馮佳慧，龔治忠，許娜，劉剛

（安徽醫(yī)科大學生命科學學院，合肥 230032）

動物腸道是一個獨特的微生態(tài)系統(tǒng)，腸道微生物群落極其豐富，主要包括細菌、真菌、病毒和原生動物等在內(nèi)的多種生物，它們在宿主的生命活動中發(fā)揮重要作用，成為維持動物健康的一個重要“器官”，并與宿主構(gòu)成共生關(guān)系的“腸道微生態(tài)系統(tǒng)”（Lv，2021）。腸道菌群與宿主的健康密切相關(guān)，能夠起到促進宿主消化、營養(yǎng)吸收、維生素合成、免疫調(diào)節(jié)和調(diào)節(jié)宿主的腸道形態(tài)等作用（B?ckhed，2004；Eberl & Boneca，2010；Kau，2011；Stanley，2012；Mcfall-Ngai，2013）。腸道菌群具有高度的可塑性，主要受遺傳和環(huán)境的影響（Chen，2017）。宿主的遺傳差異是腸道內(nèi)群落組成和結(jié)構(gòu)差異的主要因素，宿主出生時由親代遺傳完整微生物菌群，使親緣關(guān)系較近的物種的腸道菌群更為相似；此外，動物腸道菌群的組成也受到食物資源、環(huán)境微生物群落、行為習性等外界因素的影響（Eckburg，2005；Nicholson，2012；Hird，2014；Yang，2016；Zhang，2021）。同域生活的物種可以通過共同覓食、身體接觸、飲水和棲息環(huán)境達到腸道菌群的交互傳播（Groussin，2017；Veelen，2017；Liddicoat，2020）。

鳥類是一些疾病的天然宿主和中間傳播媒介，由于具有極強的地理擴散能力和廣泛的分布范圍，鳥類為人禽共患疾病的傳播帶來了潛在風險，其攜帶的細菌、病毒和寄生蟲等病原體可以傳播給其他動物甚至人類，從而引發(fā)一系列疾病。作為人禽共患病的重要宿主及傳播媒介，候鳥和家禽在一些流行性疾病的發(fā)生和傳播中扮演著重要的角色（Dewar，2013；Wilkinson，2017；Dong，2019）。長距離遷徙水鳥更是多種疾病的重要傳播載體，近年來，隨著人為干擾的加劇和棲息地的喪失，候鳥越冬湖泊濕地生態(tài)受到嚴重干擾，迫使部分越冬種群集中在更小的適宜棲息地中，其種群面臨疾病暴發(fā)的風險增加（Karmiris，2017）。多種禽源疾病的發(fā)生和傳播與候鳥遷徙線路上的飼養(yǎng)家禽有著密切的關(guān)系，在候鳥越冬地濕地周邊，經(jīng)常出現(xiàn)飼養(yǎng)家禽和候鳥在相同的水域混群覓食的現(xiàn)象，候鳥的取食、飲水和排泄糞便等行為能夠污染環(huán)境中的水源和土壤等，這些污染物通過各種途徑在與之接觸的密集型飼養(yǎng)的家禽中暴發(fā)；同樣，家禽體內(nèi)的病原體也可以傳播給候鳥，這種混群行為增加病原體在家禽、候鳥之間的暴發(fā)和傳播幾率，并形成不斷循環(huán)的雙向傳播模式，造成病原體在“候鳥-家禽-候鳥-家禽”的反復傳播鏈（Grond，2014；Gibb，2020；Lycett，2020）。腸道病原體不但可以感染野生鳥類和養(yǎng)殖家禽，而且具有感染哺乳動物和人的能力，對人類的威脅也在不斷增加，因此研究遷徙水鳥及同域飼養(yǎng)家禽的腸道菌群具有重要的流行病學和公共衛(wèi)生意義（Gibb，2020）。

