范文博，朱文博，張美華，趙天，江建平*

（1.中國科學院成都生物研究所，成都 610041；2.中國科學院大學，北京 100049）

兩棲動物是脊椎動物中從水生到陸生的過渡類群，生活史比較特殊，涵蓋了水環(huán)境和陸生環(huán)境，因此，在進化生物學方面具有十分重要的科學研究價值。兩棲動物的卵相對較大、無卵殼，易于觀察，常被用于胚胎發(fā)育觀測研究，以促進發(fā)育生物學的發(fā)展（Liu，2016），為兩棲動物繁育、種群人工復壯提供了基礎信息。

中國大鯢是中國特有的兩棲動物，隸屬有尾目Caudata隱鰓鯢科Cryptobranchidae大鯢屬，廣泛分布于我國17個省、自治區(qū)、直轄市，在長江、黃河、珠江三大流域的水系中均有發(fā)現（葉昌媛等，1993；費梁等，2006，2012）。近幾十年來，過度收購、非法捕殺和棲息地喪失等導致野生大鯢種群數量下降極為嚴重，分布區(qū)域日益萎縮（姚一彬等，2013，Zhao，2020），在《中國脊椎動物紅色名錄》中被評定為極危物種（趙爾宓，汪松，1998；蔣志剛等，2016；江建平等，2016，2021）。我國早在1989年將其列為國家二級重點保護動物，2021年明確僅限野外種群（國家林業(yè)和草原局，農業(yè)農村部，2021）。此外，不當放歸加劇了當地原生種的滅絕（Shu，2021）。因此，該物種的野生種群面臨滅絕的風險高，亟待推進有效保護。

對于滅絕風險高的物種，確保其種群復壯是推進有效保護的關鍵。胚胎發(fā)育觀測是提升種群繁育與復壯的重要基礎性工作之一。因此，對中國大鯢進行胚胎發(fā)育觀測研究具有十分重要的意義。陽愛生等（1983）用產于湖南省桑植縣的大鯢胚胎首次進行了初步研究，觀察了大鯢胚胎發(fā)育的17個時期。劉鑒毅等（1994）對大鯢（未標明產地）早期胚胎發(fā)育過程進行了細致觀察，詳細描述了31個時期的外形特征、繪制了各個時期的特征。馮小榮等（1997a）使用石蠟切片的方法對產于湖南省永州市的大鯢胚胎進行了顯微觀察，認為大鯢的胚胎發(fā)育分為8個階段。駱劍等（2007）觀測產于湖南省長沙市的大鯢胚胎，提出大鯢胚胎發(fā)育分為20個時期，而姚一彬等（2013）觀測了產于湖南省張家界的大鯢胚胎，共識別了23個時期。近來的遺傳檢測分析發(fā)現，中國大鯢存在明顯的多個支系分化，可能達到種級分化（Yan，2018），Turvey等（2019）已提議把珠江上游的一個支系恢復為有效物種（Boulenger，1924）。本研究旨在觀測未經研究產地的大鯢個體的胚胎發(fā)育，完善中國大鯢復合體的發(fā)育特性等基礎信息，為該種的保育、放歸工作以及人工養(yǎng)殖產業(yè)的工廠化提供一定的幫助和建議。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

卵群采自四川省眉山市洪雅縣大鯢繁育場（103.156 1°E，29.876 2°N，海拔568 m），并在場內進行觀測。根據遺傳檢測結果，親本源于四川省廣元市青川縣，屬于秦嶺支系。這些親本在生態(tài)養(yǎng)殖環(huán)境中自然發(fā)情、交配、繁殖，產卵于養(yǎng)殖場河道兩側的洞穴內。在受精卵達到后肢芽期前，于河道中孵育并觀測，期間氣溫15.74℃±3.79℃（=204），水溫15.48℃±1.14℃（=209），pH6.5；在后肢芽期后，將胚胎轉移至室內孵育池飼養(yǎng)并觀測，期 間 氣 溫15.31℃±0.73℃（=87），水 溫15.51℃±0.52℃（=87），pH6.5。

