趙子賢，劉 立，謝 天，閻俊卉，文錦芬

(昆明理工大學 建筑與城市規(guī)劃學院，昆明 650500)

無論是低等植物還是高等植物其表面都覆蓋有蠟質(zhì)[1]，植物表皮蠟質(zhì)層的存在，在保持組織和器官功能、保證植物正常發(fā)育等方面起了重要的作用，在抵御各種環(huán)境脅迫如非生物脅迫強光、紫外線輻射、低溫和干旱[2-4], 生物脅迫如細菌和真菌病害以及昆蟲等[2,5]蠟質(zhì)也具有重要的意義。植物表皮蠟質(zhì)的組成成分復(fù)雜多樣，目前發(fā)現(xiàn)統(tǒng)計有100多種，其碳鏈長度多在20～34個碳原子之間，主要由超長飽和脂肪酸鏈(very long chain fatty acids，VLCFAs)及其衍生物組成[6-7]。

在蠟質(zhì)的生物合成過程中，脂肪酸延伸酶復(fù)合體FAE由 4 種酶構(gòu)成，其中β-酮脂酰輔酶A合成酶(KCS)是限速酶，具有嚴格的底物特異性，VLCFA 鏈的長度由KCS決定[8]。目前在擬南芥基因組中發(fā)現(xiàn)了21個KCS基因，根據(jù)它們氨基酸序列的相似性，分為4個亞族：FAE1-like、KCS1-like、FDH-like和CER6；其中KCS2/DAISY 和KCS20參與C20到C22 VLCFAs的延伸、KCS9參與C22到C24 VLCFAs的延伸，而 KCS1 和CUT1/CER6/KCS6則參與C24 VLCFAs的進一步延伸[9]。

百合(Liliumbrowniivar.viridulumBaker)屬于百合科百合屬，作為一種重要的花卉，是世界公認的五大切花之一，在中國切花種植中百合的種植面積僅次于玫瑰[10]。切花百合在采后和運輸過程中由于失水導(dǎo)致花朵畸形和花早衰，影響花的品質(zhì)，降低其商品價值?；ɡ俦砥は炠|(zhì)對花的耐失水脅迫能力有重要的意義，研究切花百合蠟質(zhì)及代謝機理，對切花百合育種、生產(chǎn)和銷售均具有重要的實踐意義。

雖然在擬南芥、水稻、小麥、臍橙和苜蓿等植物中對KCS進行了研究，但在觀賞園藝特別是百合中的研究則尚未見報道。本研究以切花市場的常見百合品種‘黃天霸’為材料，克隆了LbKCS5和LbKCS17，對其蛋白特性進行了生物信息學分析，并對這2個基因在百合不同器官、花蕾不同發(fā)育時期、低溫和失水脅迫下的表達進行了分析，為探究LbKCS5和LbKCS17基因在百合發(fā)育和非生物脅迫中的作用提供理論支持。

1 材料和方法

1.1 植物材料及處理

實驗材料為多頭百合‘黃天霸’，切花與種球購于斗南花卉市場(中國昆明)，昆明理工大學農(nóng)工樓實驗室室溫培養(yǎng)。

1)花蕾發(fā)育4個時期(圖1)，綠蕾期(花蕾全為綠色，緊實)、黃蕾期(花蕾變成黃色，蓬松未開放)、盛花期(花瓣完全展開，顏色最鮮艷)和衰敗期(花瓣開始出現(xiàn)萎蔫)，取花瓣(最外層花瓣)、葉(花下第一片葉)為材料，分析花蕾不同發(fā)育時期花瓣和葉中的基因表達。2)盛花期花瓣(最外層花瓣)、葉片(花下第一片葉)、根、鱗莖(最外層鱗片)、花藥、雌蕊和雄蕊(圖2)為材料進行基因表達研究。3)由于切花百合主要在綠蕾期進行采收，在運輸過程中容易受到失水及低溫脅迫，故以綠蕾期的花為材料進行脅迫處理[11-12]。失水脅迫處理：將綠蕾期的切花，修剪花莖長度為5 cm用蒸餾水洗凈擦干插入空瓶，對照組插入蒸餾水中，然后將材料放入光照培養(yǎng)箱中，23 ℃、14 h光照/21 ℃、10 h黑暗處理，光通量密度 400 μmol·m-2·s-1，相對濕度55%；低溫脅迫處理：將綠蕾期的切花，修剪花莖長度為5 cm，插入蒸餾水，放入光照培養(yǎng)箱中低溫(4 ℃)處理14 h光照/10 h黑暗，光通量密度 400 μmol·m-2·s-1，相對濕度55%。分別在處理 0、3、6、9、12、24 h時取材。

