顏 論, 陳國建, 陳明飛, 游經(jīng)番, 彭姣姣, 程春紅

(長江師范學院生命科學與技術(shù)學院，重慶 408100)

泛素介導的蛋白降解系統(tǒng)是真核生物中廣泛存在的調(diào)節(jié)系統(tǒng)，具有蛋白降解效率高、專一性和選擇性強等特點，參與細胞周期調(diào)控、細胞分化、細胞程序性死亡和生物體對逆境脅迫的應答等[1-2].泛素蛋白酶體降解系統(tǒng)包含4個組分：泛素分子(ubiquitin, Ub)、泛素激活酶 E1(activating enzyme, E1)、泛素結(jié)合酶 E2(conjugating enzyme, E2)和泛素連接酶 E3(ligating enzyme, E3)[3-4].其中，SCF型的E3泛素連接酶是多亞基泛素連接酶中種類最多的一類，根據(jù)它們組分中的3個亞基即SKP1(s-phase kinase-associated protein 1)、CUL1(cullin 1 scaffold)和F-box蛋白來命名[5].其中，CUL1蛋白是復合體中的橋梁蛋白；F-box蛋白是復合體中的底物受體，負責特異性的識別靶蛋白；SKP1蛋白則負責將橋梁蛋白CUL1和受體蛋白F-box連接在一起，形成一個復合體發(fā)揮功能[6-7].F-box蛋白通過其N端的F-box domain和SKP1蛋白發(fā)生相互作用，而其C端的WD40基序或者富含亮氨酸重復區(qū)域LRR(Leucine-rich repeat)作為底物識別區(qū)域，特異性地靶作用底物蛋白.

SCF型E3泛素連接酶在植物逆境脅迫過程中具有重要作用.COI1編碼一個F-box蛋白，是茉莉酸的受體，能夠形成SCFCOI1復合體參與到茉莉酸信號通路中，調(diào)控茉莉酸介導的植物的發(fā)育和防御反應[8].F-box蛋白作為SCF型E3泛素連接酶復合體中的關(guān)鍵組分，在植物生長發(fā)育、激素信號傳導、花器官發(fā)育和自交不親和反應中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用.研究表明[9]，F(xiàn)-box蛋白AtPP2-B11可形成SCFAtPP2-B11復合體，通過促進蛋白激酶SnRK2.3的蛋白降解，調(diào)控植物對ABA的響應.擬南芥中過表達AtPP2-B11后，植株的抗旱性顯著降低，對鹽脅迫的耐受性提高[10-11].小麥TaFBA1編碼一個含有F-box結(jié)構(gòu)域的蛋白，能夠與SCF型E3泛素連接酶復合體中的其他成員互作，TaFBA1顯著受熱脅迫、ABA和干旱脅迫的誘導表達，在煙草中過表達TaFBA1后可以顯著提高植株對于熱脅迫、ABA和干旱脅迫的耐受性[12-13].

榨菜，又名莖瘤芥(Brassicajunceavar.tumida)，為十字花科蕓薹屬芥菜種葉芥亞種大葉芥變種的變種，是我國特有的蔬菜之一，其膨大莖是腌制榨菜的主要原料[14-15].榨菜作為世界三大名腌菜(涪陵榨菜、歐洲酸黃瓜和德國甜酸甘藍)之一，是中國名特產(chǎn)品.然而，榨菜在生長過程中常遭受非生物逆境脅迫(如低溫、鹽堿、干旱脅迫等)，制約瘤莖膨大，對其產(chǎn)量帶來影響，造成巨大經(jīng)濟損失[16-18].因此，挖掘榨菜抗逆基因，探究抗逆分子機制迫在眉睫.

在榨菜中篩選出AtPP2-B11的同源基因，將其命名為BjuFIP-1和BjuFIP-2，對其在非生物逆境脅迫處理下的基因表達模式進行分析，同時通過對BjuFIP-1和BjuFIP-2進行克隆，構(gòu)建了BjuFIP-GST原核表達載體，篩選出最佳誘導及純化條件，分離純化出大量純度較好的BjuFIP-GST融合蛋白，為后續(xù)深入研究BjuFIP調(diào)控底物蛋白降解，以及榨菜抗逆提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 試驗材料

大腸桿菌菌株DH5a、BL21、pGEX4T-1以及榨菜栽培品種 “永安小葉”為長江師范學院現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生物工程學院榨菜栽培生理試驗室保存.RNA提取試劑盒、RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR產(chǎn)物回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒，熒光定量PCR試劑盒購自杭州新景生物試劑開發(fā)有限公司.無縫克隆試劑盒Smart Assembly Cloning和Glutathione Beads購自常州天地人和生物科技有限公司.KOD FX購自TOYOBO公司.EcoRⅠ和BamHⅠ限制性內(nèi)切酶購自賽默飛世爾(中國)有限公司.