長江中下游地區(qū)的升金湖（116.92°～117.25°E，30.25°～30.50°N）及其密切相連的江河共同構(gòu)成的復合濕地生態(tài)系統(tǒng)孕育了豐富的水生生物資源，是水鳥在“東亞-澳大利西亞”遷徙路線上重要的遷徙停歇地和越冬地，支持了全球具有重要意義的數(shù)十萬只越冬水鳥（Chen，2011；Wang，2015）。升金湖濕地也是安徽省人口較為稠密的地區(qū)之一，隨著經(jīng)濟發(fā)展，濕地資源的利用強度逐步加大，人為擾動不斷增強，濕地生態(tài)受到嚴重干擾（Peng，2019）。同時，該地區(qū)農(nóng)業(yè)和飼養(yǎng)業(yè)占比較大，大量越冬水鳥在食物不足時，不得不遷至湖區(qū)周邊的農(nóng)田中覓食，農(nóng)田又是家禽放養(yǎng)場所，覓食的候鳥經(jīng)常與放養(yǎng)的家禽發(fā)生接觸，為候鳥和家禽之間的腸道病原體傳播提供了條件，極大增加了疾病的暴發(fā)和傳播風險，也給人類帶來潛在的公共衛(wèi)生風險，因此，開展人口密集聚集區(qū)腸道病原體在遷徙鳥類和家禽之間傳播規(guī)律的研究顯得更為重要和迫切（Risely，2017；Ramey& Reeves，2020）。小白額雁是一種長距離遷徙水鳥和重要的濕地指示物種，隸屬于雁形目Anserformes鴨科Anatidae，主要在歐洲、西伯利亞等地的極北部繁殖，在日本、中國和韓國越冬（Zhang.，2011）。本文擬采集升金湖越冬小白額雁和同域家鴨的糞便樣品，通過16S rRNA V3-V4區(qū)域的高通量測序技術(shù)，比較兩者腸道菌群的組成、結(jié)構(gòu)和功能，揭示越冬水鳥和同域家禽腸道菌群病原體的傳播規(guī)律，為預防人禽共患病提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2018年12月在升金湖濕地采集糞便樣品。采集前，使用望遠鏡觀察覓食的小白額雁雁群，確定周圍沒有其他鳥群活動并且選擇超過150只雁群采集樣品。為了避免采樣過程中的樣本重復，每個糞便樣品間隔5 m以上，去除表面泥土等雜質(zhì)以避免人為干擾和泥土接觸，樣品放入50 mL無菌離心管，-20℃保存。散養(yǎng)家鴨的糞便樣品采集于淺灘，方法相同。共采集30份：小白額雁和家鴨各15份。

1.2 PCR擴增和高通量測序

選擇343F（5’-TACGGRAGGCAGCAG-3’）和798R（5’-AGGGTATCTAATCCT-3’）對腸道細菌16S rRNA V3-V4區(qū)進行擴增。PCR擴增為30 μL反應體系：2×Gflex PCR Buffer 15 μL，正、反向引物（20 mmol·L）各0.5 μL，DNA模板50 ng，Tks Gflex DNA Polymerase 0.6 μL，ddHO補齊。PCR擴增反應條件：94℃5 min；94℃30 s，56℃30 s，72℃20 s，26個循環(huán)；72℃5 min。第一次PCR反應的產(chǎn)物用作第二次PCR的模板，第二次PCR擴增體系：2×Gflex PCR Buffer 15 μL，1.25 U·μL的Tks Gflex DNA Polymerase 0.6 μL，adapter I5和adapter I7各1 μL，第一次PCR產(chǎn)物50 ng，添加ddHO至30 μL。第二次PCR反應程序與第一次PCR相同，PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，送上海歐易生物醫(yī)學科技有限公司，利用Illumina Hiseq platform（PE250）測序。

