液相254 nm處無檢測到模板分子對應(yīng)的色譜峰。真空干燥至恒重，得到白色粉末(MIPs)研磨過200目篩備用。除不加模板分子8-羥基脫氧鳥苷外，按照同上步驟制備非分子印跡聚合物(NIPs)。

1.5 MIPs的吸附性能測試

1.5.1 MIPs吸附動力學(xué)的測定精密稱取10.0 mg已制備好的MIPs，分別置于50 mL EP管中，各加入5 mL 50 μg/mL 8-羥基脫氧鳥苷水溶液，于20 ℃下恒溫渦旋0、1、2、3、4、5、6、7 min后，7 830 r/min離心5 min。上清液經(jīng)微孔濾膜過濾后，用HPLC分別測定上清液中8-羥基脫氧鳥苷水溶液的濃度，平行測定3次取平均值，利用差減法計算吸附量Q(mg/g)隨時間t(min)的變化值[13]。

1.5.2 選擇競爭性實驗本實驗選擇與8-羥基脫氧鳥苷(底物)分子結(jié)構(gòu)相似的3種核苷類化合物1-甲基鳥苷、腺苷和肌苷為竟?fàn)幍孜镞M(jìn)行比較，考察MIPs和NIPs對竟?fàn)幍孜锖偷孜锏倪x擇性吸附能力與分子識別性能。

比較單獨和分別與8-羥基脫氧鳥苷混合后在MIPs上的吸附情況，計算不同竟?fàn)幍孜锖偷孜镌贛IPs和NIPs上的吸附量Q(mg/g)，采用靜態(tài)分配系數(shù)KD、分離因子α和相對分離因子α′來表征聚合物對竟?fàn)幍孜锏倪x擇性吸附能力。KD、α和α′的計算公式參照文獻(xiàn)方法[14]。cs和s分別表示竟?fàn)幍孜锛暗孜?，?dāng)KDcs=KDs時，α=1。KD越高，表示聚合物對該競爭底物或底物的結(jié)合量越大，對其特異性識別能力超強；α值越高，表示聚合物對底物的選擇性越好；α′越高，表示印跡聚合物MIPs的選擇性比非印跡聚合物NIPs越好。

1.6 樣品收集與處理

疾病組：結(jié)直腸癌患者8名，所有患者均在超聲定位下行穿刺活檢確診，隨機采集尿樣。對照組：健康志愿者8名，隨機采集尿樣。尿樣保存：尿樣收集后立即置于-20 ℃密封保存，備用。

凍存的尿樣于室溫解凍，7 830 r/min下離心10 min，取上清尿樣用水定容至50 mL容量瓶，取10 mL作為萃取供相備用，調(diào)節(jié)pH=7.00，加入30.0 mg MIPs，于10 ℃下渦旋1 min，7 830 r/min下離心5 min，棄去上清液，加入1 mL1%乙酸水溶液，渦旋30 s，重復(fù)三次，合并3次上清液，于-20 ℃冷凍過夜，在-50 ℃，40.0 Pa下冷凍干燥10 h，加入50 μL雙蒸水，12 000 r/min下離心10 min后，取上清液20 μL進(jìn)樣分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 MIPs和NIPs的表征

2.1.1 MIPs和NIPs的電鏡表征圖1分別為MIPs和NIPs的掃描電鏡(SEM)圖，由圖1(A)可見MIPs聚合材料表面較為粗糙，具有更多孔穴；由圖1(B)顯示，NIPs聚合材料表面更為光滑些，孔穴較少。

圖1 MIPs(A)和NIPs(B)的掃描電鏡(SEM)圖Fig.1 SEM images of MIPs(A) and NIPs(B)

2.1.2 MIPs和NIPs的紅外光譜表征圖2為未經(jīng)過洗脫的MIPs(a)、洗脫后的MIPs(b)及NIPs(c)的紅外光譜圖。在圖2a中8-羥基脫氧鳥苷在1 540 cm-1處有一個C=N的特征吸收峰，證明模板分子已經(jīng)成功印跡到MIPs中，而圖2b和圖2c幾乎沒有太大區(qū)別，說明洗脫過后，MIPs中的模板分子已經(jīng)去除干凈。由圖2顯示，3 500～3 400 cm-1是O-H和N-H的伸縮振動峰，1 731cm-1是C=O的伸縮振動峰，1 642 cm-1是C=C的伸縮振動峰，1 266 cm-1是羧基中C-O 的伸縮振動峰，證明了聚合物中功能單體MAA的存在，1 144cm-1是C-O-C的伸縮振動峰，證明了聚合物是由EGDMA合成的。

圖2 分子聚合物的紅外光譜圖a.未經(jīng)洗脫過MIPs;b.洗脫后的MIPs;c.NIPsFig.2 Infrared spectra of MIPs and NIPsa:MIPs before of extraction;b:MIPs after of extraction;c:NIPs.

