張順潤， 鄭 霄， 劉曉軍,2,3， 朱春楠,2,3， 劉 超,2,3， 張朱珊瑩,2,3， 鄭冬云*,2,3

(1.中南民族大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，湖北武漢 430074；2.醫(yī)學(xué)信息分析及腫瘤診療湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢 430074；3.腦認(rèn)知科學(xué)實(shí)驗(yàn)室國家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢 430074)

自1992年被美國《Science》雜志評(píng)為“年度明星分子”后[1]，NO的重要生理功能逐漸為大眾所認(rèn)識(shí)[2,3]。研究表明，許多疾病的發(fā)生，如冠心病、腫瘤、胃腸炎、哮喘等，均與機(jī)體內(nèi)NO含量異常有關(guān)。因此，生物樣品中NO含量的準(zhǔn)確實(shí)時(shí)檢測具有非常重要的生物醫(yī)學(xué)意義。然而，NO半衰期短[4]、濃度低、共存干擾物質(zhì)多，給這項(xiàng)任務(wù)帶來了巨大挑戰(zhàn)。在NO的眾多檢測方法中，電化學(xué)傳感方法因具有靈敏度高、響應(yīng)快速、抗干擾能力好和無需樣品預(yù)處理等特點(diǎn)而得到廣泛關(guān)注。在NO電化學(xué)傳感界面的構(gòu)建過程中，化學(xué)修飾電極起著關(guān)鍵作用[5]。因此，根據(jù)檢測對(duì)象的特征，選擇合適的敏感材料及固定化方法顯得尤為重要。

作為一種新型碳納米材料，石墨烯具有獨(dú)特的二維蜂窩結(jié)構(gòu)和sp2雜化晶體結(jié)構(gòu)，內(nèi)部存在的大量離域電子使其擁有非凡的導(dǎo)電能力，此外石墨烯還具有比表面積大、生物相容性好等優(yōu)點(diǎn)，是一種理想的電極修飾材料[6 - 8]。另一方面，有機(jī)染料導(dǎo)電聚合膜修飾電極具有穩(wěn)定性好、催化性能高、選擇性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)在電化學(xué)傳感領(lǐng)域顯示出良好的應(yīng)用前景[9 - 11]。比如，可通過電化學(xué)聚合的方法將溴甲酚綠修飾到電極表面，并應(yīng)用于電化學(xué)傳感領(lǐng)域[12]。作為一種氧化還原導(dǎo)電聚合物，聚溴甲酚綠(PBG)[13,14]具有良好的電催化性能、快速的電荷轉(zhuǎn)移能力以及離子傳輸能力。本工作制備出Nafion-聚溴甲酚綠-石墨烯納米復(fù)合膜，實(shí)現(xiàn)了其在玻碳電極(GCE)表面的修飾固定，從而構(gòu)建了一種新型的NO納米傳感界面。對(duì)納米復(fù)合膜進(jìn)行了微觀形貌和電化學(xué)行為表征，并探討了該納米復(fù)合膜對(duì)NO的電催化性能，對(duì)傳感器的各項(xiàng)分析性能進(jìn)行了評(píng)價(jià)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

電化學(xué)實(shí)驗(yàn)均在CHI660D電化學(xué)工作站(上海辰華儀器公司)上完成。掃描電鏡(SEM)表征在場發(fā)射電鏡-SU8010(日本日立)上進(jìn)行。pHS-3E酸度計(jì)(上海佑科儀器儀表有限公司)用于調(diào)節(jié)溶液pH值。PGUV-10-AS超純水儀(武漢品冠儀器設(shè)備有限公司)用于實(shí)驗(yàn)用超純水的制備。

氧化石墨烯(GO)分散液(1 mg/mL)購自蘇州碳豐石墨烯科技有限公司。L-精氨酸購自上海如吉生物科技發(fā)展有限公司。5%的Nafion溶液購自上海楚兮實(shí)業(yè)有限公司，使用時(shí)用超純水稀釋至0.05%。多巴胺(DA)、抗壞血酸(AA)和尿酸(UA)購自Fluka。溴甲酚綠、無水乙醇、Na2CO3、KClO4、NaOH、HCl、HNO3、NaH2PO4、Na2HPO4、KCl、K4[Fe(CN)6]和K3[Fe(CN)6]均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。高純氮?dú)夂透呒僋O氣體純度為99.999%，購自武漢紐瑞德特種氣體有限公司。其中，高純氮?dú)庥糜诔O測試溶液中的氧氣，高純NO氣體用于制備NO飽和溶液。NO飽和溶液及標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備依據(jù)參考文獻(xiàn)方法[6]制備。其它試劑均為分析純。

