高迎吉，朱中蛟，楊秀玲

（1.臨沂市人民醫(yī)院脊柱外科，山東臨沂 276002；2.滕州市中心醫(yī)院脊柱外科，山東滕州 277599；3.山東大學齊魯醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，山東濟南 250012）

急性創(chuàng)傷性脊髓損傷（acute spinal cord injury,ASCI）是一種突發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)創(chuàng)傷，可導致脊髓中血管破裂，神經(jīng)元迅速死亡[1]。神經(jīng)炎癥是ASCI 重要的病理生理機制，其中小膠質細胞（Microglia, MG）發(fā)揮重要作用，活化MG 中的M1 型可釋放炎癥因子，M2 型可釋放抑炎因子[2]。因此，促進ASCI 后M1 型MG 向M2 型轉化是改善預后的重要措施。有研究發(fā)現(xiàn)，microRNA-124（miR-124）特異性表達于MG 中，上調(diào)其表達可促進M1 型MG 向M2 型轉化，但裸露miR-124 易被降解，無法穩(wěn)定地在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮作用，故探究可完整遞送miRNA 的方式具有必要性[3]。外泌體（Exosomes,Exos）是一種由自體細胞分泌的納米級囊泡樣小體，通過轉運RNA、生物活性磷脂、蛋白質等參與細胞與內(nèi)環(huán)境的信號傳遞及物質運輸，已逐漸用于遞送載體、參與器官間聯(lián)系及組織穩(wěn)態(tài)維持[4]。本研究通過復制ASCI 大鼠模型，觀察Exos 源性miR-124 對其脊髓MG 活化及炎癥反應的影響，并探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞系、實驗動物人源胚胎腎（human emborynic kidney, HEK）239 細胞系購自南京森貝伽生物科技有限公司。SPF 級SD 大鼠35 只，6 周齡，體重（200±20）g，購自上海靈暢生物科技有限公司，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（滬）2018-0003，實驗動物使用許可證號：SYXK（滬）2022-0004。

1.1.2 主要試劑miR-124-mimics 過表達質粒（上海漢恒生物科技有限公司），LipofectamineTM3000 試劑盒（上海吉瑪制藥技術有限公司），Exos 提取試劑盒（上海貝博生物科技公司），兔抗人CD9、CD63 一抗，兔抗鼠核苷酸結合寡聚化結構域樣受體3（nucleotide-bindingoligomerizationdomain-like receptor 3, NLRP3）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1（Caspase-1）、P2X7 一抗、小鼠抗大鼠Iba-1、CD32、CD206 抗體（美國Abcam 公司），腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α, TNF-α）、白細胞介素-6（Interleukin-6, IL-6）、白細胞介素-8（interleukin-8,IL-8）酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay, ELISA）試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司）。

1.1.3 主要儀器StepOne Puls 實時熒光定量聚合酶鏈反應（quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR）儀（美國ABI 公司），JEM-2100Plus 透射電子顯微鏡（日本電子株式會社），Stat Fax-4200 酶標儀（美國Awareness 公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及轉染HEK239 細胞置于37℃、5%二氧化碳CO2、飽和濕度的DMEM 培養(yǎng)基中（含10%胎牛血清、L-谷氨酰胺、1%非必需氨基酸、青霉素100 u/mL、鏈霉素100 μg/mL）。取對數(shù)期HEK239 細胞，PBS 洗滌，按1×105個/mL 接種至6 孔板，待細胞再次融合達75%，分為空白組、轉染組?？瞻捉M不處理，轉染組按照LipofectamineTM3000 試劑盒說明書步驟，轉染miR-124-mimics 質粒。每組設置5 個復孔，每2 天更換1 次培養(yǎng)基，2～3 周后形成單克隆細胞系用于后續(xù)實驗。