2.2 動態(tài)吸附曲線

吸附過程的動力學(xué)研究可用來描述吸附劑吸附溶質(zhì)的速率快慢，將數(shù)據(jù)通過動力學(xué)模型進(jìn)行擬合，從而探討該吸附劑的吸附機理。根據(jù)“1.5.1”方法得到由7個時間點和對應(yīng)的吸附量(Q,mg/g)的MIPs吸附動力學(xué)曲線(圖3)。由圖3可知，在0～1 min，吸附量迅速增大，說明該階段吸附速度很快，2～4 min，吸附量隨時間繼續(xù)增大，但是吸附速度明顯下降，4 min之后，吸附量基本不變，吸附動力學(xué)曲線趨于平衡，說明吸附劑對8-羥基脫氧鳥苷的吸附達(dá)到飽和。

圖3 MIPs的吸附動力學(xué)曲線圖Fig.3 Adsorption kinetics curve of MIPs

2.3 選擇競爭性實驗

為了評價吸附劑對8-羥基脫氧鳥苷的選擇性實驗及干擾物對目標(biāo)物吸附的影響，需繪制目標(biāo)物和干擾物的峰面積A對c(μg/mL)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，以求得各物質(zhì)吸附后的濃度。腺苷：A=45844c+9716(r2=1)；1-甲基鳥苷：A=102995c-45198(r2=0.9999)；肌苷：A=52126c+8235.2(r2=0.9999)；8-羥基脫氧鳥苷：A=56095c-3815(r2=1)。

用吸附等溫曲線分別測定MIPs和NIPs對水中目標(biāo)分子和干擾物的吸附量，計算分子印跡聚合物對不同干擾物的靜態(tài)吸附量Q、對底物的結(jié)合分配系數(shù)KD、分離因子α和相對分離因子α′，從而比較MIPs對目標(biāo)分子和干擾物的選擇性，結(jié)果見表1。

表1 MIPs和NIPs對不同目標(biāo)物選擇性吸附實驗

由表1可知，單獨吸附時，MIPs對底物腺苷、1-甲基鳥苷、肌苷和8-羥基脫氧鳥苷的吸附量均高NIPs對底物的吸附量，表明MIPs對8-羥基脫氧鳥苷及其類似物有一定的印跡效應(yīng)。MIPs對8-羥基脫氧鳥苷的分配系數(shù)KD最高，其次是1-甲基鳥苷。在選擇性吸附實驗中，可知MIPs對8-羥基脫氧鳥苷與其他底物的分離因子α均大于1，表明MIPs能夠較好的分離8-羥基脫氧鳥苷和其他結(jié)構(gòu)相似的底物，α值越高，說明越容易分離。α′大于1表明了MIPs對8-羥基脫氧鳥苷和底物的相對分離能力強于NIPs。綜上各項參數(shù)所述，MIPs和NIPs在空間上存在差異，MIPs對8-羥基脫氧鳥苷具有更好的吸附性和選擇性。

2.4 分散固相萃取條件的優(yōu)化

分散固相萃取過程中，使用渦旋振蕩器的目的是使MIPs與混合目標(biāo)物充分接觸并將其吸附。實驗研究了不同的渦旋時間，即15、30、60、120、180、240和300 s的吸附效果，在60 s時對兩個目標(biāo)物的吸附量達(dá)到峰值，但是繼續(xù)渦旋吸附量會降低，可能是渦旋產(chǎn)熱，影響了吸附。實驗研究了不同洗脫溶劑對洗脫率的影響。對于MIPs而言，酸性條件有利于減弱氫鍵的作用，因此采用不同濃度的酸溶液進(jìn)行實驗。分別選擇了乙酸水溶液(0.1%、0.5%、1.0%、2.0%和3.0%)，甲酸水溶液(0.1%、0.5%和1.0%)作為洗脫劑溶液。如圖4所示，1%乙酸溶液的洗脫效果最好，繼續(xù)增大乙酸的濃度反而降低洗脫率。考慮到8-OHdG 和M1G的極性較大，所以本實驗選擇1%乙酸-乙腈溶液、1%乙酸-甲醇溶液以及正丁醇飽和的1%乙酸水溶液作為洗脫液進(jìn)行試驗。結(jié)果表明，正丁醇飽和的1%乙酸水溶液和1%乙酸-甲醇溶液對8-OHdG和M1G的洗脫效果不理想且影響兩個目標(biāo)物的峰型，1%乙酸-乙腈水溶液洗脫效果很差，幾乎不能洗脫目標(biāo)分子，1%乙酸水溶液洗脫效果最好，因此選擇1%乙酸水溶液作為洗脫溶劑。

圖4 洗脫溶劑的選擇Fig.4 The optimization of eluentEluent:A,Formic acid;B.Acetic acid.

