趙月，張倩，李靜怡，陳桂蘭，曾博

（西南醫(yī)科大學(xué)心血管醫(yī)學(xué)研究所，醫(yī)學(xué)電生理學(xué)教育部重點實驗室，四川 瀘州 646000）

腎臟的主要功能是過濾血液、排泄廢物和調(diào)節(jié)體內(nèi)平衡（Gorriz&Martinez-Castelao，2012）。腎單位是尿生成的基本功能單位，每個人的腎臟大約有100萬個腎單位，每個腎單位由腎小體及腎小管系統(tǒng)組成，腎小體又由腎小球及腎小囊構(gòu)成，其中，腎小球作為腎臟的過濾單位，可以對血漿進行超濾，這一過程只允許水、葡萄糖、離子和含氮廢物等低分子量物質(zhì)從血液進入鮑曼氏空間，同時保留重要的蛋白（Barry.，2019）。腎小球由內(nèi)皮細胞、系膜細胞、鮑曼包膜壁層上皮細胞和足細胞4種細胞組成（Lu.，2019）。足細胞是腎小球中分化程度最高的細胞類型，在腎小球濾過屏障中起著至關(guān)重要的作用，這些細胞形態(tài)復(fù)雜，由細胞體、主要足突和次要足突組成，相鄰足突由狹縫隔膜連接，狹縫隔膜覆蓋在腎小球基底膜的外部，也是尿蛋白和腎病綜合征產(chǎn)生的最后屏障（Haraldsson.，2008）。因此，對濾過屏障的破壞，特別是對足細胞的破壞，是許多慢性腎臟疾病的標志，慢性腎臟疾病最終發(fā)展成局灶性節(jié)段性腎 小 球 硬 化（focal segmental glomerulosclerosis，F(xiàn)SGS）（Sang.，2020）。FSGS是研究足細胞病和蛋白尿最廣泛使用的疾病模型之一（Bose&Cattran，2014）。蛋白尿與腎小球濾過率是慢性腎病的評估指標。蛋白尿是慢性腎病進展的有力標志，也是心血管死亡率增加的標志（Gorriz &Martinez-Castelao，2012）。

跨膜雙分子層磷脂不對稱是大多數(shù)生物膜的共同結(jié)構(gòu)特征（Daleke&Lyles，2000）。研究表明，含有膽堿的磷脂［磷脂酰膽堿（PC）和鞘磷脂（SM）］定位于質(zhì)膜的外層。相反，氨基磷脂［磷脂酰乙醇胺（PE）和磷脂酰絲氨酸（PS）］在這些膜的內(nèi)側(cè)富集。這種脂質(zhì)組織是由許多磷脂轉(zhuǎn)運體產(chǎn)生和維持的，其中，質(zhì)膜氨基磷脂翻轉(zhuǎn)酶能選擇性地將磷脂酰絲氨酸從質(zhì)膜的內(nèi)側(cè)運輸?shù)劫|(zhì)膜的外側(cè)（Yang.，2018）。PS翻轉(zhuǎn)酶的P4-ATPases是一組磷脂轉(zhuǎn)運體，是P型ATPases的一個亞家族。P4-ATPases產(chǎn)生并維持磷脂不對稱，在細胞膜穩(wěn)定性、囊泡運輸、血液凝固、細胞極性和遷移、凋亡細胞清除、細胞分裂、精子獲能和細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等方面發(fā)揮重要作用（Folmer.，2012）。