1.3 生物信息學和統(tǒng)計分析

2 結(jié)果

2.1 物種鑒定和Alpha多樣性分析

利用糞便樣品DNA提取試劑盒（MagPure Soil DNA KF Kit）提取越冬小白額雁和同域家鴨的30份糞便樣品的總DNA，選擇細胞色素氧化酶亞基（）基因的引物（上游引物：5’-TTCTCCACCACAAAGACATTGGCAC-3’，下游引物：5’-ACGTGGGAGATAATTCCAAATCCTG-3’）進 行PCR擴增，擴增產(chǎn)物測序結(jié)果通過GenBank數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/）進行比對分析，結(jié)果顯示采集的糞便樣品為小白額雁或家鴨。對越冬小白額雁和同域家鴨的30份糞便樣品進行測序，共得到1 907 023條有效序列，平均每個樣品有62 567條，序列長度在403～413 bp之間。將有效序列基于97%相似度歸類為5 879個細菌OTUs，其中，越冬小白額雁腸道菌群的OTU數(shù)目是4 919個，同域家鴨腸道菌群的是4 359個，兩者共享3 378個（57.5%）。Alpha多樣性指數(shù)結(jié)果表明，Chao 1指數(shù)顯示小白額雁腸道菌群的豐富度高于同 域 家 鴨，且 具 有 顯 著 性 差 異（＜0.05），而Shannon-Wiener指數(shù)和Simpson指數(shù)顯示小白額雁和同域家鴨腸道菌群的多樣性無顯著差異（＞0.05；圖1）。

圖1 升金湖越冬小白額雁和同域家鴨腸道菌群多樣性指數(shù)Fig.1 Diversity indices of gut bacteria from wintering Anser erythropus and sympatric Anas platyrhynchos domesticus in Shengjin Lake

2.2 腸道菌群組成分析

越冬小白額雁和家鴨的30份糞便樣品中的菌群共檢測出50門71綱764屬：門級水平上，優(yōu)勢菌群主要有厚壁菌門Firmicutes（47.32%和54.14%）、擬桿菌門Bacteroidetes（24.66%和15.65%）、變形菌門Proteobacteria（16.90%和19.04%）和放線菌門Actinobacteria（3.97%和2.89%）（圖2）；綱級水平上，小白額雁腸道菌群中的擬桿菌門和放線菌門豐度高于家鴨，而家鴨腸道菌群中的厚壁菌門和線菌門相對豐度較高，優(yōu)勢菌群為梭菌綱Clostridia、擬桿菌綱Bacteroidia、γ-變形菌綱Gammaproteobacteria、芽孢桿菌綱Bacilli和α-變形菌綱Alphaproteobacteria等，其中，擬桿菌綱和芽孢桿菌綱在越冬小白額雁和同域家鴨腸道中具有顯著性差異（=0.000 2和=0.036）；屬級水平上，優(yōu)勢菌群為土孢桿菌屬、擬桿菌屬、乳桿菌屬、羅姆布茨菌屬和糞桿菌屬等，其中，擬桿菌屬、乳桿菌屬、羅姆布茨菌屬和糞桿菌屬具有顯著性差異（=0.019、=0.013、=0.000 26和=0.000 012）。

圖2 升金湖越冬小白額雁和同域家鴨腸道菌群的組成Fig.2 Composition of gut bacteria in wintering Anser erythropus and sympatric Anas platyrhynchos domesticus in Shengjin Lake

LEfSe分析結(jié)果表明，越冬小白額雁腸道菌群中的擬桿菌目Bacteroidales、擬桿菌綱、普雷沃氏菌科Prevotellaceae、毛螺菌科Lachinospiraceae和瘤胃菌科Ruminococcaceae相對豐度較高，而家鴨腸道菌群中的芽孢桿菌目Bacillales、腸桿菌目Enterobacteriales、動球菌科Planococcaceae、梭菌科Clostridiaceae_1、消化鏈球菌科Peptostreptococcaceae和腸桿菌科Enterobacteriaceae相對豐度較高（圖3：A）。PCoA結(jié)果顯示，樣品在兩者間呈現(xiàn)不規(guī)則分布的狀態(tài)（圖3：B）。

圖3 升金湖越冬小白額雁和同域家鴨腸道菌群的LEfSe分析（A）和PCoA分析（B）Fig.3 LEfSe analysis（A）and principal co-ordinates analysis（B）of the gut bacteria from wintering Anser erythropus and sympatric Anas platyrhynchos domesticus in Shengjin Lake

