鄭 文， 李 萌， 張艷麗， 禚金花， 戴永剛， 程世亮

(山東省立第三醫(yī)院檢驗科， 山東 濟南 250031)

近年來，肝癌的發(fā)病率呈現(xiàn)出逐年遞增趨勢，成為一種高死亡率的惡性腫瘤疾病[1]。環(huán)狀RNA(circular RNA，circRNA)是一類新發(fā)現(xiàn)的內(nèi)源性非編碼RNA(non-coding RNA，ncRNA)，在各類細胞中廣泛表達，并對細胞的信號傳導(dǎo)具有重要作用[2]。隨著RNA測序技術(shù)的發(fā)展，越來越多的circRNA在癌組織中被發(fā)現(xiàn)。研究表明，circRNA通過影響腫瘤生長、遷移、侵襲和分化在癌癥進展中發(fā)揮重要作用[3]。最近的研究發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0044556還可以促進肝癌細胞增殖和惡化，可能成為肝癌治療的潛在靶點[4]。然而，hsa_circ_0044556促進肝癌發(fā)展的作用機制尚不清楚。程序性死亡因子1(programmed death ligand 1,PD-1)/程序性死亡因子配體(programmed death ligand 1，PD-L1)信號通路可抑制T細胞的增殖與活化，是目前腫瘤免疫治療的研究熱點。而一些circRNA和miRNA可以通過干擾免疫攻擊相關(guān)分子的表達影響癌癥免疫監(jiān)視和免疫逃逸。circRNA在腫瘤免疫微環(huán)境中發(fā)揮著重要作用，并調(diào)節(jié)免疫檢查點基因從而影響免疫療法的治療效果[5]。本研究探究肝癌細胞表達的hsa_circ_0000190是否通過circRNA-miRNA-mRNA軸調(diào)節(jié)PD-L1表達參與免疫逃逸，為未來研究肝癌的免疫療法提供參考價值。

1 材料與方法

1.1材 料

1.1.1實驗細胞：留取2018年6月至2021年3月于我院行肝癌切除術(shù)患者40例癌組織和癌旁組織(距腫瘤邊緣≥5mm)標(biāo)本100mg，液氮中保存?zhèn)溆?。所有患者術(shù)前均未接受放化治療，且簽署知情同意書。

1.1.2實驗試劑：正常肝上皮HL-02細胞、肝癌細胞系SMMC-7721、HCCLM3購自中科院上海細胞庫；NK-92細胞購自上海澤葉生物科技有限公司；si-NC、si-miR-145、si-hsa_circ_0044556、LipofectamineTM 2000 購自美國Invitrogen公司；雙熒光素酶報告基因試劑盒購自美國Promega公司；NK細胞殺傷活性檢測試劑購于Promega公司；PD-L1抗體、GAPDH抗體購自英國abcam公司；PD-L1、hsa_circ_0044556、miR-145、GAPDH的qPCR引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2方 法

1.2.1細胞培養(yǎng)：正常肝上皮HL-02細胞、SMMC-7721、HCCLM3肝癌細胞均使用含10%胎牛血清RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，NK-92細胞培養(yǎng)于NK-92細胞專用培養(yǎng)基中，均置于37℃、5%CO2恒溫的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，根據(jù)細胞生長密度更換新鮮的培養(yǎng)基，待細胞生長到80%-90%時進行消化傳代，取對數(shù)生長期的細胞進行的實驗。

1.2.2hsa_circ_0044556、miR-145靶向性檢測：利用TargetScan數(shù)據(jù)庫和LncRNA2Target數(shù)據(jù)庫預(yù)測hsa_circ_0044556、miR-145的靶基因。收集對數(shù)生長期的HCCLM3細胞接種至96孔板，根據(jù)LipofectamineTM 2000說明書進行轉(zhuǎn)染，分別將hsa_circ_0044556 WT與hsa_circ_0044556 MUT及miR-145 mimic、miR-145-NC mimic轉(zhuǎn)染至HCCLM3細胞中(同時miR-145 mimic、miR-145-NC mimic及 PD-L1-WT或 PD-L1-MUT共轉(zhuǎn)染至HCCLM3細胞中)，48h后，應(yīng)用雙熒光素酶活性檢測試劑盒檢測HCCLM3細胞的熒光素酶活性。依據(jù)以下公式進行計算:相對luciferase活性=firefly luciferase活性/renilla luciferase活性×100%。