濃度為1.0×107/mL的豚鼠肝細(xì)胞溶液來自中南民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院。

1.2 納米復(fù)合膜修飾玻碳電極的制備

Nafion/PBG/GO/GCE的制備步驟：(1)先用拋光布和粒徑50 nm Al2O3漿液將直徑3 mm的GCE拋光至鏡面，然后依次用體積比為1∶1的HNO3、無水乙醇和超純水各超聲清洗2 min，室溫晾干。(2)將裸GCE置于0.1 mol/L的KClO4+Na2CO3測試溶液中，采用循環(huán)伏安法，在-0.2～2.0 V電位范圍內(nèi)，以50 mV/s的掃描速率環(huán)掃5圈，對(duì)該電極進(jìn)行電化學(xué)活化。(3)在活化GCE表面滴涂5 μL 1 mg/mL的GO分散液，紅外燈下烘干，制得GO/GCE。(4)將GO/GCE置于含有1.0×10-3mol/L溴甲酚綠的0.5 mol/L NaNO3溶液中，以50 mV/s的掃描速率，在1.0～1.8 V的電位范圍內(nèi)，循環(huán)伏安掃描20圈，對(duì)溴甲酚綠進(jìn)行電化學(xué)聚合，制備得到PBG/GO/GCE。(5)將PBG/GO/GCE置于0.05%的Nafion溶液中，在-1.6～1.6 V的電位范圍內(nèi)，以50 mV/s的掃描速率循環(huán)伏安掃描10圈，制得Nafion/PBG/GO/GCE，即NO電化學(xué)傳感器。

1.3 NO的電化學(xué)檢測

檢測體系均采用三電極系統(tǒng)：GCE或修飾GCE為工作電極，飽和甘汞電極(SCE)為參比電極，鉑電極為對(duì)電極。測試溶液為0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖溶液(PBS，pH=7.0)，掃描電位為0.3～1.1 V。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同電極的掃描電鏡表征

采用掃描電鏡技術(shù)對(duì)不同電極的表面形貌進(jìn)行了表征。由圖1A可見，裸GCE的表面光滑平整；在GO/GCE表面，可明顯觀察到一層GO薄膜(圖1B)；PBG在GCE表面呈褶皺狀薄膜狀態(tài)(圖1C)，而PBG/GO/GCE的表面褶皺更加明顯，呈溝壑狀(圖1D)，該結(jié)構(gòu)對(duì)提高修飾電極的有效比表面積非常有利，有助于NO在電極表面的富集，從而提高NO電化學(xué)傳感器的靈敏度。

圖1 裸GCE(A)、GO/GCE(B)、PBG/GCE(C)以及PBG/GO/GCE(D)的掃描電鏡(SEM)圖Fig.1 SEM images of bare GCE(A),GO/GCE(B),PBG/GCE(C) and PBG/GO/GCE(D)

2.2 NO在不同電極上的電化學(xué)響應(yīng)

采用差分脈沖伏安法(DPV)研究了2.25×10-5mol/L NO在不同電極上的電化學(xué)響應(yīng)。測試溶液中沒有NO時(shí)，無明顯的電化學(xué)響應(yīng)信號(hào)(圖2a)；存在NO時(shí)，裸GCE在0.79 V出現(xiàn)了一個(gè)很微弱的電化學(xué)信號(hào)，峰電流約為0.23 μA(圖2b)；在GO/GCE上，NO的電化學(xué)響應(yīng)有所改善，峰電位負(fù)移，峰電流增大至0.83 μA(圖2c)；NO在PBG/GCE上的電化學(xué)響應(yīng)改善更加明顯，氧化峰電流增大至1.1 μA(圖2d)；相較于其他電極，NO在PBG/GO/GCE上的電化學(xué)響應(yīng)最為靈敏，峰形尖銳，峰電位為0.71 V，峰電流為5.5 μA(圖2e)。結(jié)果表明，PBG/GO納米復(fù)合膜對(duì)NO的電化學(xué)氧化具有明顯催化作用，這歸功于PBG和GO的協(xié)同作用。GO具有較大的比表面積，有助于提高NO在電極表面的富集量；同時(shí)，GO還具有良好的導(dǎo)電性，可有效促進(jìn)NO與電極之間的電子傳遞；而導(dǎo)電聚合物PBG則可作為電子媒介體在NO的電化學(xué)氧化過程中發(fā)揮催化作用。