1.2.2 qRT-PCR檢測轉染后細胞miR-124、Exos源性miR-124、脊髓組織miR-124的表達取空白組、轉染組細胞，用TRIzol 試劑提取總RNA，逆轉錄為cDNA，按照熒光定量試劑盒說明書操作，反應體系：雙倍核酸染料12 μL，正反向引物（10 μmol/L）各1 μL，模板cDNA 2 μL，補充dd H2O 至總體積20 μL。反應條件：90℃預變性10 min，94℃變性20 s，62℃退火30 s，72℃延伸25 s，共40 個循環(huán)。以U6為內(nèi)參基因，2-ΔΔCt為目的基因相對表達強度，引物序列見表1。取空白組、轉染組Exos，檢測Exos 源性miR-124 相對表達量。取冷凍保存的脊髓組織，眼科剪剪碎，PBS 勻漿，注入離心管內(nèi)，離心后取上清液，檢測脊髓組織中miR-124 相對表達量。

表1 qRT-PCR引物序列

1.2.3 分離含miR-124 的Exos 并鑒定DMEM 培養(yǎng)基（含10%胎牛血清）12 000 r/min 離心15 h，取上清液?？瞻捉M、轉染組細胞置于37℃、5% CO2、飽和濕度的DMEM 培養(yǎng)基中（含10%胎牛血清、1%青霉素）培養(yǎng)5 d。3 500 r/min 離心10 min，取上清液，采用Exos 提取試劑盒提取Exos，根據(jù)試劑盒說明書步驟進行操作。取Exos 10 μL，滴至載樣銅網(wǎng)并靜置2 min，去除浮液，1%磷鎢酸溶液染色5 min，去除染液，自然晾干，在透射電鏡下觀察其形態(tài)。

1.2.4 Western bloting 檢測空白組、轉染組Exos 膜表面特異性標志蛋白的表達和脊髓組織NLRP3、Caspase-1、P2X7 蛋白的表達取Exos 50 μL，加入裂解液50 μL（含蛋白酶抑制劑），4℃振蕩25 min。離心取上清液，BCA 蛋白定量試劑盒定量，加入上樣緩沖液，沸水浴變性5 min。每孔40 μg 上樣，電泳后濕轉至硝酸纖維素膜上，封閉液封閉2 h，加入兔抗人CD9、CD63 一抗（1∶500），4℃孵育過夜，洗滌，加入山羊抗兔二抗（1∶2 000），室溫孵育2 h，洗滌、曝光、顯影，凝膠成像系統(tǒng)分析，以CD9、CD63 與內(nèi)參GAPDH 的灰度值比值表示蛋白相對表達量。

取冷凍保存的脊髓組織，操作方法同上，加入兔抗大鼠NLRP3、Caspase-1、P2X7 一抗（1∶500），檢測脊髓組織NLRP3、Caspase-1、P2X7 蛋白相對表達量。

1.2.5 ASCI 大鼠模型的復制及分組腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉大鼠，保持其俯臥體位，將T10椎體作為中心行矢狀切口，顯露T9～T11椎板，去除T10椎板和韌帶，顯露硬脊膜。采用紐約大學脊髓損傷打擊器固定大鼠，將撞擊棒（直徑2.5 mm，重量10 g）從25 mm 位置自由下落撞擊脊髓，自撞擊棒下落到抬起時間間隔10 s。模型復制成功標準：脊髓被擊打后表面迅速淤血、水腫，擊打瞬間大鼠表現(xiàn)為后肢放射性迅速收回、抖動[5]。模型復制成功后清洗周圍組織，常規(guī)縫合、抗感染。

從35 只大鼠中隨機選取10 只僅咬除椎板顯露脊髓，不進行損傷處理，設為假手術組，其余25 只復制ASCI 模型，模型復制成功20 只，隨機分為ASCI 組、實驗組，每組10 只。模型復制成功后24 h，實驗組經(jīng)尾靜脈注射Exos 3×109個微粒（通過納米顆粒跟蹤分析儀Nanosight NS300 system 控制Exos量），假手術組及ASCI 組注射等量PBS 溶液[6]。

1.2.6 標本采集干預后3 d，頸椎脫臼法處死大鼠，于冰盤上迅速分離大鼠T9～T11節(jié)段脊髓，轉移至EP 管中封閉保存，取5 只大鼠的脊髓組織-80℃冷凍保存，用于miR-124 相對表達量、MG 占比、脊髓組織炎癥因子水平的檢測，另外5 只大鼠的脊髓組織分成兩份，一份固定于4%多聚甲醛24 h，另一份置入-80℃冰箱冷凍保存用于檢測蛋白相對表達量。