1.2 受精率與孵化率統(tǒng)計

隨機選取了養(yǎng)殖場內的10窩卵，觀察到出現卵裂即記為受精卵，進行受精率的統(tǒng)計。后期統(tǒng)計其中未被養(yǎng)殖場混合的4窩卵的孵化率。

1.3 早期個體發(fā)育的觀察、記錄及分期

胚胎發(fā)育外形觀察與記錄：受精卵階段～多細胞期，2 h/次；囊胚期～鰓板期，4～8 h/次；前肢芽期～前肢三指期～后肢三趾期，12 h/次；后肢四趾期為1 d/次。后肢五趾期后，短期內外形特征變化不明顯，適當延長觀察記錄的間隔時間。在循環(huán)系統(tǒng)形成后心臟開始搏動期間，使用體式鏡觀察心跳模式并記錄心率。

受精卵直徑5～7 mm，肉眼即清晰可見個體發(fā)育的外形特征及其變化，觀察時使用數碼相機（Leica DFC450C）拍照，通過胚胎發(fā)育各階段的外形特征及其變化進行發(fā)育分期。用于觀察、拍照和采樣保存的胚胎共153枚。分期主要參考大鯢個體早期發(fā)育的觀測結果（陽愛生等，1983；劉鑒毅等，1994；馮小榮等，1997a，1997b；駱劍等，2007；姚一彬等，2013），以及謝峰等（2001）對鎮(zhèn)海棘螈個體早期發(fā)育的研究結果。

2 結果

2.1 受精率與孵化率

10窩卵的窩卵數變化明顯，最少的僅436顆，最多高達2 274顆。受精率窩間變化明顯，52.60%～96.53%，總體受精率為79.10%，平均窩卵受精率76.90%。4窩卵的孵化率為46.88%～80.02%，窩間變化明顯，總體孵化率為69.85%，平均窩卵孵化率66.80%（表1）。

表1 中國大鯢的受精率與孵化率Table 1 Fertilization rate and hatching rate of Andrias davidianus

2.2 發(fā)育時期及其外形特點

中國大鯢從受精卵到孵化需1 140 h（約48 d）左右，從孵化到指、趾完全成形需要525 h（約22 d）左右。胚胎早期發(fā)育分為30個時期，包括孵化前胚胎發(fā)育的24個時期（時期1～24）和孵化后個體發(fā)育的6個時期（時期25～30）（表2；圖1）。

圖1 中國大鯢早期個體發(fā)育Fig.1 Atlas of Andrias davidianus at early development

表2 中國大鯢早期個體發(fā)育的時相Table 2 Time phases of early development of Andrias davidianus

在前肢芽早期（時期18），心臟開始搏動，腹部可見透明血管網；3對外鰓芽隆起、伸長，前2對長于第三對。隨后出現鰓循環(huán)，表明循環(huán)系統(tǒng)活動已經開始。此時的胚胎可緩慢扭動身體。

隨著發(fā)育進程的推進，心跳能力逐步加強。從剛開始搏動時的10～16次/min，逐步提高到孵化時的30～35次/min，再提高到30～40次/min。不斷提升氧氣的供給能力，以滿足后期發(fā)育的需求。

前肢發(fā)育早于后肢。指的發(fā)育順序為從內向外依次分化出第一指、第二指、第三指和第四指（圖2）。趾的發(fā)育順序也是從內向外依次分化出第一趾、第二趾、第三趾、第四趾和第五趾（圖3）。隨后，四肢基本成形，為個體活動提供逐漸增強的支撐能力。

圖2 中國大鯢前肢發(fā)育Fig.2 Atlas of Andrias davidianus forelimb development

圖3 中國大鯢后肢發(fā)育Fig.3 Atlas of Andrias davidianus hindlimb development

在鰓板期開始出現眼部，到鰓血循環(huán)晚期，眼部區(qū)域色深，出現明顯眼部區(qū)域，在后肢三趾期開始區(qū)分出明顯的眼晶體區(qū)和瞳孔區(qū)，到后肢五趾期時，區(qū)分更加明顯，與成體幾乎一致?？诹言诤笾科陂_始出現，到后肢五趾期時，口裂基本成形（圖4），此時的幼體開食，表明口咽腔開始具備攝食功能。

