陳 曦， 安 娜， 張 彬， 吳泳樺， 鄧 薔， 胡 冬

(四川省綿陽(yáng)市中心醫(yī)院檢驗(yàn)科， 四川 綿陽(yáng) 621000)

鮑曼不動(dòng)桿菌(Acinetobacter baumannii，A.baumannii)屬革蘭氏陰性菌，屬危害健康的主要病原菌之一，具有獲得性耐藥和環(huán)境適應(yīng)能力，在醫(yī)院環(huán)境中廣泛存在，粘附性較強(qiáng)，可粘附在醫(yī)用器材和醫(yī)護(hù)人員手上、且存活時(shí)間較長(zhǎng)[1]。目前國(guó)際上A.baumannii的疫苗尚未成功，導(dǎo)致A.baumannii感染在社區(qū)和醫(yī)院存在，且患者死亡率較高[2]。另外，A.baumannii基因組對(duì)大多數(shù)抗菌藥均產(chǎn)生耐藥性，且隨著臨床上使用抗生素的逐年增加，導(dǎo)致耐藥性逐年增強(qiáng)[3]，因此找到新的治療和預(yù)防策略從而對(duì)抗A.baumannii的感染已成為目前刻不容緩的工作。近幾年來(lái)，學(xué)者們對(duì)A.baumannii疫苗研究做出了較多探索，在研究中發(fā)現(xiàn)了滅活全細(xì)胞、外膜復(fù)合物和外膜囊泡等多組分抗原，外膜蛋白、膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、生物膜相關(guān)蛋白、莢膜多糖和膜相關(guān)多糖等單抗原[4,5]。但這些抗原安全性卻有待研究。本文以A.baumannii外膜受體oprC為研究對(duì)象，探討其抗體制備過(guò)程和生物學(xué)活性，為A.baumannii疫苗的研究提供一定參考。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與試劑:健康BALB/c小鼠購(gòu)自北京Vital River實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，SPF級(jí)，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(京)2019-0103，使用許可證號(hào)：SCXK(京)2019-0006，體重(20±2)g。EcoRⅠ、HindⅢ酶購(gòu)自Thermo Scientific；T4連接酶購(gòu)自SinoBio；異丙基硫代-β-D-半乳糖苷購(gòu)自蘇州亞科科技有限公司；弗氏完全佐劑購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1抗原的制備:ATCC 17978培養(yǎng)基培養(yǎng)A.baumannii 16～18h，提取總DNA，以NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)上oprC的DNA為目的基因，設(shè)計(jì)上游加EcoRⅠ(5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3')、下游加HindⅢ(5'-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3')酶切位點(diǎn)的引物，擴(kuò)增目的片段，反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃、5min，95℃、30s，55℃、30s，72℃、2min，35個(gè)循環(huán)；72℃、10min。T4連接酶連接目的片段到pET28a上，得重組質(zhì)粒。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)E.coli BL21感受態(tài)細(xì)胞中，制備單克隆菌落，并經(jīng)雙酶切和測(cè)序驗(yàn)證。單菌落37℃培養(yǎng)過(guò)夜，LB培養(yǎng)液在光密度值0.6時(shí)添加異丙基硫代-β-D-半乳糖苷誘導(dǎo)目的基因表達(dá)，SDS-PAGE鑒定重組蛋白表達(dá)情況，同時(shí)空載上所含(標(biāo)簽)蛋白作為對(duì)照，載體標(biāo)簽為N-His、N-Thrombin、N-T7、C-His。

1.2.2重組蛋白的純化:GST柱親和層析法純化蛋白。重組質(zhì)粒菌液置于ATCC 17978培養(yǎng)液中培養(yǎng)并擴(kuò)培，密度合適時(shí)離心收集細(xì)菌，每升菌液用50mL PBS重懸，加1%TritonC-100、1%β-巰基乙醇、苯甲基磺酰氟，并超聲裂解菌體，15000g離心10min取上清并添加GST-beads，輕搖1h吸附蛋白；2000g離心3min棄上清，加1mL GST Elution Buffer，輕搖10min，2000g離心3min收集上清，SDS-PAGE鑒定蛋白純度，Bradford法鑒定蛋白濃度，將蛋白置于-20℃保存。