1.2.7 流式細胞術檢測脊髓組織MG 占比取脊髓組織，胰蛋白酶消化后離心，經(jīng)密度梯度離心法分離出單個核細胞，用10%胎牛血清重懸，在單核細胞懸液中加入小鼠抗大鼠Iba-1、CD32、CD206 抗體，避光孵育30 min，離心棄上清液，PBS 洗滌，1%多聚甲醛定容，300 目細胞濾網(wǎng)過濾，4℃遮光保存，以陰性對照管設門，采用多參數(shù)流式細胞術檢測定脊髓組織MG 中Iba-1＋/CD32＋、Iba-1＋/CD206＋占比。

1.2.8 ELISA 檢測脊髓組織TNF-α、IL-6、IL-8水平取冷凍保存的脊髓組織，勻漿后采用ELISA檢測TNF-α、IL-6、IL-8 水平，根據(jù)試劑盒說明書操作步驟，經(jīng)酶標儀測定570 nm 波長處吸光度值，畫出曲線，計算樣本濃度。

1.2.9 蘇木精-伊紅（Hematoxylin-eosin,HE）染色觀察脊髓組織病理學變化取脊髓組織切片，常規(guī)水化，沖洗，蘇木精染液染色5 min，沖洗，分化液分化，沖洗，藍化液反藍，伊紅染色2 min，漂洗，常規(guī)脫水、透明，滴入中性樹脂封固，顯微鏡下觀察脊髓組織病理學變化。

1.3 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，比較用t檢驗或方差分析，進一步兩兩比較用LSD-t檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 兩組細胞轉染后miR-124相對表達量比較

空白組與轉染組miR-124 相對表達量分別為（0.95±0.12）和（2.38±0.27），經(jīng)t檢驗，差異有統(tǒng)計學意義（t=10.822，P=0.000），轉染組高于空白組。

2.2 Exos形態(tài)

透射電鏡觀察結果顯示，Exos 膜結構完整，大小不一，大部分呈杯形或圓形，直徑30～100 nm，與Exos 特征相符。見圖1。

圖1 透射電鏡觀察Exos形態(tài) （×70 000）

2.3 含miR-124的Exos鑒定結果

空白組與轉染組CD9、CD63 蛋白及miR-124相對表達量的比較，經(jīng)t檢驗，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），轉染組CD9、CD63 蛋白及miR-124相對表達量升高。見表2 和圖2。

表2 兩組細胞CD9、CD63 蛋白、miR-124 相對表達量比較 （±s）

表2 兩組細胞CD9、CD63 蛋白、miR-124 相對表達量比較 （±s）

組別空白組轉染組t 值P 值CD9蛋白0.38±0.04 0.67±0.07 8.043 0.000 CD63蛋白0.32±0.04 0.61±0.08 7.250 0.000 miR-124 1.22±0.18 2.57±0.29 8.844 0.000

圖2 空白組、轉染組CD9、CD63蛋白的表達

2.4 3 組大鼠脊髓組織miR-124 相對表達量比較

假手術組、ASCI 組、實驗組大鼠脊髓組織miR-124 相對表達量分別為（1.02±0.17）、（1.04±0.15）、（2.10±0.34），經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=34.287，P=0.000）。進一步兩兩比較結果：與假手術組、ASCI 組比較，實驗組脊髓組織miR-124 相對表達量升高（P＜0.05）；假手術組與ASCI 組脊髓組織miR-124 相對表達量比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

2.5 3組大鼠脊髓組織MG占比比較

假手術組、ASCI 組、實驗組大鼠脊髓組織Iba-1＋/CD32＋、Iba-1＋/CD206＋占比比較，經(jīng)方差分析，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。進一步兩兩比較結果：與假手術組比較，ASCI 組脊髓組織Iba-1＋/CD32＋、Iba-1＋/CD206＋占比均升高（P＜0.05）；與ASCI 組比較，實驗組脊髓組織Iba-1＋/CD32＋占比降低（P＜0.05），Iba-1＋/CD206＋占比升高（P＜0.05）。見表3。