1.2 試驗方法

1.2.1 榨菜BjuFIP-1和BjuFIP-2基因的克隆及原核表達載體構(gòu)建 利用RNA提取試劑盒提取7 d的永安小葉幼苗總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA.在蕓薹屬數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站(http://brassicadb.cn/#/)中下載F-box蛋白編碼基因BjuFIP-1(BjuA043602)和BjuFIP-2(BjuB001057)的CDS序列.利用Primer 5軟件合成無縫克隆特異引物，含有BamHⅠ(上游引物)和EcoRⅠ(下游引物)酶切位點，上游引物BjuFIP-1/2-F：5′-GATCTGGTTCCGCGTGGATCCATGAATAATCTGCCAGAGGACTG-3′；下游引物BjuFIP-1-R：5′-CGGCCGCTCGAGTCGACCCGGGAATTCGGGCAGTACTGGCCTAATCTC-3′；下游引物BjuFIP-2-R：5′-CGGCCGCTCGAGTCGACCCGGGAATTCGGGCAGTAGTGGCCTAATCTCC-3′.PCR產(chǎn)物回收目的片段后，與BamHⅠ和EcoRⅠ線性化的大載體pGEX4T-1進行無縫克隆連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)，重組質(zhì)粒通過菌落PCR和酶切鑒定正確后，送華大基因有限公司測序.將測序正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達菌株BL21，菌落PCR鑒定正確后，進行蛋白誘導檢測.

1.2.2 蛋白誘導時間及溫度的優(yōu)化 將含有重組質(zhì)粒BjuFIP-1-GST和BjuFIP-2-GST的BL21大腸桿菌分別接種于LB培養(yǎng)基中(100 mg·L-1氨芐霉素)，37 ℃ 220 r·min-1振蕩培養(yǎng)過夜，按照1∶100比例接種擴培，37 ℃ 220 r·min-1振蕩培養(yǎng)至D600 nm為0.4～0.6，加入IPTG(終濃度1 mmol·L-1)，分別進行16 ℃誘導過夜，25 ℃誘導0、3、5 h以及37 ℃誘導0、3、5 h，分別離心收集菌體，進行SDS-PAGE電泳分析.

1.2.3 蛋白的可溶性分析 將BL21重組菌進行16 ℃ 220 r·min-1誘導過夜及37 ℃ 220 r·min-1誘導3 h，離心收集菌體，用10 mL GST binding buffer重懸，加入DTT(終濃度1 mmol·L-1)，溶菌酶(終濃度200 mg·mL-1)以及PMSF(終濃度0.5 mmol·L-1)，混勻，冰上孵育30 min后超聲破碎至溶液清亮.4 ℃ 12 000 r·min-1離心30 min后收集上清和沉淀，進行SDS-PAGE電泳分析.

1.2.4 融合蛋白的純化 在最佳誘導條件下誘導蛋白，超聲破碎，收集超聲后上清，用平衡液GST binding buffer(140 mmol·L-1NaCl，2.7 mmol·L-1KCl，10 mmol·L-1Na2HPO4，1.8 mmol·L-1KH2PO4，pH 7.4，10 mmol·L-1DTT)平衡Glutathione beads 3次.將0.45 μmol·L-1濾膜過濾后的上清置于含有Glutathione beads的親和層析柱內(nèi)，室溫緩慢旋轉(zhuǎn)孵育1 h.GST binding buffer洗滌3遍后，使用GST elution buffer(50 mmol·L-1Tris-HCl，10 mmol·L-1還原型谷胱甘肽，pH 8.0，10 mmol·L-1DTT)進行洗脫，每次洗脫室溫孵育15 min后收集洗脫液，共洗脫3～4次，得到的洗脫液即為純化后的目的蛋白，SDS-PAGE電泳及Western blot檢測蛋白純化效果.