3 方法學(xué)考察

3.1 定量標(biāo)準(zhǔn)曲線及方法檢出限

配制濃度范圍為10～1 000 ng/mL 8-OHdG和20～2 000 ng/mL M1G系列的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，在最佳條件下進(jìn)行萃取后結(jié)合高效液相色譜法進(jìn)樣分析。分別以萃取前標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度為橫坐標(biāo)(X，ng/mL)以及萃取后的峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得工作曲線。肌酐標(biāo)準(zhǔn)品溶液不經(jīng)過萃取，以峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品濃度(X，μg/mL)為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸得到工作曲線。結(jié)果表明，3個物質(zhì)在各自線性范圍內(nèi)的線性關(guān)系良好，3個曲線的相關(guān)系數(shù)r2≥0.9996。萃取后的回歸方程、相關(guān)系數(shù)(r2)，線性范圍(ng/mL)、檢測限和定量限見表2。

表2 修飾核苷的回歸方程、相關(guān)系數(shù)(r2)、線性范圍、檢測限、定量限

3.2 精密度實驗

選取50 ng/mL的含有2種目標(biāo)修飾核苷(8-OHdG和M1G)的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，在最佳條件下進(jìn)行萃取，進(jìn)樣分析(每日平行測定6次，連續(xù)測定3天)。選取50 μg/mL的肌酐標(biāo)準(zhǔn)品溶液直接進(jìn)樣分析。測得日內(nèi)精密度的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)小于3.2%，日間精密度RSD小于5.8%。

3.3 回收率實驗

取正常對照組尿液3份，按高、中、低3個水平分別精密加入適量的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液(8-OHdG、M1G和Cre)并稀釋至50 mL，每個添加水平平行測定3次，在最佳條件下萃取2個目標(biāo)目標(biāo)物?；厥章蕦嶒灲Y(jié)果見表3，該方法在尿樣中的加標(biāo)回收率在82.6%～93.2%之間。

表3 尿液中兩種修飾核苷的回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=3)

3.4 實際樣品分析

圖5A為濃度1 000 ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)品8-OHdG和M1G分別經(jīng)NIPs和MIPs處理后得到的色譜圖，可以看出8-OHdG和M1G均具有很好的富集效果，其中萃取前Cre、M1G和8-OHdG的保留時間分別為4.646、26.428、35.515 min，萃取后的M1G和8-OHdG的保留時間為26.304、35.238 min。

應(yīng)用實驗合成的8-OHdG-MIPs，結(jié)合HPLC法對健康對照組和結(jié)腸癌疾病組尿樣進(jìn)行分析測定，每個樣品平行3次重復(fù)測定，取均值為含量值。尿樣萃取前和萃取后對比色譜圖如圖5B所示。尿中修飾核苷在一天中的不同時刻的排放量不盡相同，即其排放量變化差異大，但尿中修飾核苷與肌酐(Creatinine，Cre)的比值卻是恒定的[15]，且受食物影響很小[2]。因此，采用修飾核苷和肌酐的比值(nmol/μmol)來反映正常人和結(jié)直腸癌患者尿液中的修飾核苷的含量。肌酐的濃度可直接由萃取前尿樣測得。實驗分別對8名健康志愿者和結(jié)腸癌患者的尿樣(sampleA)進(jìn)行測定，8-OHdG/Cre(nmol/μmol)和M1G/Cre(nmol/μmol)的比值結(jié)果如表4所示，結(jié)腸癌患者尿樣中的8-OHdG/Cre(P=0.02)和M1G/Cre(P=0.00003)的含量比值水平顯著高于健康志愿者(P<0.05)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

圖5 萃取前后對比圖Fig.5 HPLC chromatograms obtained from mixed standard solutions and urine sample before and after extractionA-a the mixed standard solutions before extraction；A-b the mixed standard solutions after extraction.B-a the urine sample of Colon cancer patients before extraction；B-b the urine sample of Colon cancer patients after extraction.

表4 尿液樣品中修飾核苷/肌酐比值(n=3)

4 結(jié)論

成功制備了8-羥基脫氧鳥苷分子印跡聚合物，其表現(xiàn)出較好的特異性吸附，將其作為分散固相萃取吸附劑，結(jié)合高效液相色譜法測定結(jié)腸癌患者尿液中的8-OHdG和M1G。該方法能夠有效地去除尿液中復(fù)雜基質(zhì)的干擾，提高分析的準(zhǔn)確性，為尿液中的8-OHdG和M1G作為結(jié)直腸癌腫瘤標(biāo)志物的前處理和分析提供了新的思路，使尿中修飾核苷檢測用于臨床成為可能。