圖2 PBG/GO/GCE(a和e)、裸GCE(b)、GO/GCE(c),以及PBG/GCE(d)在含有(b,c,d和e)及未含有(a)2.25×10-5 mol/L NO的0.1 mol/L除氧PBS(pH=7.0)中的差分脈沖伏安圖Fig.2 Differential pulse voltammograms of PBG/GO/GCE (a and e),bare GCE(b),GO/GCE (c) and PBG/GCE (d) in 0.1 mol/L deoxidized PBS solution(pH=7.0) with (b,c,d and e) and without (a) 2.25×10-5 mol/L NO

2.3 NO傳感機(jī)理探討

采用線性掃描伏安法研究了NO在Nafion/PBG/GO/GCE上的電化學(xué)行為。如圖3A所示，當(dāng)掃描速率v從50 mV/s逐漸增加至250 mV/s時(shí)，NO在Nafion/PBG/GO/GCE上的氧化峰電流呈線性增大：Ip=2.4+0.034v，R2=0.9800(圖3B)，表明NO在Nafion/PBG/GO/GCE上的電化學(xué)氧化反應(yīng)是一個(gè)受吸附控制的過程。同時(shí)，循環(huán)伏安結(jié)果顯示，NO在Nafion/PBG/GO/GCE上的電化學(xué)氧化是一個(gè)完全不可逆的反應(yīng)。對(duì)于一個(gè)受吸附控制的完全不可逆反應(yīng)，峰電位與掃描速率的自然對(duì)數(shù)呈線性相關(guān)[15]。結(jié)合圖3C中的數(shù)據(jù)處理結(jié)果，即：Ep=0.61+0.06lnv(R2=0.9900)，根據(jù)Laviron theory公式[15]，可計(jì)算得到，NO在Nafion/PBG/GO/GCE上所發(fā)生的電化學(xué)氧化反應(yīng)中，轉(zhuǎn)移電子數(shù)為0.7≈1。

圖3 (A)不同掃描速率下2.25×10-5 mol/L NO在Nafion/PBG/GO/GCE上的線性掃描伏安圖；(B)NO氧化峰電流與掃描速率之間的線性關(guān)系圖；(C)NO氧化峰電位與掃描速率自然對(duì)數(shù)之間的線性關(guān)系圖Fig.3 (A)Linear sweep voltammoams of 2.25×10-5 mol/L NO on Nafion/PBG/GO/GCE at different scan rates;(B)Linear relationship between the oxidation peak current of NO and scan rates;(C)Linear relationship of the oxidation peak potential of NO with the natural logarithm of scan rates

2.4 傳感器的性能評(píng)價(jià)及實(shí)際應(yīng)用

2.4.1 傳感器的線性范圍、靈敏度、檢出限及響應(yīng)時(shí)間采用安培法對(duì)所制備NO電化學(xué)傳感器的分析性能進(jìn)行了評(píng)價(jià)，如圖4所示。從200 s開始，每隔100 s，向測試溶液中加入不同濃度NO標(biāo)準(zhǔn)溶液?？梢钥闯鲈?00～700 s，由于NO濃度較低，未觀察到明顯的NO電化學(xué)響應(yīng)；700 s后，隨NO濃度的增加，開始出現(xiàn)電流階梯，對(duì)應(yīng)于NO在電極表面的電化學(xué)氧化(圖4A)。對(duì)圖4A中的數(shù)據(jù)進(jìn)行處理可得，NO在Nafion/PBG/GO/GCE上的氧化峰電流與其濃度在1.0×10-7～2.25×10-4mol/L范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系(圖4B)。其線性范圍分別為：1.0×10-7～1.0×10-6mol/L和1.0×10-6～2.25×10-4mol/L，靈敏度分別為4.16 μA/(μmol/L)和0.44 μA/(μmol/L)。結(jié)合圖4B的內(nèi)插圖，采用作圖法可得到傳感器的檢出限為2.0×10-8mol/L。

