曾思良，潘 欣

1上海師范大學天華學院康復治療學系，上海 201815；2同濟大學附屬東方醫(yī)院再生醫(yī)學研究所，上海 200123

骨質(zhì)疏松是一種進展性的以破骨細胞介導的骨吸收與成骨細胞介導的骨生成之間失衡為特征的全身骨代謝障礙性疾病，近年來，抑制骨吸收、刺激骨生成的兩大策略構成了抗骨質(zhì)疏松、恢復骨吸收與骨生成動態(tài)平衡的理論基礎［1］。臨床上抑制骨吸收類藥物主要有雌激素、雙磷酸鹽類等，長期使用雌激素會引起多種并發(fā)癥而受限［2］；雙磷酸鹽類會增加食道潰瘍的發(fā)生，使用也受限［3］。甲狀旁腺素類似物是促進骨形成的藥物，持續(xù)應用會引起骨吸收增加的風險［4］。因此，迫切需要從天然資源中獲得高效低毒的新型候選藥物來治療骨質(zhì)疏松癥。

中醫(yī)藥治療骨質(zhì)疏松的方劑藥物種類繁多，針對中醫(yī)對骨質(zhì)疏松證候腎虛血瘀的描述，我們采用熟地黃、牛膝、龜板膠、鹿角膠、山藥、山茱萸、枸杞子、菟絲子、淫羊藿和女貞子等10味藥配伍補腎方中藥湯劑［5］。我們前期采用補腎方大鼠灌胃血清干預大鼠成骨細胞，可觀察到與骨形成信號通路相關調(diào)控信號高表達［6］；干預大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞，可降低其成脂分化［7］。本研究擬進一步采用Micro-CT技術對補腎方干預的骨質(zhì)疏松動物模型的骨骼標本進行體視學觀察。

Micro-CT是一種成熟的研究小動物骨骼和血管形態(tài)學的可視化方法［8］。Micro-CT將Ⅹ射線和計算機技術相結合，基于肌體不同組織成分對Ⅹ射線的不同吸收，產(chǎn)生機體的水平或軸向圖像，具有空間分辨率高、圖像采集時間短和整體成像能力強的優(yōu)點［9］。骨基質(zhì)中存在羥基磷灰石，是一種不透光的結締組織，在骨組織形態(tài)計量學中，動物骨骼可以在沒有脫鈣的情況下，Micro-CT可直接對礦化骨組織進行非破壞性的三維微結構研究［10］。血管屬于軟組織，對比度相對較低，必須使用造影劑來增強對比度，區(qū)分血管與周圍軟組織。Microfil是一種含有鉻酸鉛和硫酸鉛顆粒的可在血管系統(tǒng)中聚合的低粘度造影劑，可以充填血管網(wǎng)動脈側和靜脈側的毛細血管［11］。骨組織周圍血管化的形態(tài)學分析不僅對描述血管和骨組織之間的解剖和生理關系很重要，而且對理解影響骨微結構的許多病理條件發(fā)生的結構改變也很重要。既往有關中藥方治療骨質(zhì)疏松的研究，多單獨使用Micro-CT研究骨微結構，或單獨使用Micro-CT分析骨內(nèi)血管以探究其效能［12-13］。對于藥物設計中提及的健骨化瘀未給出直接的可視化數(shù)據(jù)，且暫無將骨組織周圍血管化的形態(tài)學分析納入分析評價的研究。本研究嘗試將骨微結構與骨周圍血管造影相結合，用影像學技術評價補腎方的藥效，探究補腎方活血化瘀通絡壯骨的緣由，為補腎方用于臨床治療骨質(zhì)疏松癥提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

12周齡雌性SD清潔級大鼠30只（中國科學院上海生命科學研究院動物實驗中心提供，許可證號：SYⅩK（滬）2018-0007），體質(zhì)量250～300 g。按嚙齒類動物標準飼料飼養(yǎng)于同濟大學動物實驗中心清潔級鼠房，分籠飼養(yǎng)。實驗過程中對動物的處置符合動物倫理學標準。

1.2 藥物與試劑

補腎方藥由熟地黃、菟絲子、牛膝、龜板膠、鹿角膠、山藥、山茱萸、枸杞子、淫羊藿和女貞子等藥物組成。注射用0.9%NaCl溶液（天津百特醫(yī)療用品有限公司），戊酸雌二醇（拜耳醫(yī)藥保健有限公司廣州分公司），堿性磷酸酶檢測試劑盒（北京雷根生物技術有限公司）。Microfil（Flow Tech）。

