王 惠

(山東省濟(jì)南市中醫(yī)醫(yī)院口腔科， 山東 濟(jì)南 250012)

口腔鱗狀細(xì)胞癌(OSCC)是頭頸部癌癥的主要組成部分，其5年生存率不足60%，嚴(yán)重威脅著人類的生命安全[1]。目前，OSCC的治療依賴于手術(shù)切除、放化療，但是對(duì)于處于晚期或復(fù)發(fā)的患者效果甚微。生物標(biāo)志物是反映疾病進(jìn)展過(guò)程中細(xì)胞生理變化的指標(biāo)，可作為OSCC治療的早期診斷或預(yù)后的指標(biāo)。鑒于針對(duì)生物標(biāo)志物的精準(zhǔn)治療在臨床上的潛在應(yīng)用，尋找特異性的OSCC標(biāo)志物對(duì)患者預(yù)后具有重要意義。微小RNA(microRNA，miRNA)是多種腫瘤的預(yù)后生物標(biāo)志物，也是腫瘤新的潛在治療靶點(diǎn)[2,3]。在OSCC中，部分miRNA的表達(dá)與患者的臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及存活率相聯(lián)系，這些miRNA可作為OSCC的預(yù)后預(yù)測(cè)因子[4]。miR-216a-3p、miR-128-3p是最近幾年新發(fā)現(xiàn)的OSCC失調(diào)miRNA，在OSCC的發(fā)生、發(fā)展中具有一定作用，但是其潛在的機(jī)制仍需繼續(xù)研究。G蛋白信號(hào)調(diào)節(jié)器17(G protein signal regulator 17，RGS17)是一個(gè)癌基因，其在癌癥發(fā)展過(guò)程中可能受多種miRNA的調(diào)控[5]。本研究旨在探究miR-216a-3p、miR-128-3p調(diào)控OSCC細(xì)胞表型惡化的機(jī)制與RGS17之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1材料:樣本來(lái)自2018年2月至2022年2月本醫(yī)院行手術(shù)切除的OSCC患者36例，癌旁組織30例。其中癌組織包括Ⅰ期(7例)、Ⅱ期(17例)、Ⅲ期(12例)。所有患者均簽署知情同意書(shū)。正?？谇唤琴|(zhì)形成細(xì)胞hNOK、OSCC癌細(xì)胞SCC-9、SCC-25、HN4均來(lái)自中國(guó)科學(xué)研究院上海細(xì)胞庫(kù)；TRIzol試劑、Annexin-V/PI染色細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；EdU細(xì)胞增殖試劑盒購(gòu)自中國(guó)上海Beyotime公司；Transwell小室(孔徑8-mm)購(gòu)自美國(guó)康寧公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自日本Takara公司；PierceTM磁性 RNA-蛋白 Pull-Down 試劑盒、ECL檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng):hNOK、SCC-9、SCC-25、HN4細(xì)胞使用DMEM培養(yǎng)。用含10%的胎牛血清和1%抗生素的培養(yǎng)基培養(yǎng)。所有細(xì)胞均在5%CO2、37℃的條件下的恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2轉(zhuǎn)染與分組:使用脂質(zhì)體3000轉(zhuǎn)染試劑將mimic-NC組(轉(zhuǎn)染mimic)、mimic-miR-216a-3p組(轉(zhuǎn)染miR-216a-3p mimic)、mimic-miR-128-3p組(轉(zhuǎn)染miR-128-3p mimic)、si-NC組(轉(zhuǎn)染si-NC)、si-RGS17組(轉(zhuǎn)染si-RGS17)、mimic-miR-216a-3p+pcDNA組(共轉(zhuǎn)染miR-216a-3p mimic和pcDNA)、mimic-miR-216a-3p+pcDNA-RGS17組(共轉(zhuǎn)染miR-216a-3p mimic和pcDNA-RGS17)、mimic-miR-128-3p+pcDNA組(共轉(zhuǎn)染miR-128-3p mimic和pcDNA)、mimic-miR-128-3p+pcDNA-RGS17組(共轉(zhuǎn)染miR-128-3p mimic和pcDNA-RGS17)轉(zhuǎn)染SCC-9細(xì)胞，8h后更換新培養(yǎng)基繼續(xù)養(yǎng)至48h，RT-qPCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。

