朱栗瓊，蒙東萍，招禮軍

(廣西大學 林學院, 廣西森林生態(tài)與保育重點實驗室, 南寧 530004)

自然界中種子植物個體和種群數(shù)量的增多及種質基因的延續(xù)主要靠其成功的有性生殖來實現(xiàn)，若生殖過程中有任何一個環(huán)節(jié)出現(xiàn)異常，都將不同程度地導致生殖失敗，因此了解植物的有性生殖、特別是植物大、小孢子的發(fā)生和雌、雄配子體的發(fā)育規(guī)律具有重要意義，并可以根據(jù)其發(fā)生和發(fā)展的機理，人為采取合理的措施控制其生長發(fā)育過程，達到生產上的高產、優(yōu)質目的[1-2]。

羅漢松(Podocarpusmacrophyllus)屬于羅漢松科(Podocarpaceae)羅漢松屬(Podocarpus)植物，主要分布在中國南部各省。羅漢松為常綠喬木，樹型優(yōu)美，枝干耐盤扎，對干旱、瘠薄環(huán)境有較強適應性，具有良好的觀賞效應和改善環(huán)境的作用。羅漢松內含的酯類化合物[3]、雙黃酮化合物等藥用成分被挖掘[4]，已被證實具有一定醫(yī)療價值，羅漢松的盆景制作與賞析[5]、生理特征[6]、形態(tài)結構[7-8]、遺傳多樣性[9]、培育方法[10]及其根瘤特性[11-12]等方面也有相關報道，而關于其生殖生物學的報道資料較少。本研究在羅漢松雄球花的分化和發(fā)育過程中，分階段取樣制片，通過光學顯微鏡和掃描電鏡觀察其形態(tài)結構特征，以期掌握羅漢松小孢子的發(fā)生和雄配子體的發(fā)育規(guī)律，為羅漢松的生殖和雜交組合提供胚胎學證據(jù)，并為其選育工作提供科學依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 樣地概況

羅漢松樣地位于南寧市廣西大學校園內，位于107°45′～108°51′E，22°13′～23°32′N，地貌為典型低山、丘陵，平均海拔76.5 m，屬南亞熱帶季風氣候，陽光充足，霜少無雪；年平均氣溫21.7 ℃，冬季1月最冷，均溫12.8 ℃，夏季7、8月最熱，均溫28.2 ℃；年平均降雨量1 298 mm，干濕季較明顯，夏季為雨季，秋冬季偏干旱[13]。

1.2 試驗方法

1.2.1 開花物候觀察通過查詢和觀察了解到羅漢松花芽通常在10月中下旬開始分化，本實驗2018年10月10日開始，選擇5株長勢良好、樹體健壯的成熟羅漢松雄株樣樹，于樹干中部向陽面的位置選取5～10根枝條，每枝條上標記10～20個花芽，研究羅漢松雄株群體從花芽分化至散粉的生長發(fā)育情況，每7 d觀察和采集5個雄球花一次(休眠期除外)，并進行拍照記錄，樣本置于FAA液保存。

1.2.2 花粉形態(tài)電鏡掃描參照羅敏蓉等[14]的方法，于盛花期隨機選擇樣樹正?；ㄐ?0枝，置于牛皮紙袋中將花粉抖落并裝入2 mL離心管密封，4 ℃冰箱保存。制片時通過2.5%戊二醛固定-磷酸緩沖液清洗3次-乙醇逐級脫水-干燥儀干燥-粘片-觀察-拍攝(Hitachi SU8220電子掃描顯微鏡)，隨機選擇花粉粒各角度20個界面拍攝，觀察和計算各特征值，取其平均值為數(shù)量特征值。

1.2.3 石蠟切片制片方法參照趙鉛等[15]的方法(適當改進)對采集的羅漢松雄球花制片，具體步驟為：經過乙醇逐級脫水-TO型生物制片透明劑透明-透蠟(54～56 ℃熔點)-包埋-切片(6～8 μm)-烘片-乙醇逐級脫蠟-復水-染色(0.05%甲苯胺藍)-封片(中性樹膠)等，用于制片的花序每階段樣本至少10枝，隨機切片30張。通光學顯微鏡對上述固定片進行觀察和拍攝，重點觀察的內容有：小孢子囊壁的發(fā)育、小孢子的發(fā)生、雄配子的發(fā)育等。