1.3 儀器

小動物Ⅹ射線計算機斷層成像Micro-CT 系統(tǒng)（Bruker，SkyScan 1176），小動物骨骼強度測定儀(濟南益延科技發(fā)展有限公司，YLS-16A），多功能酶標儀（Thermo，Varioskan Flash）。

1.4 動物分組及處理方法

12周齡雌性SD大鼠30只按隨機數(shù)字表法隨機分為3組，即生理鹽水對照組、補腎方干預組和戊酸雌二醇干預組，10只/組。造模方法采用咪達唑侖5 mg/kg加芬太尼0.05 mg/kg尾靜脈注射麻醉［14］。剃除大鼠背部兩腰側毛，用碘伏消毒大鼠術野皮膚，無菌操作下，腰側入路進入，分離暴露卵巢，摘除卵巢，縫合。同法摘除另一側卵巢。術中及術后過程中無死亡。造模OVⅩ大鼠繼續(xù)飼養(yǎng)12周后，備用。

根據(jù)人和動物體表面積折算的等效劑量比率表計算戊酸雌二醇、補腎方劑臨床等效劑量［15］。按60 kg成人30 mL/d、每日1劑補腎方換算，大鼠等效用藥劑量為每100 g大鼠體質(zhì)量0.27 mL，按照等倍于臨床等效劑量的標準將補腎方中藥煎煮至所需體積的溶液。戊酸雌二醇按照按60 kg成人1 mg/d、1片/d換算，大鼠等效用藥劑量為每100 g大鼠體質(zhì)量0.01 mg，依等倍于臨床等效劑量的標準將戊酸雌二醇片劑溶解懸浮于所需體積的注射用0.9%NaCl溶液中。連續(xù)30 d分別給予臨床等效劑量的戊酸雌二醇、補腎方灌胃，對照組灌服等體積注射用0.9%NaCl溶液。每只OVⅩ大鼠每日定時灌胃1次，3 mL/次，第30天給藥1 h后心臟取血。以3000 r/min離心15 min，分離血清，56 ℃水浴滅活30 min，血清經(jīng)0.2 μm濾器過濾，置-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 檢測指標

1.5.1 Micro-CT股骨骨微結構分析 動物心臟取血處死，分離后肢股骨，置70%乙醇固定1周，用0.9%NaCl溶液浸泡過夜后行Micro-CT掃描，分辨率18 μm，電壓65 kV，電流0.36 mA，濾光片0.5 mm Al。股骨掃描，從較低的生長板開始18 μm延伸1900層。重建三維結構和形態(tài)學測量，采用CTAn和CTVox軟件系統(tǒng)分析。三維形態(tài)參數(shù)包括骨密度（mg HA/mm3）、骨體積分數(shù)（%）、骨小梁數(shù)目（mm-1）、骨小梁厚度（mm）、骨小梁間隙（mm）和結構模型指數(shù)等。形態(tài)學分析參數(shù)取值范圍從生長板完全暴露為第1層開始延伸到110層。