CDC50（又稱TMEM30）家族蛋白作為P4-ATPases的β亞基跨膜蛋白（除ATP9A和ATP9B外），通過異源二聚作用形成一個功能性磷脂轉(zhuǎn)運復(fù)合物對P4-ATPases的折疊和轉(zhuǎn)運起至關(guān)重要的作 用（Folmer.，2012；Yang.，2018）。CDC50A（又稱TMEM30A）是在小鼠中表達最豐富和最普遍的CDC50家族成員，它是一種末端糖基化糖蛋白，通過輔助磷脂翻轉(zhuǎn)酶將氨基磷脂（磷脂酰絲氨酸）從細胞質(zhì)膜外側(cè)翻轉(zhuǎn)至內(nèi)側(cè)，以維持細胞內(nèi)外磷脂的不對稱分布，調(diào)節(jié)細胞存活和亞細胞結(jié)構(gòu)的定位，對維持多種生理系統(tǒng)的正常功能至關(guān)重要（Yang F.，2019）。此前研究報道，CDC50A缺失會導(dǎo)致磷脂酰絲氨酸暴露于細胞外，作為凋亡信號引起細胞凋亡，從而引起一系列疾?。涸谝暰W(wǎng)膜中，視桿雙極細胞表現(xiàn)為反應(yīng)性膠質(zhì)增生、膠質(zhì)纖維酸性蛋白和CD68表達增加，光敏視網(wǎng)膜電圖反應(yīng)的缺失、錐視蛋白的錯誤定位及視錐細胞的缺失（Zhang.，2017；Yang F.，2019）。在小腦中，CDC50A缺失可導(dǎo)致早發(fā)型共濟失調(diào)和小腦萎縮（Yang.，2018）；在肝臟中，CDC50A缺失會損害小鼠胎兒肝的紅細胞生成，通過影響膽汁鹽轉(zhuǎn)運體的正常表達和定位，導(dǎo)致肝內(nèi)膽汁淤積（Liu.，2017；Yang Y.，2019）；在造血系統(tǒng)中，CDC50A對造血細胞和白細胞的存活至關(guān)重要（Li.，2018）；在胰腺中，CDC50A缺失會影響胰島素分泌和葡萄糖敏感性，從而導(dǎo)致葡萄糖刺激胰島素分泌受損（Yang.，2021）。CDC50A在重要器官中均有表達并維持著重要的生理功能（Folmer.，2012；Zhang.，2017；Stevens&Oltean，2018）。

腎臟作為人體最主要的代謝器官之一，行使著一系列的細胞內(nèi)外運輸功能，本研究推測基因在這些過程中也發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。本研究通過構(gòu)建一個足細胞特異性基因敲除（cKO）模型來闡明CDC50A在腎小球中的作用。實驗結(jié)果顯示，敲除小鼠的腎小球濾過率降低，濾過屏障功能嚴重受損，出現(xiàn)蛋白尿和FSGS。這種全新的腎小球硬化癥小鼠模型表明，CDC50A在維持足細胞存活和腎小球濾過屏障完整性方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。

1 材料與方法

1.1 材料

2.5P-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠購自美國Jackson Laboratory，轉(zhuǎn)基因小鼠由四川省人民醫(yī)院朱獻軍教授提供。所有動物實驗經(jīng)西南醫(yī)科大學(xué)實驗動物倫理委員會審核批準，在醫(yī)學(xué)電生理學(xué)教育部重點實驗室開展［實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（川）2018-17，實驗動物使用許可證號：SCXK（川）2018-065］。所有動物實驗均按照批準的方案和相關(guān)指南進行。小鼠在西南醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心SPF動物房繁育，飼養(yǎng)過程中給予充足的飲水和飼料，光周期為12 h光照/12 h黑暗。

為了獲得足細胞特異性基因敲除小鼠，本研究將基因中攜帶有flox序列的條件性敲除（）小鼠與足細胞中表達Cre重組酶（2.5P-Cre）的轉(zhuǎn)基因小鼠雜交，獲得基因型為2.5P-Cre/小鼠，Cre陽性雜合子后代與小鼠進行雜交獲得基因型為2.5PCre/（cKO）小鼠，同時選擇小鼠作為對照組。