2 結果與分析

2.1 羅漢松雄球花生殖物候及外形特征

經觀察，羅漢松雄球花均為腋生。每年的9月花芽分化已基本完成，至10月圓錐狀單生雄球花出現(xiàn)，外有2層苞片包被，后持續(xù)發(fā)育成卵圓形，苞片由淺綠色逐漸轉變?yōu)樽攸S色(圖1，A)，球花頂端逐漸出現(xiàn)凹痕，至11月中下旬，凹痕加深并將花芽一分為二或三個(圖1，B)，形成簇生花序，持續(xù)生長至12月中旬，花序體積有所增大，顏色進一步加深(圖1，C)。12月下旬至次年2月，雄球花生長發(fā)育進入相對停止時期，外形、顏色、大小無明顯變化；進入3月，雄球花快速生長，首先是淺綠色球花撐裂苞片(圖1，D)，穗狀球花上螺旋狀著生小孢子葉球(圖1，E)，隨著時間的推移。小孢子葉球顏色依次轉變?yōu)辄S綠色、黃色，花序軸及小孢子葉的迅速生長，使得雄球花的體積也明顯增大。羅漢松雄球花初始散粉發(fā)生于3月中旬，4-5月中旬為群體雄球花的盛花期(圖1，F(xiàn))，至5月下旬或六月初所有雄球花基本枯萎變?yōu)楹稚€能在枝條上續(xù)存較長時間。

2.2 羅漢松小孢子葉的發(fā)育

圓柱形的羅漢松雄球花上螺旋狀著生有許多小孢子葉(圖2，A)，小孢子葉的遠軸面基部并列著生2個小孢子囊，即花粉囊，初生的小孢子囊由表皮和孢原細胞組成。

2.2.1 小孢子囊壁的發(fā)育小孢子葉分化形成初期，由其外側近中軸的基部孢原細胞快速分裂，形成的新細胞向內分化為造孢細胞，向外分化為初生壁，后者進一步分化成3層形態(tài)上有明顯差異的細胞，由外及里分別是藥室內壁、中層和絨氈層，各層均只有1層細胞，加上最外層的表皮細胞，小孢子囊壁發(fā)育成有4層細胞組成的結構(圖2，B)。其中表皮細胞在生長初期頂端與基部的細胞差異較明顯，縱切面上看，頂部細胞近長方形，越近基部的表皮細胞與內部的孢原細胞形態(tài)越相似，近方形，但均排列較整齊而緊密，具有明顯的液泡和細胞核。隨著內部造孢細胞的形成，表皮的主要輪廓逐漸顯現(xiàn)，細胞體積增大，液泡化更明顯，至單核小孢子時期，表皮細胞生長至體積最大，各細胞形狀也呈現(xiàn)差異，同時外壁出現(xiàn)角質層，直至花粉粒發(fā)育成熟時，小孢子囊的表皮細胞壁角質化達到最厚(圖2，B中B1所示)。

藥室內壁位于表皮之下，由孢原細胞分化形成。藥室內壁由一層薄壁細胞組成，橫切面上呈長方形，比表皮細胞體積大，但細胞質顏色更深，內含物豐富，細胞核占比更大。當小孢子母細胞進入減數(shù)分裂期和單核小孢子發(fā)育初期時，藥室內壁細胞變化明顯，細胞徑向伸長迅速，外形上更扁平，內含物增多，顏色進一步加深，細胞壁上出現(xiàn)帶狀纖維加厚，此時的藥室內壁亦可稱為纖維層。當花粉發(fā)育成熟時，纖維層細胞徑向擴展達到最大，細胞內含物幾乎消失殆盡，細胞核也隨之解體成為死細胞。中層在纖維層之內，主要出現(xiàn)在孢子母細胞減數(shù)分裂時期，在小孢子囊壁中呈扁平狀，細胞體積最小，細胞質濃，細胞核大，內含物豐富，中層存在的時間較短，當減數(shù)分裂結束時，中層細胞的原生質體會逐漸減少，形態(tài)變得更小且不規(guī)則，在花粉發(fā)育成熟前被分解吸收。絨氈層居于小孢子囊壁最內層，細胞體積較中層細胞偏大，細胞質濃，發(fā)育初期細胞核逐漸由單個變?yōu)槎鄠€，整齊地排列在中層細胞內側，至單核小孢子時期，絨氈層細胞體積已達最大，隨之細胞質發(fā)生濃縮，顏色加深，當花粉發(fā)育成熟初期，絨氈層細胞體積變小，顏色變淺，慢慢降解，最終被吸收消失(圖2，B中B2所示)。因此，羅漢松小孢子囊壁的結構從最初的一層表皮細胞發(fā)育成四部分組成，當花粉粒發(fā)育成熟時又僅剩兩部分，即表皮和纖維層。散粉前，纖維層細胞因干燥收縮使小孢子囊壁撕裂，花粉粒得以散發(fā)出來。