1.2.3NK細胞毒性試驗：以培養(yǎng)24h后的NK-92細胞為效應(yīng)細胞，以不同方式處理的腫瘤細胞為靶細胞，600r/min離心PBS洗滌2次，分別按2∶1、5∶1、10∶1效靶比加入96孔板，每組設(shè)3個復(fù)孔。37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)3h。分別加10μL裂解液培養(yǎng)1h。加反應(yīng)底物室溫避光放置30min，加反應(yīng)終止液終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀測OD450nm值。NK-92細胞殺傷率(%)=(實驗組OD平均值-靶細胞自然釋放組OD平均值-效應(yīng)細胞自然釋放組OD平均值)/(靶細胞最大釋放組OD平均值-靶細胞自然釋放組OD平均值)×100%。

1.2.4細胞轉(zhuǎn)染：將以3.5×106個對數(shù)生長期的HCCLM3細胞接種于6孔板中，待細胞生長密度至65%～75%時，分別轉(zhuǎn)染si-NC、si-hsa_circ_0044556、si-miR-145、si-hsa_circ_0044556+si-miR-145。分別設(shè)置為si-NC組(轉(zhuǎn)染si-NC)、si-hsa_circ_0044556組(轉(zhuǎn)染si-hsa_circ_0044556)、si-miR-145組(轉(zhuǎn)染si-miR-145)和si-hsa_circ_0044556+si-miR-145(轉(zhuǎn)染si-hsa_circ_0044556+si-miR-145)

1.2.5CCK8細胞增殖實驗：取各組細胞，胰酶消化后離心，用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基稀釋成單細胞懸液，以3×104個/mL密度接種到96孔板中，接種體積為200μL。在細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，在培養(yǎng)至24h、48h及72h時加入20μL CCK8檢測試劑，1h后通過酶標(biāo)儀測定450nm吸光度值。

1.2.6RT-qPCR法檢測腫瘤組織或細胞中PD-L1、hsa_circ_0044556的表達：TRIzol試劑提取肝癌組織樣本、正常肝上皮HL-02細胞、肝癌細胞株SMMC-7721、HCCLM3中的總RNA。按照qRT-PCR試劑盒實驗說明，依次進行逆轉(zhuǎn)錄和qRT-PCR實驗。擴增結(jié)果根據(jù)2-△△Ct法計算mRNA的相對表達量。引物序列：GAPDH-F，5-AATGGGCAGCCGTTAGGAAA-3，GAPDH-R，5-GCGCCCAATACGACCAAATC-3；PD-L1-F，5-TTGCTGAACGCCCCATACAA-3，PD-L1-R，5-TGTCCCGTTCCAACACTGAG-3；miR-145-F，5-GTCCAGTTTTCCCAGGA-3，miR-145-R，5-GAACATGTCTGCGTATCTC-3；hsa_circ_0044556-F，5-GAAGCTGGTCTGCCTGGTG-3,hsa_circ_0044556-R，5-GAGGAGCGAAAGGAAGGAGA-3。

1.2.7Western blot法檢測腫瘤組織或細胞中PD-L1的表達：收集各組細胞，使用RIPA裂解提取總蛋白。SDS-PAGE凝膠電泳分離等量蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜。5%脫脂牛奶4℃封閉1h，TBST洗膜5min，3次，加入GAPDH抗體(1∶4000)、PD-L1抗體(1∶2000)，4℃搖床孵育過夜。TBST洗膜5min，3次，加入HRP標(biāo)記的羊抗兔的二抗(1∶1000)37℃孵育1h，TBST洗膜5min，5次。顯影曝光，利用Image-Pro Plus圖像分析系統(tǒng)對蛋白條帶的灰度值進行分析。實驗重復(fù)3次，取平均值。