1.2.3多克隆抗體的制備:純化好的融合蛋白作為抗原免疫小鼠，目的蛋白:弗氏完全佐劑=1∶1混勻后采用多線注射法皮下注射小鼠，一免為0.1mg蛋白/小鼠；一周后二免，目的蛋白:弗氏不完全佐劑=1∶1混勻后，0.1mg蛋白/小鼠皮下注射小鼠；三免、四免方法與二免相同且間隔時(shí)間相同。四免結(jié)束后4d眼部采血，采集的血液于37℃恒溫箱中靜置1h，4℃冰箱過(guò)夜，待血清析出后移置新的離心管中置于-20℃冰箱保存。陰性對(duì)照組同一時(shí)間點(diǎn)注射等體積PBS做對(duì)照處理，同時(shí)相同方法收集血清做陰性對(duì)照。

1.2.4抗體效價(jià)測(cè)定:酶聯(lián)免疫吸附(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)法測(cè)定抗體效價(jià)?？乖?.5μg，抗原包被液將抗原稀釋至100μL，加入96孔板中，4℃過(guò)夜；加入200μL PBST+5%脫脂奶粉，4℃封閉過(guò)夜，以1∶200、1∶400、1∶800、1∶1600、1∶3200、1∶6400、1∶12800、1∶25600、1∶51200梯度稀釋陰性、陽(yáng)性血清，每孔加100μL，37℃孵育1h；PBST洗板3次，加入1∶3000稀釋辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠IgG，每孔100μL，37℃孵育1h；加底物鄰苯二胺100μL，37℃孵育20min，2moL/L H2SO4終止反應(yīng)，讀取OD 490，P/N≥2.1為判定標(biāo)準(zhǔn)，確定抗體最終效價(jià)。

1.2.5重組蛋白對(duì)感染小鼠的存活率:腹腔注射4.2×108CFU/mL A.baumannii，對(duì)60只小鼠進(jìn)行攻毒實(shí)驗(yàn)，小鼠表現(xiàn)為弓背、豎毛癥狀時(shí)，30只小鼠注射oprC蛋白多克隆抗體，另30只小鼠只進(jìn)行攻毒實(shí)驗(yàn)，從第0天開始至第21天觀察小鼠生存情況，統(tǒng)計(jì)21d生存率。

1.2.6感染后血清中荷菌量情況:另每組隨機(jī)6只小鼠感染12h，眼球靜脈取血50μL，無(wú)菌條件下涂板，平板置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜，計(jì)數(shù)細(xì)菌定值量。

1.2.7HE染色各組小鼠臟器情況:1.2.6小鼠取靜脈血后，分別取小鼠肺、肝臟、脾臟、腎臟，4%多聚甲醛固定，待固定后，經(jīng)脫水處理，二甲苯透明，經(jīng)包埋后，切片機(jī)切片，厚度4μm，蘇木精-伊紅染色，光學(xué)顯微鏡下觀察臟器病理變化和炎癥損失。

2 結(jié) 果

2.1目的片段擴(kuò)增成功:NCBI中oprC全基因組為模板PCR擴(kuò)增長(zhǎng)度為2115bp，全基因組擴(kuò)增大小為>2000bp，大體與oprC基因全長(zhǎng)預(yù)期相符。見(jiàn)圖1。