1.2 方 法

1.2.1 RNA提取和反轉(zhuǎn)錄使用Trizol法提取，參照尹慧等[13]和遲博文等[14]的方法提取RNA，反轉(zhuǎn)錄使用賽默飛世爾公司(Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit)試劑盒，嚴格參照說明書進行操作，反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA第一鏈分裝低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 cDNA克隆根據(jù)NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫中檢索到LbKCS5和LbKCS17同源cDNA序列采用Primer Premier 5.0設(shè)計特異性引物，引物序列見表1。利用反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA第一鏈進行PCR擴增，試劑盒參照寶生物公司Taq酶(TaKaRa TaqTM)，PCR反應(yīng)程序：變性98 ℃10 s，退火30 s(LbKCS5和LbKCS17退火溫度分別為50.6 ℃，51.7 ℃)，延伸72 ℃ 1 min/1 000 bp，35個循環(huán)。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，得到明亮的條帶且位置大小準確則送生物公司測序。

表1 基因克隆和qRT-PCR引物

1.2.3LbKCS5和LbKCS17基因的生物信息學分析用DNAMAN進行氨基酸序列比對，MEGA7.0進行系統(tǒng)進化樹分析[15]，在線軟件SOPMA(http://npsa-pbil.ibcp.fr/)進行蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測，SWISS-MODEL(http://swissmodel.expasy.org/)進行蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)預(yù)測，EXPASY(http://us.expasy.org/tools/pi_tool.html6.)計算等電點(pI)和分子量(Mw)，PSORT(http://psort.hgc.jp/)進行亞細胞定位預(yù)測，TMHMM-2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)進行跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測，MEME(http://meme-suite.org/tools/meme)進行蛋白的基序分析[16]。

1.2.4LbKCS5和LbKCS17基因表達特異性分析根據(jù)LbKCS5和LbKCS17同源cDNA序列采用Primer Premier 5.0設(shè)計基因特異性引物，引物序列見表1，內(nèi)參基因為actin(JX826390)。根據(jù)引物進行實時熒光定量PCR(qRT-PCR)分析，使用Hieff?qPCR SYBR?Green Master Mix(No Rox)

試劑盒參考說明書進行操作，反應(yīng)體系：Hieff?qPCRSYBR?Green Master Mix:10 μL，正反引物各0.4 μL，模板DNA 2 μL，無菌超純水 7.2 μL。擴增程序：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，40個循環(huán)，每個樣品3個重復(fù)，采用2-ΔΔCT方法計算相對表達量。利用Excel 2010計算表達量，SPSS 18.0進行方差分析，Sigmaplot12.5作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 LbKCS5和LbKCS17基因克隆

以‘黃天霸’綠蕾期的花cDNA為模板，對LbKCS5和LbKCS17進行特異性引物擴增，得到長度分別約為700和1 200 bp的2條片段(圖3)，經(jīng)測序分析，LbKCS5和LbKCS17的擴增長度分別為689和1 228 bp。

利用Prot Param軟件分析，經(jīng)開放閱讀框預(yù)測分析，LbKCS5基因長度為689 bp，編碼186個氨基酸殘基；LbKCS17長度為1 238 bp，編碼291個氨基酸殘基；LbKCS5和LbKCS17蛋白相對分子量分別為21.297kD和32.908 kD，理論等電點分別為9.37和9.28。

2.2 亞細胞定位和跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測

對這2個蛋白質(zhì)的亞細胞定位進行預(yù)測，發(fā)現(xiàn)LbKCS5和LbKCS17最有可能定位在細胞質(zhì)。通過在線工具TMHMM-2.0對LbKCS5和LbKCS17蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)進行預(yù)測，結(jié)果表明LbKCS5蛋白可能是一個與細胞信號傳導(dǎo)有關(guān)的膜受體蛋白，其中1～14位氨基酸位于細胞膜表面，15～34、166～185位氨基酸之間形成2個典型的跨膜螺旋區(qū)；而LbKCS17蛋白預(yù)測為不含跨膜螺旋區(qū)。

2.3 LbKCS5和LbKCS17基因編碼蛋白的結(jié)構(gòu)預(yù)測

使用SOPMA進行二級結(jié)構(gòu)預(yù)測，結(jié)果表明LbKCS5蛋白的α螺旋占氨基酸殘基總數(shù)的67%、LbKCS17占43.64%；β-轉(zhuǎn)角在LbKCS5蛋白中占氨基酸殘基總數(shù)的6.53%、LbKCS17中占6.53%；無規(guī)則卷曲在LbKCS5中占6%、LbKCS17中占35.05%；延伸鏈在LbKCS5中占18%，LbKCS17中占14.78%。通過在線工具MODELING進行三級建模，結(jié)果顯示LbKCS5和LbKCS17蛋白三級結(jié)構(gòu)主要是由α螺旋、β-轉(zhuǎn)角、無規(guī)則卷曲和延伸鏈構(gòu)成，與二級結(jié)構(gòu)預(yù)測一致。