2 結(jié) 果

2.1肝癌患者中hsa_circ_0044556和PD-L1的表達水平比較：qRT-PCR結(jié)果顯示，與癌旁組織(1.00±0.42，1.00±0.54)相比，腫瘤組織中hsa_circ_0044556(7.03±3.26)和PD-L1(4.35±2.84)表達水平升高(P<0.05)，見圖1A。通過Spearman進行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示，癌旁組織及腫瘤組織中hsa_circ_0044556和PD-L1的表達呈正相關(guān)(r=0.5481)，見圖1B。

圖1 肝癌中hsa_circ_0044556和PD-L1的表達水平呈正相關(guān)

2.2不同細胞系中hsa_circ_0044556和PD-L1的表達水平比較：qRT-PCR結(jié)果顯示，與正常肝上皮HL-02細胞(1.00±0.35，1.00±0.47)相比，肝癌SMMC-7721(4.74±1.64，2.25±0.85)、HCCLM3細胞(11.95±3.26，6.64±1.05)的hsa_circ_0044556和PD-L1表達水平升高(P<0.05)；與SMMC-7721細胞相比，HCCLM3細胞的hsa_circ_0044556和PD-L1表達水平升高(P<0.05)，見圖2。后續(xù)選擇肝癌HCCLM3細胞進行細胞實驗。

圖2 不同細胞系中hsa_circ_0044556和PD-L1的表達水平比較

2.3hsa_circ_0044556靶向抑制miR-145：預(yù)測結(jié)果顯示，hsa_circ_0044556與miR-145的5’端存在多個連續(xù)匹配堿基對，見圖3A。熒光素酶報告實驗結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-145模擬物和野生型hsa_circ_0044556的熒光素酶強度比轉(zhuǎn)染miR-NC和野生型hsa_circ_0044556的降低(P<0.05)；這種現(xiàn)象在轉(zhuǎn)染突變型hsa_circ_0044556后消失，見圖3B。通過si-RNA沉默hsa_circ_0044556表達，與si-NC組(1.00±0.21)相比，si-hsa_circ_0044556組(2.13±0.68)miR-145表達水平升高(P<0.05)，見圖3C。結(jié)果提示hsa_circ_0044556負(fù)調(diào)控miR-145表達。

圖3 hsa_circ_0044556靶向抑制miR-145

2.4miR-145靶向抑制PD-L1：預(yù)測結(jié)果顯示，miR-145的5’端與PD-L1存在多個連續(xù)匹配堿基對，見圖4A。熒光素酶報告實驗結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-145模擬物和野生型PD-L1的熒光素酶強度比轉(zhuǎn)染miR-NC和野生型PD-L1的降低(P<0.05)；這種現(xiàn)象在轉(zhuǎn)染突變型PD-L1后消失，見圖4B。通過si-RNA沉默miR-145表達，與si-NC組(1.00±0.26)相比，miR-145組(2.96±0.34)PD-L1表達水平升高(P<0.05)，見圖4C。結(jié)果提示miR-145負(fù)調(diào)控PD-L1表達。

圖4 miR-145靶向抑制PD-L1

2.5hsa_circ_0044556通過miR-145影響PD-L1表達：Western blot結(jié)果顯示，與si-NC組(0.82±0.13)相比，si-hsa_circ_0044556組(0.31±0.08)PD-L1表達降低，si-miR-145組(1.42±0.15)PD-L1表達升高(P<0.05)。與si-hsa_circ_0044556組相比，si-hsa_circ_0044556+si-miR-145組(1.34±0.16)PD-L1表達升高(P<0.05)。與si-miR-145組相比，si-hsa_circ_0044556+si-miR-145組PD-L1表達無顯著性差異，見圖5。結(jié)果提示，hsa_circ_0044556通過抑制miR-145的表達，間接調(diào)控PD-L1表達。

圖5 沉默hsa_circ_0044556和miR-145對PD-L1表達影響

2.6hsa_circ_0044556通過miR-145影響肝癌細胞增殖和對NK細胞敏感性：CCK8實驗和NK細胞毒性實驗結(jié)果顯示，與si-NC組相比，si-hsa_circ_0044556組細胞增殖能力降低，對NK細胞敏感性增加(P<0.05)；si-miR-145組細胞增殖能力升高，對NK細胞敏感性降低(P<0.05)。與si-hsa_circ_0044556組相比，si-hsa_circ_0044556+si-miR-145組細胞增殖能力升高，對NK細胞敏感性降低(P<0.05)。與si-miR-145組相比，si-hsa_circ_0044556+si-miR-145組細胞增殖能力和對NK細胞敏感性無顯著性差異，見圖6和表1。