2.2.2 小孢子的發(fā)生與發(fā)育小孢子囊形成初期是由一層表皮細胞包裹著若干個孢原細胞組成，然后由孢原細胞平周分裂進一步產生孢子囊壁細胞和造孢細胞。造孢細胞初期為不規(guī)則多邊形，排列緊密，胞間連絲明顯，細胞質顏色濃，細胞核大，并可見多個核仁。隨著進一步的分裂，細胞數(shù)量增多，體積也增大，細胞逐漸變成近圓形，胞間隙變大，同時細胞壁出現(xiàn)胼胝質，造孢細胞進入小孢子母細胞發(fā)育時期(圖2，C)。進入減數(shù)分裂期時，同一個小孢子囊中可看到處于不同分裂時期的小孢子母細胞(圖2，D)，即羅漢松小孢子母細胞發(fā)育出現(xiàn)不等同性。

減數(shù)分裂的第一次分裂末期兩個核分別移向兩級，形成二分體(圖2，E)，隨后兩核各分裂一次形成四分體，四分體有四面體型和十字交叉型兩種排列方式，后者數(shù)量比例上占多數(shù)(圖2，F(xiàn))。四分體形成后，細胞表面的胼胝質逐漸溶解消失，四分體相互分離形成單核小孢子，此時的單核小孢子細胞質濃，具有2層細胞壁，外壁上有網狀花紋，并由外壁逐漸延伸形成2個對稱的氣囊，氣囊上也具有網狀花紋(圖2，G)，氣囊的發(fā)生開始于四分體時期。

2.3 羅漢松雄配子體的發(fā)育

雄配子體的第一個細胞就是單核小孢子。單核小孢子的進一步發(fā)育首先表現(xiàn)在細胞中逐漸形成一個大液泡，將細胞質及細胞核擠壓至細胞壁邊緣，隨后細胞核發(fā)生第一次分裂，形成第一原葉細胞和胚性細胞，前者近圓形，較大，居于花粉粒中央，后者處于花粉粒近極面，形如一輪彎月。后胚性細胞發(fā)生分裂形成第二原葉細胞和精子器原始細胞，前者位于花粉粒近極面，靠近第一原葉細胞，形態(tài)和大小與第一原葉細胞相似，后者居于花粉粒中央，與胚性細胞形態(tài)相似。精子器細胞經過短暫生長后分裂形成1個生殖細胞和1個粉管細胞，后者居于細胞遠極面。至此，雄配子體發(fā)育成熟(花粉粒)(圖2，H)，2個原葉細胞在生殖細胞形成時先后逐漸被吸收，有的甚至消失，因此成熟雄配子體大部分最后只有生殖細胞和管細胞(圖2，I)，屬于二細胞花粉粒。

2.4 成熟花粉粒微形態(tài)特征

掃描電鏡顯示，羅漢松花粉與松屬植物的花粉相似，花粉粒由本體和兩個氣囊組成(圖3，A)。近極面和遠極面觀察均為橢球狀，側面看形似一頂帶耳的帽子(圖3，B)，兩個氣囊位于本體對稱的兩側，展開的角度較大，和本體連接處較薄，向遠端逐漸加厚，表面均有不規(guī)則的波浪狀褶皺，近極面和遠極面觀察氣囊均呈耳形，而側面看呈耳垂形，表面密集穴狀雕紋。經測量，羅漢松花粉粒平均長為40.502 μm，花粉粒本體平均長21.965 μm，厚15.389 μm，兩者之比約為0.7，呈闊橢球狀，本體近極面的“帽”外壁加厚，表面有顆粒狀和條紋紋理，排列不規(guī)則，側面能看到“帽緣”上具密集瘤狀結構，本體遠極面中部具一較深的萌發(fā)溝，溝的表面粗糙不平，具顆粒狀和網狀紋理，溝的周圍還有瘤狀突起(圖3，C)。