動物基因組DNA快速抽提試劑盒、一步法TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，2×Es Taq MasterMix購自康為世紀生物科技有限公司，F(xiàn)ITC-Sinistrin示蹤劑購自華東醫(yī)藥股份有限公司，小鼠基因型鑒定引物由北京擎科生物科技有限公司成都分公司合成，麻醉藥物異氟烷由西南醫(yī)科大學(xué)統(tǒng)一訂購分配使用。

1.2 方法

1.2.1 腎小球特異性基因敲除小鼠模型研究使用的2.5P-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠為人NPHS2啟動子驅(qū)動的足細胞特異性Cre重組酶表達小鼠，基因條件性敲除小鼠是在目的DNA片段兩側(cè)插入2個同方向的LoxP位點。當(dāng)其與2.5P-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠交配后，在腎小球足細胞中表達的Cre重組酶對2個LoxP位點進行剪切和重組，導(dǎo)致靶基因被敲除。

2種轉(zhuǎn)基因小鼠及其雜交后代的基因型鑒定使用2.5P-Cre特異性引物（2.5P-F：TGCCACGACCAAGTGACAGCAATG，2.5P-R：ACCAGAGACGCAAATCCATCGCTC，目的條帶大?。?00 bp）和特異性引物（Cdc50a-F：ATTCCCCTCAAGATAGCTAC，Cdc50a-R：AATGATCAACTGTAATTCCCC，目的條帶大小：245 bp；WT：179 bp）對鼠尾DNA進行PCR擴增，根據(jù)產(chǎn)物電泳結(jié)果判斷基因型。鼠尾DNA提取采用動物基因組DNA快速抽提試劑盒，取鼠尾（0.5～1 mm）于50 μL DNA Extraction Solution及2 μL Enzyme Mix混合溶液中，55℃金屬浴30 min，95℃金屬浴15 min，冷卻后加入50 μL Stop Solution混勻震蕩離心，用作PCR模板。PCR體系（20 μL）：ddHO 7 μL，引物各1 μL，DNA 1 μL，2×Es Taq MasterMix 10 μL。PCR程序：95℃2 min；94℃20 s，53℃/55℃20 s，72℃20 s，35個循環(huán)；72℃1 min，10℃保存。產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳分離后成像分析。

抓取小鼠背頸部將小鼠提起，當(dāng)小鼠應(yīng)激時會流出尿液，用EP管接取隨機尿，操作過程中避免糞便掉落EP管中污染尿液，尿液采集后-80℃保存，避免尿蛋白降解，多次收集至500 μL，3 000 r·min，離心10 min，收集上清液送至西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院檢驗科進行尿蛋白、肌酐及尿電解質(zhì)檢測。

腎小球濾過率（glomerular filtration rate，GFR）指單位時間內(nèi)（每分鐘）兩側(cè)腎生成的超濾液量，是衡量腎功能的重要指標之一。在實驗前一天，用電動剃毛刀和脫毛膏將小鼠一側(cè)從大腿上部至頸部進行脫毛至皮膚裸露，需要避開脊柱。用生理鹽水配置FITC-Sinistrin熒光示蹤劑溶液，配置濃度為35 mg·mL，配置后的溶液-20℃避光保存。FITC-Sinistrin示蹤劑劑量為7 mg/100 g體質(zhì)量。連接檢測儀和電源，藍色LED燈閃爍即接通電源，大約10 s后開始采集并存儲數(shù)據(jù)，之前的存儲在設(shè)備上的數(shù)據(jù)將在本次接通電源后自動刪除。將檢測儀上的LED燈與貼片透明窗口精準對接并粘貼在小鼠裸露皮膚上，同時用膠帶固定。記錄背景信號2～3 min，將小鼠進行異氟烷麻醉后靜脈注射FITC-Sinistrin熒光示蹤劑，測量期間小鼠放置在單獨籠中，盡量保持安靜，檢測時間60～90 min后，把檢測儀從小鼠身上取下進行數(shù)據(jù)讀取和分析。