圖4 (A)0.1 mol/L的除氧PBS(pH=7.0)中不同濃度的NO在Nafion/PBG/GO/GCE上的安培響應(yīng);(B)NO氧化峰電流與其濃度間的線性關(guān)系圖Fig.4 (A)Amperometric response of Nafion/PBG/GO/GCE with successive injections of NO in 0.1 mol/L deoxidized PBS solution(pH=7.0)(Inset:amperometric response of 100 nmol/L NO);(B)Relationship between the oxidation peak current of NO and its concentration(Inset:the concentration range is from 1.0×10-7 mol/L to 1.0×10-6 mol/L)

2.4.2 傳感器穩(wěn)定性、重現(xiàn)性和抗干擾能力穩(wěn)定性和重現(xiàn)性也是電化學(xué)傳感器的重要性能指標(biāo)。將制備好的Nafion/PBG/GO/GCE在空氣中放置15 d后，用于2.25×10-5mol/L NO的測定，其響應(yīng)信號(hào)為原來的92%，表明傳感器具有良好的穩(wěn)定性。用同一支Nafion/PBG/GO/GCE對(duì)2.25×10-5mol/L NO進(jìn)行10次平行測定，NO氧化峰電流的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.6%，表明傳感器具有良好的重現(xiàn)性。

圖5 生物共存物質(zhì)對(duì)NO電化學(xué)響應(yīng)的影響Fig.5 Influence of biological coexisting substance on the electrochemical response of NO

2.4.3 傳感器的實(shí)際應(yīng)用取兩份等體積的0.1 mol/L PBS(pH=7.0)，均通氮?dú)獬?0 min，向其中一份溶液中加入一定體積的豚鼠肝細(xì)胞溶液(1.0×107/mL)，另外一份不加入。然后將Nafion/PBG/GO/GCE分別置于上述溶液中，設(shè)置檢測電位為0.85 V進(jìn)行測試。在200 s時(shí)，分別向兩份溶液中加入50 μL濃度為0.1 mol/L的L-精氨酸(L-Arg)，結(jié)果如圖6所示。由圖可看出，當(dāng)測試溶液中沒有豚鼠肝細(xì)胞時(shí)，即使在L-Arg的刺激下，也未見明顯的電化學(xué)響應(yīng)(圖6b)；而當(dāng)測試溶液中含有豚鼠肝細(xì)胞時(shí)，在L-Arg的刺激下，豚鼠肝細(xì)胞中的一氧化氮合酶會(huì)以L-Arg為底物，催化合成NO[17]，因此可觀察到屬于NO的明顯階梯狀電流信號(hào)(圖6a)。結(jié)果表明，所構(gòu)建的NO電化學(xué)傳感器可應(yīng)用于生物樣品中NO含量的準(zhǔn)確實(shí)時(shí)檢測。

圖6 以0.1 mol/L除氧的PBS(pH=7.0)為測試溶液，傳感器分別在含有豚鼠肝細(xì)胞(a)和不含豚鼠肝細(xì)胞(b)溶液中的安培響應(yīng)圖Fig.6 Amperometric response of the sensor in 0.1 mol/L deoxidized PBS (pH=7.0) with guinea pig hepatocyte(a) and without guinea pig hepatocyte(b)

3 結(jié)論

構(gòu)建了Nafion-聚溴甲酚綠-石墨烯納米復(fù)合膜修飾玻碳電極，從而構(gòu)建了一種性能良好的NO納米傳感界面。對(duì)傳感界面進(jìn)行了電化學(xué)及微觀形貌表征，并對(duì)所制備的NO電化學(xué)傳感器的分析性能進(jìn)行了綜合評(píng)價(jià)。研究表明傳感器具有線性范圍寬、靈敏度高、響應(yīng)時(shí)間短、穩(wěn)定性和重現(xiàn)性好、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，可用于生物樣品中NO含量的準(zhǔn)確實(shí)時(shí)檢測，具有良好的生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用前景。