2.4 LbKCS5和LbKCS17的氨基酸序列及基序分析

使用在線軟件MEME進行蛋白motif分析(圖4，Ⅰ-A)發(fā)現(xiàn)，LbKCS5蛋白與4種植物的motif位置前后較相近，其中包含3個相似motif；圖4，Ⅰ-B中字母高低代表氨基酸序列的出現(xiàn)頻率大小，motif 1和motif 2、motif 3的氨基酸序列相比存在大約69%和73%、87%的差異，推測motif 1在5種植物生長發(fā)育中起到了關(guān)鍵的生物學作用。圖4，Ⅱ-A中，LbKCS17蛋白與菠蘿的motif 位置大小最相近，與木樨欖、野大豆較為相近，motif 1、2、3、4(圖4，Ⅱ-B)的氨基酸序列相比存在30%、47%、48%、63%的差異。結(jié)果表明，motif 1在5種植物生長發(fā)育中起到重要作用。

2.5 LbKCS5和LbKCS17的系統(tǒng)進化分析

通過Blast序列比對(圖5，Ⅰ)發(fā)現(xiàn)，LbKCS5與油棕(Elaeisguineensis)、海棗(Phoenixdactylifera)序列相似性最高，分別為82.61%和81.37%，與亞麻薺(Camelinasativa)等植物相似性為77%～80%；LbKCS17(圖5，Ⅱ)與蓮(Nelumbonucifera)相似性最高，為77.62%，與番茄(Solanumlycopersicum)等相似性為75%～77%。利用InterPro(http://www.ebi.ac.uk/interpro/)進行保守結(jié)構(gòu)域分析(圖5，Ⅰ)，LbKCS5在2～36、51～132個氨基酸處含2個保守結(jié)構(gòu)域，分別為IPR013601：FAE1 typ3 polyketide synth(FAE1/Ⅲ型聚酮合酶)、IPR013747: ACP syn Ⅲ C(3-氧代酰基-?；d體蛋白合酶)；LbKCS17(圖5，Ⅱ)在1～160和177～257個氨基酸處有2個成分復(fù)雜度較低的保守結(jié)構(gòu)域，分別為IPR013601：FAE1 typ3 polyketide synth(FAE1/Ⅲ型聚酮合酶)、IPR013747: ACP syn Ⅲ C(3-氧代酰基-?；d體蛋白合酶)，說明這些保守結(jié)構(gòu)域在不同物種存在著相似的生物學功能。

通過系統(tǒng)進化樹(圖6，Ⅰ)分析發(fā)現(xiàn)，LbKCS5與山藥(Dioscoreacayenensissubsp.rotundata)、海棗(Phoenixdactylifera)、姜(Zingiberofficinale)進化水平較接近且在同一分支中，與亞麻薺、煙草(Nicotianaattenuata)進化水平較遠。如圖6，Ⅱ所示，LbKCS17與菠蘿、蓮、油棕進化水平較接近且在同一分支，與番茄、中華辣椒(Capsicumchinense)等茄科植物進化水平較遠。

2.6 LbKCS5和LbKCS17基因在百合器官中的表達

如圖7所示，在‘黃天霸’營養(yǎng)器官中，LbKCS5的表達量以根中最低，葉中最高；在花器官中LbKCS5的表達量依此為雄蕊>雌蕊>花藥>花瓣；LbKCS17表達量也是在根中最低，葉中最高；在花器官中的表達則是在花藥中最高，雄蕊次之，花瓣中最低。

2個基因在花蕾發(fā)育不同時期的表達如圖8所示，LbKCS5在花瓣和葉中的表達均先增加后下降，在黃蕾期達到最大值(圖8，A)。LbKCS17在花蕾生長發(fā)育過程中，在花瓣中的表達先升高后降低，在黃蕾期和盛花期表達最高；在葉中其表達相對較低，也是在黃蕾期表達量達到峰值(圖8，B)。

2.7 不同脅迫下LbKCS5和LbKCS17基因的表達

如圖9所示，失水脅迫能誘導(dǎo)LbKCS5和LbKCS17表達量升高。其中，LbKCS5在失水脅迫處理6 h高于對照(圖9，A)，在9 h與對照差異顯著，12 h達到峰值；LbKCS17則在處理3 h高于對照，在6 h時與對照差異顯著，到24 h時其表達量仍在增加且與對照差異顯著(圖9，B)。