圖1 PCR擴(kuò)增oprC序列瓊脂糖膠圖片

2.2雙酶切鑒定重組質(zhì)粒大小為1500bp-3000bp:目的片段與pET28a質(zhì)粒連接，pET28a空質(zhì)粒5369bp，篩選oprC+pET28a重組質(zhì)粒，質(zhì)粒圖譜見(jiàn)圖2。重組質(zhì)粒經(jīng)過(guò)EcoRⅠ、HindⅢ雙酶切驗(yàn)證連接情況。oprC+pET28a重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切后瓊脂糖膠上呈現(xiàn)兩個(gè)片段，1500bp-3000bp間為oprC片段，5000bp附近為pET28a質(zhì)粒片段?？召|(zhì)粒pET28a片段長(zhǎng)度5000bp附近。大小與預(yù)期相符。見(jiàn)圖3。

圖2 質(zhì)粒圖譜

圖3 酶切鑒定重組質(zhì)粒瓊脂糖膠圖片

2.3原核表達(dá)鑒定重組蛋白大小為70kDa:pET28a蛋白大小為26kDa，oprC蛋白大小為70kDa。異丙基硫代-β-D-半乳糖苷誘導(dǎo)目的基因表達(dá)為蛋白，在97.2kDa附近蛋白表達(dá)量升高推測(cè)為oprC+pET28a重組蛋白(獨(dú)立組分)，20.1kDa與29.0kDa之間某一區(qū)域蛋白表達(dá)量升高，推測(cè)為pET28a標(biāo)簽蛋白表達(dá)。大小與預(yù)期相符。見(jiàn)圖4。

圖4 重組蛋白鑒定SDS-PAGE膠圖片

2.4抗體效價(jià)為1∶12800，ELISA法檢測(cè)結(jié)果顯示，oprC抗血清效價(jià)為1∶12800。見(jiàn)圖5。

圖5 oprC抗血清效價(jià)檢測(cè)示意圖

2.5oprC蛋白多克隆抗體提高小鼠的存活率:攻毒實(shí)驗(yàn)后注射oprC蛋白多克隆抗體小鼠存活率為80%，只進(jìn)行攻毒實(shí)驗(yàn)小鼠存活率為30%，兩者存活率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖6。

圖6 攻毒實(shí)驗(yàn)后小鼠生存率情況

2.6oprC蛋白多克隆抗體降低感染后血液中荷菌量:感染12h后，單純攻毒實(shí)驗(yàn)小鼠血液中荷菌量為(4.3×105/CFU)，攻毒實(shí)驗(yàn)+oprC多克隆抗體小鼠血液中荷菌量為(1.9×105/CFU)；攻毒實(shí)驗(yàn)+oprC多克隆抗體小鼠血液中荷菌量明顯低于單純攻毒實(shí)驗(yàn)小鼠(P<0.05)。

2.7oprC蛋白多克隆抗體減輕組織病理?yè)p傷:攻毒實(shí)驗(yàn)顯示小鼠肺組織中肺泡壁充血明顯、間質(zhì)內(nèi)血管明顯擴(kuò)張，腔內(nèi)出現(xiàn)明顯的炎癥滲出及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯；肝臟組織內(nèi)變化不明顯；脾臟中紅髓變大、白髓變小，淋巴細(xì)胞數(shù)量減少、變得稀疏；腎臟組織中腎小球出現(xiàn)肥大、系膜增厚現(xiàn)象，腎小球基底膜增厚，組織纖維化、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯。攻毒實(shí)驗(yàn)+oprC多克隆抗體中肝臟差異不明顯外，其余各組織癥狀均有所緩解。見(jiàn)圖7。