1.2.3RT-qPCR實(shí)驗(yàn):按照TRIzol試劑說(shuō)明書(shū)從癌細(xì)胞或組織中提取總RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將其合成cDNA。qPCR試劑盒檢測(cè)cDNA中miR-216a-3p、miR-128-3p、RGS17的表達(dá)。

1.2.4EdU染色:按照EdU細(xì)胞增殖試劑盒說(shuō)明書(shū)要求操作，PBS清洗細(xì)胞，用EdU溶液處理2h。甲醇固定細(xì)胞并用DAPI核染，在倒置顯微鏡下觀察EdU陽(yáng)性細(xì)胞。EdU陽(yáng)性率(%)=EdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.2.5克隆形成實(shí)驗(yàn):將細(xì)胞接種至6孔板培養(yǎng)14d。結(jié)果：形成的克隆細(xì)胞用甲醛固定、結(jié)晶紫染色。5min后，對(duì)含有50個(gè)以上細(xì)胞的菌落進(jìn)行拍照、計(jì)數(shù)。

1.2.6Transwell實(shí)驗(yàn):Transwell小室上室表面預(yù)先涂30μg Matrigel基質(zhì)膠，用于細(xì)胞侵襲檢測(cè)，使用不含基質(zhì)膠的小室用于細(xì)胞的遷移檢測(cè)。取100μL(1×105)細(xì)胞用無(wú)血清培養(yǎng)基混勻，加入上室。同時(shí)，在下室加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基。37℃、5%CO2培養(yǎng)24h，侵入下室的細(xì)胞用4%多聚甲醛固定，結(jié)晶紫染色。光學(xué)顯微鏡下拍照、計(jì)數(shù)。

1.2.7流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡:用Annexin-V/PI染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡。細(xì)胞在暗室中經(jīng)過(guò)Annexin V-FITC、PI雙重染色15min，然后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析細(xì)胞的凋亡情況?？偟蛲雎?%)=早期凋亡率+晚期凋亡率。

1.2.8雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn):化學(xué)合成野生型和突變miR-216a-3p、miR-128-3p結(jié)合位點(diǎn)的RGS17片段，插入pmirGLO雙熒光素酶載體，構(gòu)建RGS17-WT和SUDS3-MUT報(bào)告基因。然后，將上述構(gòu)建物分別與miR-216a-3p、miR-128-3p模擬物或NC模擬物共轉(zhuǎn)染SCC-9細(xì)胞。最后，通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告試劑盒檢測(cè)細(xì)胞的熒光素酶相對(duì)活性。

1.2.9RNA沉降實(shí)驗(yàn):使用PierceTM磁性RNA-蛋白Pull-Down試劑盒研究RNA下拉。首先，使用生物素RNA標(biāo)記混合物和T7 RNA聚合酶，獲得含有野生型、突變區(qū)域的RGS17-WT和SUDS3-MUT。隨后，使用RIPA裂解緩沖液收集細(xì)胞裂解物并與miR-216a-3p、miR-128-3p模擬物或NC模擬物4℃孵育過(guò)夜。隨后加入與鏈霉親和素偶聯(lián)的磁珠，以沉降生物素標(biāo)記的RGS17及其相互作用的化合物。最后，使用qRT-PCR法檢測(cè)各組化合物中的RNA的表達(dá)。

1.2.10WB實(shí)驗(yàn):用SDS-PAGE凝膠電泳制備凝膠，蛋白電泳，硝化纖維素濾膜轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)。然后將膜與一抗(1000倍稀釋的β-actin、RGS17)孵育過(guò)夜。再與二抗(500倍稀釋的HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗)37℃孵育2h。ECL檢測(cè)試劑盒對(duì)蛋白質(zhì)條帶顯色，曝光。Image J軟件分析蛋白條帶的灰度值。