3 討 論

繁殖是植物的重要生命現(xiàn)象之一，是實現(xiàn)物種的延續(xù)、擴大及進化的基礎。有性生殖作為最高級的繁殖方式，其中配子體的發(fā)生和發(fā)育過程中每一環(huán)節(jié)對植物有性生殖的順利進行均至關重要[16]。松杉植物的花粉根據(jù)其內部所存在的細胞數(shù)量一般分為3種類型：三細胞的銀杉型，代表植物是銀杉；四細胞的松型，包括松科和羅漢松科的絕大多數(shù)植物；五細胞的油杉型，如雪松屬、冷杉屬、落葉松屬、云杉屬、油杉屬等歸于此類[17]。實際上羅漢松成熟花粉粒中只有少部分含有2個退化的原葉細胞，介于2細胞和4細胞間，偏向2細胞型，紅豆杉科和三尖杉科植物與羅漢松科植物親緣較近，它們的花粉屬于二細胞型，無原葉細胞，因此將羅漢松花粉類型歸為二細胞型更合理。

總體來看羅漢松雄配子體的發(fā)育過程較順利，如下特性為其起到保駕護航的作用：

(1)小孢子囊的起源方式對小孢子的保護作用。羅漢松小孢子囊從一開始分化就同時具有表皮細胞和孢原細胞，前者包被于后者之外，對幼嫩組織營造了一個穩(wěn)定的環(huán)境，有利于小孢子母細胞及后續(xù)發(fā)展。這種發(fā)育方式與大部分的裸子植物相似，如水松等[16]，少部分裸子植物的孢原細胞分化時無表皮細胞的保護，裸露于小孢子葉基部，如花旗松[17]。

(2)減數(shù)分裂的時機有利于確保其正常進行。減數(shù)分裂是植物有性生殖的最進化的方式，不僅保障了子代與父母本的遺傳穩(wěn)定性，同時實現(xiàn)了子代的遺傳變異，使后代的適應能力增強。有性生殖過程中母細胞的減數(shù)分裂對環(huán)境的變化特別敏感，如溫度、水分、光照、營養(yǎng)等的異常均能影響減數(shù)分裂的正常進行，從而影響植物的結實產量和質量。羅漢松以造孢細胞發(fā)育后期的狀態(tài)進入休眠，因此小孢子母細胞的減數(shù)分裂發(fā)生在溫暖濕潤的春季，避開了干旱而低溫的冬季，為其發(fā)育創(chuàng)造了良好的外界環(huán)境條件。裸子植物減數(shù)分裂的時機因種而異，如紅豆杉屬[17]植物多數(shù)情況下小孢子母細胞在休眠前已完成減數(shù)分裂，并發(fā)育成配子體；歐洲赤松、白云杉等[17]與羅漢松相似，小孢子母細胞在冬季休眠，春季解除休眠后進行減數(shù)分裂。母細胞與子細胞相比較而言抗性強，同時在發(fā)育時間足夠的前提下母細胞營養(yǎng)物質的積蓄有利于提高子細胞的生活力，因此休眠后再進行減數(shù)分裂的方式不免為一種進化方式。

(3)花粉粒發(fā)育時間的不等同性可保障授粉的成功率。在減數(shù)分裂時期可在同一個小孢子囊中看到處于不同分裂時期的小孢子母細胞，可知羅漢松花粉粒的成熟步調不一致。此現(xiàn)象可能與發(fā)育過程中營養(yǎng)物質供給或者光照、溫度、水分等外部條件有關[18-19]，不過可延長傳粉時間，增加授粉的成功率，可認為是植物適應環(huán)境的一種進化表現(xiàn)[20-21]。從實際觀察到結實率較高的現(xiàn)象來推斷，羅漢松的花粉粒發(fā)育成功率較高，保障了授粉所需數(shù)量和質量。生產上若需配子體發(fā)育實現(xiàn)同步性，可采用輔助授粉、改良培育技術或使用激素處理等方式實現(xiàn)，只要保證授粉的完全性，亦可達到提高種子的產量與質量的目的[22-23]。觀察中發(fā)現(xiàn)羅漢松極少數(shù)小孢子囊的內部有時會形成空腔，估計是小孢子數(shù)量多，營養(yǎng)的有限性促使某些小孢子母細胞降解為換取其他小孢子的正常發(fā)育[24]，符合優(yōu)勝劣汰的生存原則。

羅漢松屬有不少優(yōu)良的盆景素材，如珍珠羅漢松、小葉羅漢松、貴妃羅漢松等都是盆景中的佼佼者，但以羅漢松的適應性較為突出，高大的外形使其在大型景觀樹中獨具優(yōu)勢，因此可以把羅漢松作為優(yōu)良的雜交母本，將其獨特的基因引入同屬植物，以獲取觀賞性和抗逆性更強的新品種。