表3 3組大鼠脊髓組織MG占比比較 （n=5，%，±s）

表3 3組大鼠脊髓組織MG占比比較 （n=5，%，±s）

注：①與假手術組比較，P ＜0.05；②與ASCI組比較，P ＜0.05。

組別假手術組ASCI組實驗組F 值P 值Iba-1＋/CD206＋25.47±4.21 39.65±5.07①54.87±6.39②38.484 0.000 Iba-1＋/CD32＋20.19±3.57 44.28±5.31①29.36±4.92②34.039 0.000

2.6 3組大鼠脊髓組織TNF-α、IL-6、IL-8水平比較

假手術組、ASCI 組、實驗組大鼠脊髓組織TNFα、IL-6、IL-8 水平比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。進一步兩兩比較結果：與假手術組比較，ASCI 組脊髓組織TNF-α、IL-6、IL-8 水平升高（P＜0.05）；與ASCI 組比較，實驗組脊髓組織TNF-α、IL-6、IL-8 水平降低（P＜0.05）。見表4。

表4 3組大鼠脊髓組織TNF-α、IL-6、IL-8水平比較（n=5，±s）

表4 3組大鼠脊髓組織TNF-α、IL-6、IL-8水平比較（n=5，±s）

注：①與假手術組比較，P ＜0.05；②與ASCI組比較，P ＜0.05。

組別假手術組ASCI組實驗組F 值P 值IL-8/（ng/mL）79.63±10.25 156.38±19.64①129.97±16.69②29.643 0.000 TNF-α/（ng/mL）4.21±0.96 7.59±1.12①6.23±0.74②15.930 0.000 IL-6/（pg/mL）106.85±12.68 179.74±23.57①142.28±19.96②17.878 0.000

2.7 3組大鼠脊髓組織病理學改變

假手術組大鼠脊髓組織未觀察到明顯的炎癥細胞浸潤。ASCI 組可觀察到大量炎癥細胞浸潤，表現(xiàn)為典型的“血管袖套樣”，且部分炎癥細胞浸潤至腦實質中。實驗組血管周圍與腦實質中有炎癥細胞浸潤，但不及ASCI 組炎癥細胞數(shù)量多，程度較輕。見圖3。

圖3 3組大鼠脊髓組織病理切片 （HE染色×200）

2.8 3組大鼠脊髓組織NLRP3、Caspase-1、P2X7蛋白相對表達量比較

假手術組、ASCI 組、實驗組大鼠脊髓組織NLRP3、Caspase-1、P2X7 蛋白相對表達量比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。進一步兩兩比較結果：與假手術組比較，ASCI 組脊髓組織NLRP3、Caspase-1、P2X7 蛋白相對表達量升高（P＜0.05）；與ASCI 組比較，實驗組脊髓組織NLRP3、Caspase-1、P2X7 蛋白相對表達量降低（P＜0.05）。見表5 和圖4。

表5 3組大鼠脊髓組織NLRP3、Caspase-1、P2X7蛋白相對表達量比較 （n=5，±s）

表5 3組大鼠脊髓組織NLRP3、Caspase-1、P2X7蛋白相對表達量比較 （n=5，±s）

注：①與假手術組比較，P ＜0.05；②與ASCI組比較，P ＜0.05。

組別假手術組ASCI組實驗組F 值P 值P2X7 0.25±0.03 0.92±0.11①0.40±0.05②119.645 0.000 NLRP3 0.35±0.04 0.72±0.08①0.53±0.06②44.267 0.000 Caspase-1 0.29±0.03 0.99±0.12①0.62±0.07②91.064 0.000