圖10顯示低溫處理下2個基因的表達。LbKCS5在12 h前低于對照，在12 h時達到最高峰并且顯著高于對照(圖10，A)；但低溫未能誘導(dǎo)LbKCS17的表達增加，與對照相比反而降低了其表達量(圖10，B)。

3 討 論

植物表皮蠟質(zhì)是覆蓋在植物表面的一類不溶于水而易溶于有機試劑的物質(zhì)。VLCFA是蠟質(zhì)合成的重要前體，KCS是植物合成VLCFAs的關(guān)鍵限速酶，該酶催化 C2單元從丙二酰-CoA 縮合為?；?CoA，決定了VLCFAs的合成速率和碳鏈長度[17]。

研究表明，在百合營養(yǎng)器官中LbKCS5和LbKCS17均有表達，這2個基因在葉中表達量最高，而在根中最少；在擬南芥中發(fā)現(xiàn)KCS4 主要在芽和根頂端分生組織、葉脈、成熟和發(fā)芽的花粉粒以及發(fā)育中的胚中表達[17]，KCS10 在植株地上部分表達，而在根中為最少[18]。KCS在蒺藜苜蓿葉、花器官和莖頂端分生組織，但在根中表達水平較低[19]；Pruitt 使用原位 RNA 雜交技術(shù)分析表明KCS10 基因定位于擬南芥的莖、葉和花瓣等表皮細胞，但在根中幾乎無信號[20]。此外，在大麥中的研究也暗示，KCS基因表現(xiàn)出不同的組織表達模式[21]。

本研究在花器官中的表達結(jié)果顯示，在雄蕊中LbKCS5的表達量最高，LbKCS17則在花藥中最高，在花瓣中二者的表達量最低。臍橙中CsKCS6在所有組織中均有表達，在柱頭中檢測到最高表達[22]；Yang等[23]研究表明，在柑桔中CsKCS2和CsKCS11主要在果實的外皮表達，且它們的表達隨著成熟而急劇增加。在百合花蕾生長發(fā)育過程中，本研究結(jié)果表明花瓣和葉中2個基因的表達均先升高后下降，花瓣中2個基因的表達在黃蕾期達到峰值，在黃蕾期的葉中LbKCS5表達量最高。此外，Cheng等[24]在百合的綠蕾期和盛花期對花瓣中蠟質(zhì)種類和含量檢測結(jié)果表明，隨著花的發(fā)育花瓣中蠟質(zhì)種類增加，蠟質(zhì)含量升高，結(jié)合本研究中LbKCS5和LbKCS17基因在百合不同器官及花蕾不同發(fā)育階段中的表達變化，因此推測LbKCS5和LbKCS17可能參與百合表皮蠟質(zhì)的生物合成。

植物表皮蠟質(zhì)作為植物和環(huán)境間的第一道屏障，對植物體內(nèi)水分的維持有重要意義。作為蠟質(zhì)脂肪酸合成通路中的限速酶，故推測當植物受到非生物脅迫時，KCS有可能會做出相應(yīng)應(yīng)答。在蘋果果皮中發(fā)現(xiàn)8個MdKCS基因在干旱、脫落酸 (ABA) 和 NaCl 處理下被顯著誘導(dǎo)表達[25]；此外，Guo等[22]在臍橙中也發(fā)現(xiàn)CsKCS6的轉(zhuǎn)錄因干旱脅迫、鹽脅迫和脫落酸(ABA)處理發(fā)生了變化，在擬南芥中過表達該基因則提高了轉(zhuǎn)基因植株抗非生物脅迫的能力。本研究中，失水和低溫處理均能誘導(dǎo)切花百合中LbKCS5的表達；失水脅迫提高了LbKCS17的表達量，但低溫卻降低了其表達量，且LbKCS17對失水脅迫響應(yīng)更敏感。由此可見，LbKCS5和LbKCS17對這兩種非生物脅迫有響應(yīng)，這也為將來提高百合耐失水、低溫的脅迫能力提供了可行途徑和理論支持。

本研究通過克隆百合切花蠟質(zhì)合成的關(guān)鍵基因LbKCS5和LbKCS17，分析了他們在百合不同器官、花發(fā)育不同階段的表達模式以及在失水和低溫脅迫下的表達，為通過調(diào)控百合切花中LbKCS5和LbKCS17的表達，進一步調(diào)控百合切花中蠟質(zhì)含量，提高切花在采后和長距離運輸中的耐失水和低溫脅迫能力，避免因脅迫導(dǎo)致的花蕾畸形、早衰，最終延長切花的瓶插期，提高切花的質(zhì)量提供了可能。