1.5.2 骨力學分析 采用YLS-16A小動物骨骼強度測定儀測定大鼠股骨的骨折應力（股骨最大荷載）和壓碎力（骨結構強度）［16］。

1.5.3 血清堿性磷酸酶分析 采用對硝基苯磷酸二鈉基質(zhì)動力學法測定大鼠血清堿性磷酸酶［17］。

1.5.4 Micro-CT股骨周圍血管分布分析 為進一步探究補腎方活血化瘀、通絡壯骨的緣由，我們采用Microfil對大鼠全身進行了灌注。Microfil按說明書配置。含肝素（5 U/mL）的PBS緩沖液置37 ℃水浴鍋中預熱。將輸液管固定在蠕動泵中，一端置于PBS液面下，另一端接上24 G留置針頭，打開蠕動泵，使液體充盈管道。大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉（30 mg/kg）后，暴露心臟，將連接灌流液的24 G留置針插入左心室，打開蠕動泵電源，在右心房上做一切口以排出液體，開始全身灌流，流速2 mL/min，至各主要臟器不見血色。輸液管游離端置于Microfil 液面下，以0.25 mL/min 的流速灌注Microfil，至腸和腹壁上的血管充滿黃色Microfil，右心房排出黃色Microfil約5 mL時，關閉蠕動泵。結扎心臟主要血管，拔出針頭，將大鼠全身侵入4%多聚甲醛中室溫靜置約4 h，待Microfil固化，轉入4 ℃過夜使其進一步固化。次日取下腿部樣本（完整的脛骨、股骨及其骨骼?。?，置于SkyScan 1176 micro-CT（Bruker，Kontich，Begium）中，掃描參數(shù)：分辨率18 μm，電壓70 kV，電流200 μA，180°旋轉，旋轉步長0.4°，濾光片0.5 mm Al，binning 為2016×1344。掃描完成后，GPU NRecon Server(local)V1.7.4.2軟件對micro-CT掃描圖像進行結構重建，采用CT vox Version 3.3.1得到股骨周圍血管分布的Micro-CT三維圖像。

1.6 統(tǒng)計學分析

采用SAS JMP 16軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標準差表示，組間的差異行單因素方差分析，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。采用GraphPad Prism7軟件進行繪圖。

2 結果

2.1 大鼠股骨骨微結構的Micro-CT觀察

使用Micro-CT成像技術分析7月齡OVⅩ大鼠股骨骨量和骨微結構變化。分別選取注射用0.9%NaCl溶液干預對照組、補腎方干預組和戊酸雌二醇干預組距生長板第60層至第110層的50層橫切截面進行三維可視化重建，結果顯示補腎方干預組骨小梁結構明顯優(yōu)于其他兩組（圖1）。

分別從各組第1 層開始延伸到110 層進行三維重建，計算骨密度、骨體積分數(shù)、骨小梁數(shù)目、骨小梁厚度、骨小梁間隙和結構模型指數(shù)（圖2）。補腎方干預組的骨密度是對照組的1.36倍（P=0.0114），是戊酸雌二醇干預組的1.21倍（P=0.0501）。補腎方干預組的骨體積分數(shù)是對照組的2.92倍（P=0.0006），是戊酸雌二醇干預組的1.71倍（P=0.0063）。補腎方干預組的骨小梁數(shù)目是對照組的2.55倍（P=0.0016），是戊酸雌二醇干預組的1.52倍（P=0.022）。補腎方干預組的骨小梁厚度是對照組的1.15倍（P=0.005），是戊酸雌二醇干預組的1.13倍（P=0.0108）。補腎方干預組的骨小梁間隙是對照組的0.95 倍（P=0.5234），是戊酸雌二醇干預組的0.94 倍（P=0.4154）。補腎方干預組的結構模型指數(shù)是對照組的1.04倍（P=0.0551），是戊酸雌二醇干預組的1.06倍（P=0.0112）。

2.2 大鼠股骨骨力學檢測

補腎方干預組的股骨骨折應力是對照組的1.48倍（P=0.0044），是戊酸雌二醇干預組的1.21倍（P=0.0555）；補腎方干預組的壓碎力是對照組的1.07倍（P=0.4187），是戊酸雌二醇干預組的1.05倍（P=0.5435，圖3）。

2.3 血清堿性磷酸酶活性檢測

補腎方干預組的血清堿性磷酸酶活性是對照組的1.86倍（P=0.0014），是戊酸雌二醇干預組的1.66倍（P=0.003，圖4）。

2.4 大鼠股骨周圍血管分布Micro-CT觀察

使用Micro-CT成像技術分析7月齡OVⅩ大鼠腿骨（完整的脛骨、股骨及其骨骼?。┲車难芊植迹∕icrofil造影劑灌注血管），結果顯示補腎方干預組營養(yǎng)動脈及其分支顯示良好，股骨周圍血管體量明顯高于其他兩組。補腎方干預組的血管體積是對照組的2.28倍（P＜0.0001），是戊酸雌二醇干預組的1.89 倍（P=0.0002，圖5）。