1.2.5 基因表達模式檢測 將7 d的榨菜幼苗分別施加低溫(4 ℃)、高溫(37 ℃)、50 μmol·L-1ABA、200 mmol·L-1NaCl以及300 mmol·L-1Mannitol處理，分別在處理后0、3、6、12和24 h進行取樣.在RNA提取及cDNA反轉(zhuǎn)錄后進行BjuFIP表達模式分析.采用杭州新景生物試劑開發(fā)有限公司的熒光定量PCR試劑盒以及Roche LC480熒光定量PCR儀進行表達分析，反應體系與程序參照試劑說明.采用比較CT(循環(huán)閾值)法計算轉(zhuǎn)錄豐度，以BjuActin3作為內(nèi)參，試驗重復3次，每個樣品設3個重復.定量引物如下BjuFIP-1-qPCR-F：5′-CTTCTTCTCCCTCGTCCATAAC-3′；BjuFIP-1-qPCR-R：5′-CTAGCAGCCATCATGTAGCA-3′.BjuFIP-2定量引物BjuFIP-2-qPCR-F：5′-CACTTCTTACCTTCCGAGTTCC-3′；BjuFIP-2-qPCR-R：5′-CGTGGAGAAGAAGAGGGTAATG-3′.BjuActin3定量引物BjuActin3-qPCR-F：5′-GGCTACTCTTTCACCACGAC-3′；BjuActin3-qPCR-R：5′-GGATACCAGCATTCTCCATAC-3′.

1.2.6 BjuFIP蛋白序列及啟動子順式作用元件分析 采用Clustal X軟件對BjuFIP-1，BjuFIP-2以及AtPP2-B11蛋白序列進行分析.采用在線分析軟件PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)以及New PLACE(https://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/?action=newplace)對BjuFIP-1和BjuFIP-2的啟動子順式作用元件進行分析.采用在線分析軟件SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)對BjuFIP蛋白結(jié)構(gòu)域進行分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 BjuFIP基因原核表達載體的構(gòu)建

利用BjuFIP-1和BjuFIP-2上下游特異引物進行PCR擴增獲得771 bp(編碼256個氨基酸)的BjuFIP-1和BjuFIP-2蛋白編碼序列(圖1A).將目的載體pGEX4T-1經(jīng)BamHⅠ和EcoRⅠ線性化后，分別與回收純化的BjuFIP-1和BjuFIP-2目的片段進行無縫克隆連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài).陽性克隆進行菌落PCR以及酶切鑒定，在771 bp處均可切出目的條帶(圖1B和圖1C).質(zhì)粒送公司測序，測序正確的重組質(zhì)粒命名為BjuFIP-1-GST和BjuFIP-2-GST.

A：BjuFIP-1和BjuFIP-2蛋白編碼序列PCR擴增；B：BjuFIP-1-GST 和BjuFIP-2-GST原核表達載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)DH5a后菌落PCR鑒定；C：BjuFIP-1-GST和BjuFIP-2-GST質(zhì)粒雙酶切鑒定.M：DL2000 DNA Marker;1：BjuFIP-1基因;2：BjuFIP-2基因;3～6：BjuFIP-1-GST菌落PCR鑒定;7～10：BjuFIP-2-GST菌落PCR鑒定;11：BjuFIP-1-GST重組質(zhì)粒EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切;12：BjuFIP-2-GST重組質(zhì)粒EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切.

2.2 誘導溫度及誘導時間對融合蛋白表達量的影響

將重組質(zhì)粒BjuFIP-1-GST和BjuFIP-2-GST分別轉(zhuǎn)化BL21并進行菌落PCR鑒定.選擇鑒定正確的單克隆菌株，分別進行16 ℃過夜小量誘導，25 ℃小量誘導0、3、5 h以及37 ℃小量誘導0、3、5 h.SDS-PAGE電泳結(jié)果表明，不同溫度以及不同時間的誘導條件下均可誘導出55 ku的BjuFIP-GST融合蛋白，并且隨著誘導時間的增加，融合蛋白的表達量逐漸增高(圖2).通過蛋白誘導條件篩選，16、25、37 ℃均可誘導出BjuFIP-GST融合蛋白，因此分別選取16 ℃過夜以及37 ℃誘導3 h條件進行蛋白的誘導，為后續(xù)進行融合蛋白的可溶性分析提供材料.

A：16 ℃；B：25 ℃；C：37 ℃.M：Marker.1：BjuFIP-1-GST誘導0 h;2：BjuFIP-1-GST過夜誘導;3：BjuFIP-2-GST誘導0 h;4：BjuFIP-2-GST過夜誘導;5：BjuFIP-1-GST誘導0 h;6：BjuFIP-1-GST誘導3 h;7：BjuFIP-1-GST誘導5 h;8：BjuFIP-2-GST誘導0 h;9：BjuFIP-2-GST誘導3 h;10：BjuFIP-2-GST誘導5 h；11：BjuFIP-1-GST誘導0 h;12：BjuFIP-1-GST誘導3 h;13：BjuFIP-1-GST誘導5 h;14：BjuFIP-2-GST誘導0 h;15：BjuFIP-2-GST誘導3 h;16：BjuFIP-2-GST誘導5 h.