2 結(jié) 果

2.1miR-216a-3p、miR-128-3p在OSCC組織、細(xì)胞中的表達(dá):與癌旁組織相比，OSCC組織(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期)中miR-216a-3p、miR-128-3p表達(dá)顯著降低，SCC-9、SCC-25、HN4細(xì)胞miR-216a-3p、miR-128-3p表達(dá)顯著低于hNOK(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 miR-216a-3p miR-128-3p在OCSS中的表達(dá)

2.2miR-216a-3p、miR-128-3p對(duì)OSCC細(xì)胞惡性行為的影響:與mimic-NC組相比，mimic-miR-216a-3p、mimic-miR-128-3p組細(xì)胞miR-216a-3p、miR-128-3p表達(dá)顯著升高，EdU陽(yáng)性率、克隆形成率均顯著降低，遷移細(xì)胞數(shù)、侵襲細(xì)胞數(shù)均顯著降低，細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 過(guò)表達(dá)miR-216a-3p miR-128-3p對(duì)SCC-9細(xì)胞增殖遷移侵襲的作用

2.3miR-216a-3p、miR-128-3p與RGS17的靶向關(guān)系:生物信息靶標(biāo)預(yù)測(cè)網(wǎng)站發(fā)現(xiàn)，RGS17的3UTR存在連續(xù)的互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)，如圖1A、B。雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)顯示，miR-216a-3p、miR-128-3p明顯的抑制RGS17-WT細(xì)胞的熒光活性，如圖1C；RIP實(shí)驗(yàn)顯示，miR-216a-3p、miR-128-3p明顯增加RGS17-WT細(xì)胞富集miR-216a-3p、miR-128-3p的能力，如圖1D、E。過(guò)表達(dá)miR-216a-3p、miR-128-3p的細(xì)胞中RGS17蛋白的表達(dá)顯著低于mimic-NC組，如圖1F。在OSCC組織中RGS17表達(dá)水平與miR-216a-3p、miR-128-3p呈明顯的負(fù)相關(guān)性，如圖1G、H(P<0.05)。

圖1 miR-216a-3p、miR-128-3p靶向RGS17

2.4RGS17在OSCC組織、細(xì)胞中的表達(dá):GEPIA(http://gepia.cancer-pku.cn)分析OSCC中RGS家族成員的表達(dá)，RGS4、RGS3、RGS19、RGS20在癌組織中的表達(dá)均顯著升高。見(jiàn)表3。RGS17在OSCC組織(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期)和SCC-9、SCC-25、HN4細(xì)胞中的表達(dá)顯著高于癌旁組織或hNOK細(xì)胞。見(jiàn)圖2、表4。

表3 OSCC中RGS家族部分成員表達(dá)

表4 RGS17在OSCC組織細(xì)胞中的表達(dá)

圖2 RGS17蛋白表達(dá)

2.5敲減RGS17對(duì)OSCC細(xì)胞惡性行為的影響:與si-NC組相比，si-RGS17組細(xì)胞RGS17表達(dá)顯著降低(圖3)，EdU陽(yáng)性率、克隆形成率均顯著降低，遷移細(xì)胞數(shù)、侵襲細(xì)胞數(shù)顯著降低，細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05)。見(jiàn)表5。

圖3 RGS17蛋白表達(dá)

表5 敲減RGS17對(duì)SCC-9細(xì)胞增殖遷移侵襲的調(diào)控

2.6過(guò)表達(dá)RGS17部分逆轉(zhuǎn)miR-216a-3p、miR-128-3p對(duì)OSCC細(xì)胞惡性行為的作用:與mimic-miR-216a-3p+pcDNA組相比，mimic-miR-216a-3p+ pcDNA-RGS17組細(xì)胞RGS17表達(dá)顯著升高，EdU陽(yáng)性率、克隆形成率、遷移侵襲細(xì)胞數(shù)均顯著升高，細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.05)。與mimic-miR-128-3p+pcDNA組相比，mimic-miR-128-3p+pcDNA-RGS17組細(xì)胞RGS17表達(dá)顯著升高(圖4)，EdU陽(yáng)性率、克隆形成率、遷移侵襲細(xì)胞數(shù)均顯著升高，細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)表6。