圖4 中國大鯢頭部發(fā)育Fig.4 Atlas of Andrias davidianus head development

3 討論

3.1 中國大鯢的繁殖產量

中國大鯢整體的受精率、孵化率較高，且平均窩卵數量大，但窩間存在差異，部分窩卵的受精率僅50%左右，較高的可達90%以上，其原因可能在于不同個體的體質存在一定差異。在繁殖期雄性間往往進行激烈的爭斗，該過程可能導致了優(yōu)質繁殖資源與劣質繁殖資源的不均等分配，造成了受精卵出現產量與受精質量的差異。此外，觀察過程中的人為干擾也可能是該現象發(fā)生的原因之一，例如部分窩卵在經過篩選和計數后，會發(fā)生護卵雄鯢吞食掉卵塊的現象，部分窩卵甚至被吞食殆盡。因此，親本的習性可能對產量有一定影響。

3.2 發(fā)育模式

中國大鯢的胚胎發(fā)育階段類似于鎮(zhèn)海棘螈（謝鋒等，2001）、紅瘰疣螈（楊國輝等，2011）和掛榜山小鯢（米小其等，2007）等有尾類兩棲動物，具有相似的卵裂階段、囊胚階段、原腸胚階段、神經胚階段、器官形成階段、孵化階段等，早期細胞分裂與神經、器官的形成順序相對一致，但中國大鯢的卵裂近似于盤狀分裂，植物極未見明顯分裂溝，其原因可能是植物極過大。此次觀測了大鯢早期發(fā)育的30個時期，其中，孵化前的胚胎發(fā)育有24個時期，與姚一彬等（2013）研究結果基本一致。繼續(xù)觀測了孵化后的個體發(fā)育進程，直到后肢五趾期，共6個時期。中國大鯢早期個體發(fā)育時間較長，到孵化期歷時約1 032～1 140 h，超過東方蠑螈（曲韻芳等，1966）、紅瘰疣螈（楊國輝等，2011）、鎮(zhèn)海棘螈（謝鋒等，2001）、東北小鯢（江澗，1985）等有尾類，與掛榜山小鯢相似（米小其等，2007），短于西藏山溪鯢（徐劍，崔建華，1993）。有尾類孵化期的長短差異可能與卵大小和孵化溫度高低有關。

3.3 大鯢自然繁育期的溫度條件

洪雅縣大鯢養(yǎng)殖場采用半自然的仿生態(tài)方式繁育，水溫為溪流的自然水溫。大鯢交配行為發(fā)生在9月初，屬夏季入秋階段，水溫在15.5℃以上，平均水溫在16.6℃左右，最高水溫18℃。在胚胎發(fā)育完畢孵化出幼體階段時，已是10月中下旬，正值深秋，平均水溫下降到15.1℃，最低水溫14.0℃。11月上旬孵化后的幼體發(fā)育達到后肢五趾期時，口咽腔和眼均基本發(fā)育成型，其可以自由進食；此時已經是入冬，水溫變化較不明顯，但相較于前期氣溫也有所降低，平均水溫為15℃，最低水溫13.8℃。這表明，在人工仿生態(tài)養(yǎng)殖場的環(huán)境下，大鯢胚胎發(fā)育時的環(huán)境溫度仍然處于逐漸降低的狀態(tài)。對同一場地來源的中國大鯢進行的溫度（5℃、15℃、25℃）馴化實驗結果顯示，其適宜溫度在15℃左右，且生長發(fā)育狀況最好（趙春霖，2019）。歐陽力劍等（2014）研究不同溫度（15～23℃）對大鯢胚胎發(fā)育的影響，發(fā)現大鯢胚胎發(fā)育適宜的溫度為17～21℃，且孵化率在19℃±0.5℃時最高，達到93.5%，高于本研究觀測到的孵化率。因此，在推進中國大鯢的人工飼養(yǎng)繁育時，需要考慮不同原產地或不同支系適宜溫度的需求事宜。

洪雅縣大鯢繁育場的業(yè)主何孝云、楊洪才先生提供用于觀測中國大鯢早期個體發(fā)育的胚胎、觀測場地和食宿條件。謹此一并致謝！