2.3 BjuFIP-GST融合蛋白的可溶性及純化

將16 ℃過夜以及37 ℃誘導3 h的BjuFIP-1-GST蛋白和16 ℃過夜誘導的BjuFIP-2-GST蛋白收集菌體后進行超聲波破碎，離心收集上清和沉淀進行SDS-PAGE電泳分析.結(jié)果表明，BjuFIP-1-GST融合蛋白在37 ℃雖然誘導量高，但大部分在沉淀中以包涵體的形式存在，以可溶性蛋白形式存在于菌液裂解后的上清中很少，不能進行后續(xù)蛋白純化試驗；在16 ℃的誘導條件下BjuFIP-1-GST和BjuFIP-2-GST融合蛋白誘導量也高，也有較多的蛋白以可溶性蛋白的形式存在于菌液裂解后的上清中，能用于進行后續(xù)的純化試驗(圖3A).因此，選擇16 ℃過夜誘導條件下的蛋白超聲破碎上清液進行后續(xù)蛋白純化.

A：BjuFIP-GST融合蛋白的可溶性分析；B：SDS-PAGE電泳檢測BjuFIP-GST融合蛋白純化情況；C：Western blot檢測BjuFIP-GST融合蛋白純化情況.M：marker;1：BjuFIP-1-GST在37 ℃誘導3 h后的裂解上清;2：BjuFIP-1-GST在37 ℃誘導3 h后的裂解沉淀;3：BjuFIP-1-GST在16 ℃過夜誘導后的裂解上清;4：BjuFIP-1-GST在16 ℃過夜誘導后的裂解沉淀;5：BjuFIP-2-GST在16 ℃過夜誘導后的裂解上清;6：BjuFIP-2-GST在16 ℃過夜誘導后的裂解沉淀；7：16 ℃過夜誘導條件下BjuFIP-1-GST純化蛋白;8：16 ℃過夜誘導條件下BjuFIP-2-GST純化蛋白;9：16 ℃過夜誘導條件下BjuFIP-1-GST純化蛋白;10.16 ℃過夜誘導條件下BjuFIP-2-GST純化蛋白.

將16 ℃誘導過夜，離心收集的菌體進行超聲波破碎，離心后的上清置于含有Glutathione beads的親和層析柱內(nèi)，室溫緩慢旋轉(zhuǎn)孵育1 h，通過3次洗滌和3次洗脫，獲得了大量分子質(zhì)量為55 ku的純度較好的BjuFIP-1-GST和BjuFIP-2-GST融合蛋白(圖3B).采用western blot技術(shù)，對純化的BjuFIP-1-GST和BjuFIP-2-GST融合蛋白進行檢測，可以觀察到GST抗體能夠檢測出目的條帶，且條帶單一，表明獲得了大量純度較好的BjuFIP-1-GST和BjuFIP-2-GST融合蛋白(圖3C).

2.4 BjuFIP序列、蛋白結(jié)構(gòu)域及BjuFIP啟動子順式作用元件

BjuFIP-1(BjuA043602)和BjuFIP-2(BjuB001057)分別與AtPP2-B11間具有高達84%和83%的蛋白同源性.基因結(jié)構(gòu)分析結(jié)果表明，BjuFIP含有3個外顯子和2個內(nèi)含子，蛋白結(jié)構(gòu)上在N端含有1個F-box結(jié)構(gòu)域，說明該蛋白很可能作為SCF型泛素E3連接酶發(fā)揮功能.對莖瘤芥BjuFIP基因家族啟動子上的順式作用元件進行分析，發(fā)現(xiàn)在BjuFIP-1和BjuFIP-2的啟動子上含有ABA響應元件ABRE motif(ABA response)，說明BjuFIP可能被ABA誘導表達，同時在它們的啟動子上還含有在干旱響應過程中起重要作用的MBS(drought response)作用元件、脅迫及防御響應元件TC rich repeat(defense and stress response)以及茉莉酸信號通路響應元件CGTCA motif(MeJA response)，說明BjuFIP在ABA、干旱以及其他逆境脅迫條件下能夠被誘導表達，同時在ABA等逆境脅迫信號通路中具有重要功能(圖4).