小鼠麻醉稱重后迅速剖檢，取雙側(cè)腎臟，PBS緩沖液洗滌血液并用干紙吸取水分，稱定質(zhì)量，計算腎臟指數(shù)=腎臟質(zhì)量/體質(zhì)量。

腎臟組織用10%中性甲醛固定24 h，沖洗，脫水，石蠟包埋后切片。進行PAS、HE染色，在光鏡下觀察腎臟組織病理變化。

使用一步法TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒對腎臟石蠟切片進行TUNEL檢測：（1）二甲苯中脫蠟5～10 min。換用新鮮的二甲苯，再脫蠟5～10 min，無水乙醇5 min，90%乙醇2 min，70%乙醇2 min，蒸餾水2 min。（2）滴加20 μg·mL不含DNase的蛋白酶K，室溫下作用10 min，37℃孵育1 h。（3）PBS緩沖液洗滌3次，每次15 min。（4）滴加TUNEL檢測液（1個樣本：TdT酶5 μL+熒光標記液45 μL+TUNEL檢測液50 μL），37℃孵育60 min，PBS緩沖液洗滌3次，每次15 min。（5）滴加熒光淬滅劑封片后在顯微鏡下觀察和采集圖像。

數(shù)據(jù)集采用Shapiro-Wilk檢驗正態(tài)分布。若符合正態(tài)分布，通過Student’s-test或ANOVA確定統(tǒng)計顯著性；反之，則使用非參數(shù)統(tǒng)計量計算。所有數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 7處理。顯著性水平設(shè)置為α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 雜交小鼠基因型

利用Cre-LoxP技術(shù)將2.5P-Cre小鼠和基因敲除小鼠進行雜交，獲得基因型2.5P-Cre/（cKO組）及2.5P-Cre/（對照組）小鼠（圖1）。

圖1 轉(zhuǎn)基因小鼠基因型PCR鑒定結(jié)果Fig.1 PCR genotyping of transgenic mice

2.2 cKO小鼠尿液表型特征

cKO組與對照組小鼠出生時的比例符合孟德爾定律，cKO組小鼠未見明顯形態(tài)異常，但從出生后2.5個月開始，其蛋白尿水平比對照組小鼠顯著增加，出生后3.5個月，蛋白尿水平繼續(xù)上升（圖2：A～C）。出生后2.5個月，2組的腎臟指數(shù)間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（圖2：D）。此外，3月齡小鼠的尿電解質(zhì)在組間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（圖2：E～I）。

圖2 Cdc50a基因敲除小鼠尿液表型特征Fig.2 Phenotypic characteristics of urine in Cdc50a gene knock-out mice

2.3 cKO小鼠腎小球濾過率變化表征

與對照組相比，cKO組小鼠的GFR從出生后2.5個月明顯降低，并且在3.5個月時降低情況依舊保持（圖3）。

圖3 Cdc50a基因敲除小鼠腎小球濾過率特征Fig.3 Characterization of glomerular filtration rate in Cdc50a gene knock-out mice

2.4 cKO小鼠足細胞凋亡情況

TUNEL檢測結(jié)果顯示，腎小球凋亡情況在1.5月齡小鼠間無顯著性差異，而2.5月齡cKO組小鼠足細胞陽性標記數(shù)量顯著增加，3.5月齡小鼠在組間有顯著性差異（圖4）。

圖4 Cdc50a基因敲除小鼠足細胞凋亡情況（TUNEL染色）Fig.4 Apoptosis of podocytes in Cdc50a gene knock-out mice（TUNEL staining）

2.5 cKO小鼠腎臟損傷情況

對1.5月齡、2.5月齡和3.5月齡的cKO組及同窩對照組小鼠的腎臟石蠟切片通過光鏡分析以評估病理變化。腎臟切片的HE染色和PAS染色均顯示2組小鼠無顯著差異，主要腎臟變化證實與腎小球有關(guān)（圖5：A）。1.5月齡時足細胞中基因敲除對腎臟大小及形態(tài)沒有影響。而在2.5月齡基因敲除的小鼠中，組織學(xué)分析顯示，除了節(jié)段性系膜增生及包膜粘連外，部分腎小球出現(xiàn)硬化表征（圖5：B）。3.5月齡時，腎小球硬化加重（圖5：C），并伴有不同程度的足細胞變形和丟失，這與腎小球濾過率結(jié)果一致。