表1 沉默hsa_circ_0044556和miR-145對NK細胞敏感性的影響

圖6 沉默hsa_circ_0044556和miR-145對細胞增殖的影響

3 討 論

世界衛(wèi)生組織的數(shù)據(jù)顯示，肝癌是全球第四大與癌癥相關(guān)的死亡原因[6]。早期診斷可以顯著改善肝癌患者的預(yù)后和生存率。然而，現(xiàn)臨床研究中缺乏可靠的肝癌預(yù)后和復(fù)發(fā)的監(jiān)測生物標(biāo)志物。深入研究肝癌發(fā)生發(fā)展的病理機制，將為肝癌的診治開辟新的思路和方法。

大多數(shù)circRNAs存在于細胞質(zhì)中，在多種疾病中的發(fā)揮重要功能，包括腫瘤的發(fā)展、轉(zhuǎn)移或預(yù)后有關(guān)[7]。在哺乳動物細胞中，與其他ncRNA相比，circRNA具有高度保守的序列和高穩(wěn)定性，這些特征可能讓circRNAs成為癌癥理想的生物標(biāo)志物和診斷的潛在靶點。hsa_circ_0044556由COL1A1基因(膠原蛋白，I型，Alpha 1)產(chǎn)生，位于17號染色體上，長度為200 bp。研究表明，hsa_circ_0044556在多種乳腺癌細胞中高表達，敲低其表達水平可顯著抑制乳腺癌細胞的轉(zhuǎn)移。此外，hsa_circ_0044556表達水平升高與患者較低的生存率相關(guān)[8]。本研究在肝癌細胞系和肝癌組織中均發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0044556的表達水平升高，提示hsa_circ_0044556可能促進了肝癌的發(fā)展。

PD-1/PD-L1是重要的免疫檢查點信號，受到人們越來越多的關(guān)注。近期研究表明，ncRNA參與了PD-1/PD-L1通路在癌變過程中的調(diào)控，其中circRNA介導(dǎo)的PD-1/PD-L1表達異?？赡芡ㄟ^多種分子途徑介導(dǎo)癌細胞的遷移和耐藥性[9]。在本實驗中，PD-L1在肝癌組織和肝癌細胞中高表達，且與hsa_circ_0044556呈現(xiàn)顯著相關(guān)性，提示hsa_circ_0044556可能通過介導(dǎo)PD-L1的表達發(fā)揮作用。

miRNA是一組長短較短的非編碼調(diào)控RNA，主要通過與3'-非翻譯區(qū)(3'-UTR)互補結(jié)合在轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)基因表達。多種miRNA在人類惡性腫瘤中表達失調(diào)，其中miR-145被認(rèn)為是致癌和治療耐藥性的關(guān)鍵抑制因子[10]。本研究發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0044556負(fù)調(diào)控miR-145表達，miR-145負(fù)調(diào)控PD-L1表達，hsa_circ_0044556通過抑制miR-145的表達，間接調(diào)控PD-L1表達。NK細胞在對癌癥的免疫反應(yīng)中起關(guān)鍵作用，腫瘤細胞則可以利用腫瘤微環(huán)境中多種因素逃逸NK細胞的免疫監(jiān)視。在本實驗中，si-hsa_circ_0044556組肝癌細胞對NK細胞的殺傷敏感性明顯增加，而si-hsa_circ_0044556+si-miR-145組細胞增殖能力升高，對NK細胞敏感性降低，hsa_circ_0044556通過miR-145影響肝癌細胞增殖和對NK細胞敏感性。

綜上所述，hsa_circ_0044556和PD-L1在肝癌患者組織和肝癌細胞系中呈現(xiàn)高表達且具呈正相關(guān)，hsa_circ_0044556通過miR145/PD-L1信號軸促進肝癌細胞增殖的同時抑制對NK細胞殺傷的敏感性，從而介導(dǎo)腫瘤細胞的免疫逃逸。