2.3 PICRUSt分析

2個物種腸道菌群的功能預測譜共911個COG通路。越冬小白額雁和同域家鴨的主要功能譜是代謝（37.21%）及遺傳信息的傳遞和表達（24.12%）。代謝包括氨基酸的轉(zhuǎn)運與代謝（8.05%），碳水化合物的轉(zhuǎn)運與代謝（7.65%），能量的生產(chǎn)與轉(zhuǎn)換（5.61%），無機離子的轉(zhuǎn)運與代謝（4.76%），輔酶的轉(zhuǎn)運與代謝（4.02%），脂質(zhì)的轉(zhuǎn)運與代謝（2.86%），核苷酸的轉(zhuǎn)運與代謝（2.64%）和次生代謝產(chǎn)物的合成、轉(zhuǎn)運與分解代謝（1.63%）。遺傳物質(zhì)的傳遞和表達包括轉(zhuǎn)錄（8.57%），復制、重組與修復（6.41%），翻譯、核糖體的結(jié)構(gòu)與生物發(fā)生（5.85%）和翻譯后修飾與蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運（3.29%）。

2.4 潛在腸道病原細菌分析

在小白額雁和同域家鴨的腸道菌群中，潛在的致病菌有脆弱擬桿菌、產(chǎn)堿假單胞菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、舍氏小螺菌、犬螺桿菌和綠膿桿菌，其中豐富度最高的潛在致病菌種是脆弱擬桿菌。單因素方差分析結(jié)果顯示，小白額雁和同域家鴨腸道病原菌有顯著差異的是脆弱擬桿菌（表1）。

表1 越冬小白額雁和同域家鴨潛在腸道致病細菌Table 1 Potential pathogens in the gut of Anser erythropus and Anas platyrhynchos domesticus

3 討論

不同物種腸道微生物受宿主遺傳背景和棲息環(huán)境等多種因素的影響而存在一定的差異性，鳥類復雜的生活史特征使其腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)具有高度的多樣性（Eckburg，2005；Yang，2016；Zhang，2021）。本研究中，越冬小白額雁和同域家鴨腸道菌群Alpha多樣性（除Chao1指數(shù)以外）和PCoA分析結(jié)果表明，小白額雁和同域家鴨具有相似的腸道菌群群落結(jié)構(gòu)。一方面可能由于小白額雁和家鴨都隸屬于鴨科，親緣關(guān)系相近；另一方面食物也可能是影響腸道微生物群落結(jié)構(gòu)的重要因素，升金湖越冬小白額雁主要以苔草spp.、禾本科Poaceae植物和地下塊莖為食，生活在該區(qū)域的散養(yǎng)家鴨除飼料外，在野外覓食時也采食以上食物（Wang，2012）。此外，隨著經(jīng)濟的發(fā)展和人類農(nóng)業(yè)活動的增加，人為干擾使越冬小白額雁從原來的湖灘轉(zhuǎn)移到附近的農(nóng)田覓食，會與散養(yǎng)的家鴨發(fā)生密切接觸，致使越冬小白額雁和散養(yǎng)家鴨可以通過身體直接接觸、飲水和土壤等介質(zhì)進行交互傳播（Karmiris.，2017；Perofsky.，2019；Liddicoat.，2020）。受樣本數(shù)量和環(huán)境微生物數(shù)據(jù)缺乏的限制，后期仍需要深入研究（Groussin.，2017）。