圖7 兩組肺、肝臟、脾臟、腎臟病理性損傷情況

3 討 論

A.baumannii是一種新型的機(jī)會(huì)型醫(yī)院病原菌，A.baumannii感染表現(xiàn)為醫(yī)院和社區(qū)獲得性肺炎、血流感染、心內(nèi)膜炎、泌尿道感染、傷口感染、燒傷感染、皮膚和軟組織感染以及腦膜炎等[6]，危害嚴(yán)重。為降低A.baumannii感染的疾病，噬菌體和抗生素制劑治療A.baumannii，造成A.baumannii耐藥，嚴(yán)重影響治療效果[7]。改善A.baumannii耐藥性，可能是緩解疾病方法之一。A.baumannii外膜蛋白是目前研究最深入的耐藥蛋白之一，A.baumannii附著在支氣管上皮細(xì)胞中，參與氧化應(yīng)激和抗微生物作用，從而發(fā)揮其功能[8]。外膜蛋白的研究中心在2014年6月研究中發(fā)現(xiàn)6個(gè)陽(yáng)性蛋白，包括外膜蛋白o(hù)mpA、omp34kDa，外膜受體蛋白o(hù)prC、oprB，OXA-23和鐵載體受體蛋白，這些外膜蛋白均存在于菌體表面，且與細(xì)菌毒力、耐藥性、細(xì)菌生長(zhǎng)關(guān)系密切，可作為防治A.baumannii的抗原疫苗和被動(dòng)免疫療法候選組分[8]。外膜蛋白o(hù)mpA主要分布于菌體及其外膜囊泡中，可誘發(fā)宿主細(xì)胞氧化應(yīng)激，并侵襲至線粒體和細(xì)胞核中，促進(jìn)細(xì)胞凋亡壞死[9]；omp34kDa參與細(xì)胞粘附作用[10]。外膜蛋白的主動(dòng)和被動(dòng)免疫均可提高小鼠的存活率，抑制器官和外周血中的細(xì)菌負(fù)擔(dān)，并降低血清炎性細(xì)胞因子和趨化因子的水平[11]。外膜受體蛋白o(hù)prB影響葡糖糖轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程，DNJ-NAc可通過(guò)OprB進(jìn)入細(xì)胞，DNJ-NA是一種與葡萄糖具有相似抗感染性蛋白[12]。OXA-23樣家族是伊朗A.baumannii和醫(yī)院不動(dòng)桿菌對(duì)碳青霉烯耐藥的主要原因[13]。鐵載體受體蛋白在細(xì)菌鐵離子攝取機(jī)制中發(fā)揮重要作用，是細(xì)菌的毒力因子和潛在的疫苗靶基因[14]。外膜受體蛋白由于磷脂雙分子層對(duì)膜受體的動(dòng)態(tài)構(gòu)象、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及蛋白間的相互作用均有調(diào)節(jié)作用，可影響膜結(jié)構(gòu)和功能。

本研究以外膜受體蛋白o(hù)prC為研究對(duì)象，其結(jié)構(gòu)和功能尚未發(fā)現(xiàn)相關(guān)報(bào)道。根據(jù)NCBI中oprC的DNA全基因序列設(shè)計(jì)引物，在A.baumannii中克隆出全長(zhǎng)，NCBI預(yù)測(cè)全長(zhǎng)為2115bp，凝膠電泳預(yù)測(cè)正確。與pET28a構(gòu)建重組質(zhì)粒，并誘導(dǎo)重組蛋白大小表達(dá)，重組蛋白并作為免疫原免疫小鼠，得到抗血清抗體，抗體效價(jià)為1∶12800；且oprC蛋白多克隆抗體對(duì)A.baumannii感染小鼠有一定保護(hù)作用。小鼠全身感染A.baumannii模型在12h發(fā)現(xiàn)荷菌量在oprC蛋白多克隆抗體中出現(xiàn)明顯降低現(xiàn)象，且肺、脾臟、腎臟炎癥病理?yè)p傷得到明顯改善。早期4d過(guò)程中死亡率較高，且機(jī)體接種疫苗的免疫效果較差，抗A.baumannii的被動(dòng)免疫可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生較高的oprC抗體，介導(dǎo)體液免疫反應(yīng)，從而治療疾病。

綜上所述，本研究成功構(gòu)建并表達(dá)oprC重組蛋白，制備oprC蛋白多克隆抗體，并對(duì)oprC抗體的免疫保護(hù)效果做了初步探究，為A.baumannii基因工程重組疫苗奠定一定的基礎(chǔ)。