3 討論

中醫(yī)藥在防治骨質(zhì)疏松癥方面歷史悠久，在中醫(yī)“川腎藏精，主骨生髓”理論指導下，根據(jù)“血瘀”、“腎虛”癥候，我們采用熟地黃、菟絲子、牛膝、龜板膠、鹿角膠、山藥、山茱萸、枸杞子、淫羊藿和女貞子等10味藥配伍了補腎方中藥湯劑。補腎方中的熟地黃為活血祛瘀類中藥，在臨床治療骨質(zhì)疏松癥驗方中高頻出現(xiàn)，梓醇、益母草苷、地黃苷A、地黃苷D為其主要有效成分［18］。牛膝活血通經(jīng)，其總皂苷、脫皮甾酮可促進成骨細胞增殖［19］。龜板膠主要成分為骨原膠，長于滋補肝腎之陰，具有顯著填精補髓之功，可促進骨髓間充質(zhì)干細胞增殖［20］。鹿角膠生精補髓，養(yǎng)血益陽，強筋健骨,散寒止痛［21］。淫羊藿為補骨壯陽中藥,可抑制骨髓間充質(zhì)干細胞的成脂分化，其黃酮類植物雌激素成分（如淫羊藿總黃酮、淫羊藿苷、淫羊藿甙均可促進骨形成，減少骨吸收）是淫羊藿發(fā)揮抗骨質(zhì)疏松藥理作用的主要有效成分。女貞子具有扶正固本、滋補肝腎、明目烏發(fā)之功效，100多種化合物中萜類（如齊墩果酸、熊果酸）、黃酮類是抗骨質(zhì)疏松作用的主要成分［22］。山藥中的薯蕷皂甙元有利于成骨細胞的增殖和分化［23］。山茱萸為滋陰益腎中藥，山茱萸總苷可有效抑制骨丟失，保存骨量［24］。枸杞子滋補肝腎，益精明目，枸杞多糖為其主要活性成分［25］。菟絲子溫腎益精，養(yǎng)肝明目，菟絲子黃酮為其主要有效成分，可抑制骨量丟失，改善骨密度［26］。由于補腎方成分復雜多樣，其改善骨質(zhì)疏松癥候的確切療效需要盡快做出整體評價。

骨質(zhì)疏松癥是一種以骨量降低和骨組織微結構破壞為特征，導致骨脆性增加和易于骨折的代謝性骨?。?7］。Micro-CT技術是一種無創(chuàng)性、安全的檢測手段，在很大程度上取代了破壞性的骨組織形態(tài)計量學方法，廣泛應用于骨組織微結構研究［12］。本研究結果提示，與對照組相比，OVⅩ大鼠經(jīng)補腎方干預4周后，Micro-CT分析顯示股骨骨微結構明顯改善，骨骼強度檢測顯示股骨骨折應力（股骨最大荷載）明顯加強，壓碎力（骨結構強度）有向好趨勢，血清堿性磷酸酶活性明顯升高。

在成年期，骨重塑和骨組織的血液供應緊密相關，二者被相同的細胞因子和生長因子所調(diào)控［28］。骨組織血管化的缺乏伴隨著骨形成的減少和骨質(zhì)量的下降［29］，有研究證實，絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松是由于骨組織內(nèi)血管系統(tǒng)功能障礙所引起，骨質(zhì)疏松病患的骨組織血液灌注明顯低于正常人［30］。目前，利用Microfil為造影劑研究的動物骨內(nèi)血管多采用灌注后脫鈣方法［13,31］，未見關注骨周圍附著肌肉的血管分布。為探尋補腎方在改善“血瘀”方面的效應，我們在完成Microfil造影劑對OVⅩ大鼠全身微血管鑄型后，未經(jīng)脫鈣，并在保留腿部肌肉組織的條件下進行了Micro-CT掃描，結果顯示補腎方干預組腿骨周圍血管數(shù)量明顯增多，營養(yǎng)動脈及其分支充盈顯示良好；生理鹽水和戊酸雌二醇干預組營養(yǎng)動脈分支多數(shù)消失，提示血管分支發(fā)生阻塞，在同等灌注條件下Microfil難以通過阻塞的血管分支形成影像。推測補腎方可能通過改善腿部血瘀，提高骨骼肌肉營養(yǎng)，達到改善骨質(zhì)疏松的目的。

綜上所述，骨微結構分析聯(lián)合骨周圍血管造影分析可判斷中藥方劑是否具備健骨化瘀功效，兩者聯(lián)合的micro-CT分析效果可提高骨質(zhì)疏松治療藥物的藥效判別率，為藥物進入臨床應用提供更為直觀可靠的實驗依據(jù)。