越冬小白額雁和同域家鴨的優(yōu)勢腸道菌群均為厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門和放線菌門，這4種細菌類群也是鳥類腸道的核心菌群（Kohl，2012；David& Taylor，2015；Kohl，2016）；與之前報道的升金湖其他水鳥，如白頭鶴、豆雁和白額雁等的優(yōu)勢菌群相同，但這4種優(yōu)勢菌群的豐富度與上述越冬水鳥有所差別（Yang，2016；Dong.，2019）。鳥類腸道中的細菌與宿主的食物消化、能量代謝和免疫調(diào)節(jié)密切相關(guān)。厚壁菌門能夠幫助宿主吸收食物中的碳水化合物、多糖和脂肪酸等營養(yǎng)物質(zhì)（Flint，2008）；變形菌門能夠促進能量的積累（Worthmann，2017）；擬桿菌門不僅能降解宿主中的蛋白質(zhì)和多糖，在體外還能夠減少脂多糖引發(fā)的炎癥（Kim & Milner，2007；Thomas，2011；Wexler&Goodman，2017）；而放線菌能夠產(chǎn)生胞外酶和次生代謝物促進宿主的健康（Ventura，2007）。苔草、禾本科植物和地下塊莖中的纖維素和多糖是小白額雁和家鴨的主要營養(yǎng)來源，與其他水鳥一樣，越冬小白額雁攝取這些高淀粉和高纖維素含量的食物可能導致腸道中厚壁菌門的相對含量升高。越冬小白額雁腸道中較高豐度的變形菌門可能有助于促進能量的代謝和積累，為其越冬提供能量（Lu & Domingo，2008）。小白額雁腸道菌群最豐富的代謝功能類別包括氨基酸代謝、碳水化合物代謝、無機離子代謝、輔酶代謝、脂質(zhì)代謝和核苷酸代謝，這些代謝可能與小白額雁在越冬期面臨的殘酷環(huán)境密切相關(guān)，推測可能與為越冬期小白額雁的覓食、飛翔等行為保證足夠的能量有關(guān)（Wang，2019）。

候鳥和飼養(yǎng)家禽在疾病的傳播中起著重要的作用，長距離遷徙水鳥攜帶的潛在腸道病原體在疾病的暴發(fā)和傳播中發(fā)揮著重要作用（Viana，2016）。近年來，升金湖濕地周邊出現(xiàn)大量散養(yǎng)家禽與越冬候鳥在相同水域或灘涂混群覓食的現(xiàn)象，通過身體接觸或空氣、水、土壤和食物等媒介相互傳播，致使越冬候鳥和飼養(yǎng)家禽攜帶的病原體存在交互感染的風險，從而形成不斷循環(huán)的傳播模式，造成病原體在“野鳥-家禽-野鳥-家禽”的反復傳播鏈。越冬小白額雁和飼養(yǎng)家鴨腸道微生物群落中含有多種影響健康的潛在病原菌，本研究在小白額雁和家鴨的腸道內(nèi)共發(fā)現(xiàn)6種潛在致病菌，進一步分析表明，除了脆弱擬桿菌外，其余潛在病原菌的多樣性差異均無顯著性。產(chǎn)氣莢膜梭菌隸屬于梭菌屬，是重要的人獸共患病原體，能夠造成氣性壞疽和食物中毒；而脆弱擬桿菌也能夠分泌脆弱擬桿菌毒素造成結(jié)腸炎，產(chǎn)堿假單胞菌可以使宿主出現(xiàn)膿毒性關(guān)節(jié)炎和滑膜炎（Sears，2001；Dutkiewicz，2016；Ohtani &Shimizu，2016）。感染舍氏小螺菌的宿主可能突然發(fā)生高熱、寒戰(zhàn)；犬螺桿菌感染會引起胃炎、消化道潰瘍；綠膿桿菌廣泛分布于自然界及正常人皮膚、腸道和呼吸道，是臨床上較常見的條件致病菌之一，能夠引起繼發(fā)感染（Foley，1999；Gellatly & Hancock，2013；Herp，2021）。升金湖濕地周邊人口稠密，越冬水鳥和家禽攜帶病原細菌可能對其他動物甚至人類帶來潛在致病風險，極大增加了疾病的暴發(fā)和傳播風險，也給人類帶來潛在的公共衛(wèi)生風險，因此，本研究結(jié)果對于疾病防控具有重要意義，后期還需進一步研究越冬小白額雁和同域家鴨腸道菌群及其生活環(huán)境間的微生物傳播及影響機制。