A.BjuFIP-1啟動子順式作用元件;B.BjuFIP-2啟動子順式作用元件.

2.5 BjuFIP在非生物逆境脅迫下基因表達模式

在非生物逆境脅迫下對候選基因進行熒光定量分析的結(jié)果表明，在低溫(4 ℃)、高溫(37 ℃)、50 μmol·L-1ABA、200 mmol·L-1NaCl以及300 mmol·L-1Mannitol處理下，與0 h相比，BjuFIP-2基因表達水平都受到顯著誘導，并且該基因的表達水平隨著低溫、高溫以及Mannitol處理時間的延長，一直被顯著誘導表達，而在ABA和NaCl處理下，隨著時間的延長，BjuFIP-2的表達水平先上升后下降；BjuFIP-1基因表達水平只在低溫(4 ℃)、高溫(37 ℃)和200 mmol·L-1NaCl的誘導下顯著表達，并且BjuFIP-1的表達水平隨著低溫和NaCl的誘導，表現(xiàn)出先上升后下降的表達趨勢(圖5).研究結(jié)果說明，BjuFIP-2在榨菜響應低溫、高溫、ABA、NaCl 以及干旱脅迫過程中具有作用，而BjuFIP-1卻只在低溫、高溫和鹽脅迫下具有一定的功能(圖5).

A：4 ℃處理；B：37 ℃處理；C：50 μmol·L-1 ABA處理；D：200 mmol·L-1 NaCl處理；E：300 mmol·L-1 Mannitol處理.“***”代表P<0.001.

3 討論與結(jié)論

莖瘤芥其膨大瘤莖是制作榨菜的主要原材料，然而在其生長發(fā)育過程中常遭受非生物逆境脅迫(如鹽堿，凍害等)和生物逆境脅迫(如根腫菌等)的影響，制約瘤莖膨大，嚴重制約榨菜產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展.榨菜BjuFIP-1和BjuFIP-2在擬南芥中的同源基因為AtPP2-B11.擬南芥F-box蛋白AtPP2-B11可以形成SCF型E3泛素連接酶復合體，作為ABA信號通路中的負調(diào)控因子，通過促進ABA信號通路中蛋白激酶SnRk2.3的降解，來調(diào)控ABA信號通路，從而介導植物對非生物逆境脅迫的響應[9].擬南芥中過表達AtPP2-B11后，植株的抗旱性顯著降低，對鹽脅迫的耐受性提高，表明AtPP2-B11調(diào)控植物對逆境脅迫的影響[10-11].榨菜BjuFIP-1和BjuFIP-2作為AtPP2-B11的同源基因，與其具有相似的基因結(jié)構(gòu)和相同的F-box結(jié)構(gòu)域，很可能也參與調(diào)控榨菜對逆境脅迫的響應.為了進一步研究BjuFIP的生物學功能，本研究對BjuFIP啟動子順式作用元件以及在逆境脅迫下BjuFIP的基因表達模式進行了分析，構(gòu)建了BjuFIP原核表達載體，優(yōu)化蛋白誘導條件，并獲得了大量純度較好的BjuFIP-GST融合蛋白.

為了研究不同誘導溫度以及不同誘導時間對BjuFIP-GST蛋白表達的影響，分別采用16 ℃誘導過夜，25 ℃誘導0、3、5 h以及37 ℃誘導0、3、5 h的處理，SDS-PAGE電泳結(jié)果表明，不同誘導溫度以及誘導時間均可誘導出融合蛋白.然而對其誘導蛋白超聲破碎后檢測結(jié)果表明，37 ℃誘導的BjuFIP-1-GST蛋白絕大多數(shù)以包涵體的形式存在，而16 ℃誘導的BjuFIP蛋白較多的以可溶性蛋白形式存在，因此本試驗最終選取16 ℃誘導過夜作為BjuFIP-GST融合蛋白的最佳誘導條件.

本試驗對BjuFIP啟動子進行順式作用元件分析，采用熒光定量PCR技術(shù)對BjuFIP在低溫(4 ℃)、高溫(37 ℃)、50 μmol·L-1ABA、200 mmol·L-1NaCl 以及300 mmol·L-1Mannitol的脅迫處理下的基因表達模式進行分析，構(gòu)建BjuFIP-1-GST和BjuFIP-2-GST原核表達載體，篩選最佳蛋白誘導條件，以及通過含有Glutathione beads的親和層析柱獲得了大量純度較高的BjuFIP-GST融合蛋白，為后續(xù)研究BjuFIP下游互作蛋白及其生物學功能奠定了研究基礎.