表6 過(guò)表達(dá)RGS17部分逆轉(zhuǎn)miR-216a-3p miR-128-3p對(duì)OSCC細(xì)胞惡性行為的調(diào)控

圖4 RGS17蛋白圖

3 討 論

在OSCC組織和細(xì)胞中miR-216a-3p表達(dá)下調(diào)，且與OSCC患者的組織學(xué)分級(jí)、臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，miR-216a-3p模擬物降低OSCC細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，增加細(xì)胞凋亡[6]。miR-216a-3p還可作為Circ 0011946、BCL2L2的靶標(biāo)，發(fā)揮抑制OSCC細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，促進(jìn)凋亡的抑癌作用[7]。miR-128/MiR-142在口腔鱗癌組織和細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，miR-128/miR-142的過(guò)度表達(dá)抑制了OSCC細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和EMT，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[8]。這說(shuō)明了miR-216a-3p、miR-128在OSCC的惡化過(guò)程中具有關(guān)鍵作用。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-216a-3p、miR-128-3p在OSCC組織、細(xì)胞中均下調(diào)，并與癌癥分期相關(guān)。過(guò)表達(dá)miR-216a-3p、miR-128-3p表現(xiàn)出抑制OSCC細(xì)胞增殖、遷移侵襲，促進(jìn)凋亡的作用，證實(shí)了miR-216a-3p、miR-128-3p在OSCC中的抗癌功能。深入研究，通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)和RNA沉降實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，RGS17是miR-216a-3p、miR-128-3p的共有靶基因，并且被miR-216a-3p、miR-128-3p負(fù)向調(diào)控，在癌組織中與miR-216a-3p、miR-128-3p呈負(fù)相關(guān)。這說(shuō)明，RGS17可能與miR-216a-3p、miR-128-3p調(diào)控OSCC細(xì)胞惡性表型變化的因素之一。

RGS17的過(guò)度表達(dá)促進(jìn)了多種癌癥的發(fā)展[9]。RGS17在宮頸癌、卵巢癌、肺癌和肝癌中均表達(dá)上調(diào)，作為致癌基因參與癌癥的惡化、腫瘤的生長(zhǎng)[10，11]。RGS家族成員在OSCC中表達(dá)失調(diào)，不同成員發(fā)揮的功能各異。RGS12、RGS20在OSCC中具有抑制癌癥進(jìn)一步惡化的作用，其發(fā)揮作用的機(jī)制仍有待深入研究。而RGS17在OSCC中的作用及功能機(jī)制的研究仍處于初級(jí)階段。本研究結(jié)果顯示：頭頸部鱗狀細(xì)胞癌中RGS4、RGS3、RGS19、RGS20均高表達(dá)，RGS17在OSCC癌組織和癌細(xì)胞中表達(dá)也上調(diào)，這與RGS17在其他惡性實(shí)體瘤中的表達(dá)相一致。進(jìn)一步敲減RGS17發(fā)現(xiàn)，OSCC細(xì)胞的增殖能力、遷移侵襲能力明顯受到抑制，反而凋亡能力得到提升，呈現(xiàn)出抗癌治療的效果，這說(shuō)明了RGS17在OSCC中也發(fā)揮促癌的作用。為了進(jìn)一步探究RGS17與miR-216a-3p、miR-128-3p之間的關(guān)系，通過(guò)共轉(zhuǎn)染RGS17和miR-216a-3p、RGS17和miR-128-3p發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)RGS17后，miR-216a-3p、miR-128-3p對(duì)OSCC細(xì)胞的表型惡化抑制作用受到明顯的削減。

綜上所述，miR-216a-3p、miR-128-3p抑制口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞增殖、遷移侵襲，促進(jìn)凋亡，產(chǎn)生這種抗癌功能的潛在機(jī)制與直接靶向抑制RGS17有關(guān)，為OSCC的精準(zhǔn)治療提供新方向。不足之處在于這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果尚未在動(dòng)物體內(nèi)得到進(jìn)一步的驗(yàn)證，本課題組計(jì)劃通過(guò)異種移植裸鼠成瘤觀察miR-216a-3p和miR-128-3p對(duì)口腔鱗狀細(xì)胞癌腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移的調(diào)控。