圖4 各組大鼠脊髓組織NLRP3、Caspase-1、P2X7蛋白的表達

3 討論

ASCI 引發(fā)的局部病理損傷表現(xiàn)為區(qū)域性、不完全性，并造成血管痙攣、局部炎癥、組織水腫缺血、離子失衡、代謝紊亂及氨基酸毒性等復雜級聯(lián)反應，進而損傷神經(jīng)細胞并致其脫髓鞘，生成膠質瘢痕影響軸突正常生長，最終導致不可逆性神經(jīng)功能損害[7-8]。MG 廣泛分布于神經(jīng)系統(tǒng)，其作為巨噬細胞具有呈遞抗原、吞噬病原體、為神經(jīng)元提供營養(yǎng)支持等作用，與炎癥產(chǎn)生關系密切。ASCI 后中樞系統(tǒng)感受到強烈刺激，MG 轉變?yōu)镸1、M2 兩種極化類型，M1 型通過分泌蛋白酶、炎癥因子等加劇脊髓損傷，并誘導炎癥細胞遷移至損傷區(qū)域，而M2 型可分泌抗炎因子從而減輕炎癥反應及組織損傷[9]。由此可見，活化MG 在調(diào)控ASCI 后的炎癥反應中占據(jù)重要地位。

miR-124 被證實大量表達于哺乳動物腦及脊髓神經(jīng)元中，在癲癇、帕金森病及腦缺血等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中起關鍵作用，并可促進MG 從促炎M1 型轉化為抑炎M2 型[10-12]。李昊天等[13]發(fā)現(xiàn)，上調(diào)miR-124 可抑制脊髓損傷大鼠氧化應激導致的神經(jīng)元凋亡，減輕脊髓損傷，提示其在治療脊髓損傷方面的潛能。將Exos 作為將miR-124 輸送至中樞神經(jīng)系統(tǒng)的載體與自然生理學狀態(tài)更為接近，且體積微小、容易獲取及保存、無免疫排斥、免疫原性低。此外，該基因修飾方式可促進Exos 表面表達特定的受體和配體，從而使其具有結合特定細胞的功能。楊永祥等[14]研究發(fā)現(xiàn)，Exos 源性miR-146a 可提高N9 型MG 中miR-146a 相對表達量，進而調(diào)控下游靶向因子抑制N9 型MG 介導的炎癥反應，表明Exos 可作為將miRNA 遞送給受體細胞的有效載體。本研究結果顯示，與ASCI 組比較，實驗組脊髓組織Iba-1＋/CD32＋占比降低，Iba-1＋/CD206＋占比升高，且TNFα、IL-6、IL-8 水平降低，提示Exos 源性miR-124 可促進ASCI 大鼠脊髓M1 型MG 轉化為M2 型，從而減輕脊髓炎癥反應。

NOD 樣受體是機體重要的模式識別受體，NLRP3 是其中主要類型之一，被激活后與Caspase-1、ASC 組成炎癥小體。NLRP3 炎癥小體是一種可激活炎癥反應的多蛋白復合物，在先天性免疫及炎癥相關疾病進程中發(fā)揮重要作用，可響應微生物感染與細胞損傷，具有抗微生物及免疫調(diào)節(jié)作用，通過介導Caspase-1 激活和促炎TNF-α、IL-6、IL-8 等炎癥因子分泌，導致細胞焦亡[15-16]。ZHAO 等[17]發(fā)現(xiàn)，通過抑制NLRP3 炎癥小體激活、調(diào)節(jié)巨噬細胞極化可有效減少神經(jīng)膠質瘢痕形成并促進軸突生長，從而治療急性脊髓損傷，提示NLRP3 炎癥小體可作為脊髓損傷治療中的有效靶點。本研究結果顯示，與假手術組比較，ASCI 組脊髓組織NLRP3、Caspase-1、P2X7 蛋白相對表達量升高，經(jīng)實驗組干預后均有所降低，提示P2X7-NLRP3/Caspase-1 信號通路在ASCI中被異常激活，Exos 源性miR-124 可能通過抑制該通路活性發(fā)揮治療ASCI 的作用。

綜上所述，Exos 源性miR-124 可促進ASCI 大鼠脊髓M1 型MG 轉化為M2 型，減輕炎癥反應，推測其作用機制與抑制P2X7-NLRP3/Caspase-1 信號通路活性有關。