圖5 Cdc50a基因敲除小鼠腎臟損傷情況Fig.5 Kidney injury in Cdc50a gene knock-out mice

3 討論

足細胞損傷在多種腎臟疾病進展中被認定為獨立的風(fēng)險因素，也是導(dǎo)致腎小球硬化的起始因素，如DN、IgAN和FSGS（Lu.，2019；Sang.，2020）。足細胞在健康狀態(tài)下正常維持穩(wěn)態(tài)，遇到生理壓力或病理刺激時，則會發(fā)生代償性反應(yīng)以保持功能，如通過合成腎小球基底膜的成分來維持腎小球濾過屏障；形成狹縫以及相互作用確保內(nèi)皮細胞的活力。當(dāng)刺激強度超過其代償性作用，則會發(fā)生病理性損傷，如蛋白尿、節(jié)段性腎小球纖維化、腎小球基底膜增厚，最終導(dǎo)致腎小球硬化（Coresh.，2014）。

蛋白尿是足細胞損傷的早期結(jié)果，也是腎病的典型征象。基底膜細胞、肌動蛋白細胞骨架和細胞黏附分子形成了一個緊密的網(wǎng)絡(luò)來穩(wěn)定過濾屏障功能，這些成分的缺陷使得蛋白尿得以存在（Lu.，2019）。本研究發(fā)現(xiàn)cKO小鼠在2.5月齡時出現(xiàn)蛋白尿，并且與同窩對照小鼠相比有統(tǒng)計學(xué)差異（＜0.05），表明腎小球足細胞出現(xiàn)損傷和丟失；同時與同窩對照小鼠相比，2.5月齡cKO小鼠的腎臟指數(shù)出現(xiàn)統(tǒng)計學(xué)差異，猜測腎小球濾過屏障受損可能使腎臟發(fā)生代償性增生，并且隨受損程度的增加而增加。此外，GFR檢測結(jié)果也與此前動物實驗研究中單腎單位水平的超濾是蛋白尿和腎小球硬化的危險因素結(jié)果一致（Brenner.，1996）。

PS翻轉(zhuǎn)酶的β亞基CDC50A對于維持質(zhì)膜磷脂的不對稱分布以確保細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)至關(guān)重要（Daleke.，2000；Dhar.，2004；Ruggenenti & Remuzzi，2006；Turin.，2013；Liu.，2017），本研究小鼠腎臟石蠟切片的TUNEL染色顯示，足細胞在2.5月齡時開始出現(xiàn)凋亡。這也證實了CDC50A敲除后，質(zhì)膜上的PS暴露作為凋亡信號導(dǎo)致足細胞發(fā)生凋亡。此外，腎臟切片HE和PAS染色結(jié)果均顯示，基因缺失會造成腎損傷，且損傷程度隨月齡的增加進一步加重，直至可能發(fā)生腎衰竭。

CDC50A對于腦、肝臟、胰腺等重要器官的存活和功能發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。本研究揭示了CDC50A在維持腎小球濾過屏障完整性方面的新作用。足細胞基因缺失致使足細胞變性，導(dǎo)致蛋白尿、GRF降低、系膜細胞增殖、系膜基質(zhì)堆積、足細胞損傷和丟失、節(jié)段性腎小球纖維化，最終導(dǎo)致自發(fā)性腎小球硬化等一系列病理表型改變。這為理解足細胞損傷機制提供了另一種獨特的視角，同時也構(gòu)建了一種全新的自發(fā)性腎小球硬化癥小鼠模型。