代紅梅, 劉志朋, 張 霞, 楊 忠, 曾日彬, 王 配, 常勇誠, 霍金龍

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650201；2.呂梁學(xué)院生命科學(xué)系，山西 呂梁 033001；3.云南生物制藥有限公司，云南 昆明 650503)

GSKIP(GSK3β interaction protein)，也稱GSK3β結(jié)合蛋白，是結(jié)合絲氨酸/蘇氨酸激酶(PKA)的A激酶錨定蛋白AKAP家族成員[1]，在包括心、肝、腎、肺、皮膚、卵巢、子宮、胎盤、前列腺、睪丸、肌肉、骨骼、結(jié)腸、直腸等人體組織中廣泛表達(dá)[2]，且在無脊椎動物到脊椎動物中均高度保守[3].GSKIP還是糖原合成酶激酶3β的相互作用蛋白[4]，包含蛋白激酶A調(diào)節(jié)亞基結(jié)合(PKA-RII)域和GSK3β相互作用域，能直接與蛋白激酶(PKA)和糖原合成激酶3β(GSK3β)結(jié)合以調(diào)節(jié)PKA和GSK3β的活性[5]，其全長蛋白和C端片段均可以不同的方式阻止已引發(fā)和未引發(fā)底物的磷酸化[4].GSKIP作為GSK3β的負(fù)調(diào)控因子參與Wnt信號通路[6]，通過負(fù)調(diào)節(jié)GSK3β可增強(qiáng)Wnt誘導(dǎo)的信號傳導(dǎo)，從而維持β-catenin的穩(wěn)定性和核積累[7]，β-catenin的細(xì)胞核積累可激活經(jīng)典Wnt信號通路[8]，該通路是一種高度保守的細(xì)胞間信號通路，在細(xì)胞周期進(jìn)程、胚胎發(fā)育、穩(wěn)態(tài)的維持、免疫調(diào)節(jié)和受損組織的再生等不同生物過程中起關(guān)鍵作用[9]，與癌癥、阿爾茨海默癥、2型糖尿病和帕金森等疾病有關(guān)[10].GSKIP還通過與GSK3β相互作用促進(jìn)β-連環(huán)蛋白的不穩(wěn)定磷酸化，以及通過PKA介導(dǎo)的β-連環(huán)蛋白的穩(wěn)定性磷酸化微調(diào)Wnt信號通路[7].GSKIP在氧化應(yīng)激下具有促生存和抗氧化功能[11]，可通過抑制GSK3β增強(qiáng)Nrf2活化，從而保護(hù)心肌細(xì)胞免受缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激，是心臟保護(hù)的分子靶點(diǎn)[12].GSKIP在cAMP/PKA/Drp1信號軸中作為錨定蛋白與GSK3β一起發(fā)揮作用，以調(diào)節(jié)Drp1磷酸化，并與線粒體的伸長和裂變有關(guān)[13]，此外，GSKIP還參與cAMP/GSKIP/GSK3/PKA/Tau軸信號傳導(dǎo)，并在阿爾茨海默癥的發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用，GSKIP產(chǎn)生的磷酸化Tau可作為阿爾茨海默癥潛在的生物標(biāo)志物[14].GSKIP還是家族性骨髓增生性腫瘤的易感基因[15]，GSKIP的生殖系重復(fù)易于發(fā)展為具有常染色體顯性遺傳的家族性骨髓增殖性腫瘤，GSKIP過表達(dá)可增強(qiáng)巨核細(xì)胞祖細(xì)胞的分化[16-17]、增加SHSY-5Y神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的β-連環(huán)蛋白依賴性增殖[18]，GSKIP還被證明與肝細(xì)胞癌的腫瘤發(fā)生和化學(xué)抗性有關(guān)[19].在小鼠中，GSKIP的缺失會引起腭架融合的發(fā)育缺陷，最終導(dǎo)致小鼠胚胎早期致死[1].

版納微型豬近交系(banna mini-pig inbred line, BMI)是培育了42年的高度近交系封閉群體，其基因高度純合、遺傳背景清楚，生理生化、解剖和疾病發(fā)生機(jī)理等與人類極為相似，是生命科學(xué)研究的良好試驗(yàn)動物模型[20].基于GSKIP組織表達(dá)的廣泛性和功能的重要性，本試驗(yàn)以BMI為研究對象，克隆GSKIP編碼區(qū)序列，分析其分子特征，利用生物信息學(xué)對其進(jìn)行功能分析，注釋基因并構(gòu)建其睪丸ceRNA轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)一步構(gòu)建其PPI蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)，為深入探究GSKIP基因在BMI睪丸中的功能奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)樣品及處理

屠宰3頭來自昆明原種豬場的12月齡版納微型豬近交系公豬并取睪丸組織，經(jīng)液氮速凍后，利用RNA提取試劑(TaKaRa：9767)獲得睪丸組織總RNA，用核酸蛋白測定儀檢測RNA的濃度及純度，用瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，合格樣品用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa：6210A)反轉(zhuǎn)錄為第一鏈cDNA并儲存于-20 ℃冰箱備用.

1.2 基因擴(kuò)增及序列測定

利用NCBI數(shù)據(jù)庫豬GSKIP序列(登錄號：NM_001243496)設(shè)計(jì)特異引物(F：TCCGGAGGGAAGAAGAGGAC；R：CCTGCGATGACCATATGCAA)，以BMI睪丸cDNA為模板擴(kuò)增GSKIP基因全長編碼區(qū).反應(yīng)體系25 μL：Premix TaqTM12.5 μL，10 μmol·L-1GSKIP上下游引物各1 μL，25 ng·μL-1cDNA 1 μL，H2O 9.5 μL；擴(kuò)增程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，循環(huán)30次；72 ℃ 10 min.擴(kuò)增產(chǎn)物送昆明擎科生物公司測序.

1.3 GSKIP的功能注釋和ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

利用Uniprot進(jìn)行GO(gene ontology)功能注釋；利用課題組之前獲得的版納微型豬近交系睪丸RNA-seq數(shù)據(jù)進(jìn)行miRNA和lncRNA分析；使用miRanda 3.3和RNAhybrid 2.1.2軟件分析潛在調(diào)控GSKIP的miRNA和lncRNA，并用Cytoscape 3.8.2繪制可視化ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò).

1.4 GSKIP功能分析

使用NCBI的ORFfinder查找分析GSKIP的開放閱讀框；用ProtParam程序預(yù)測GSKIP蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量、分子式、等電點(diǎn)、正負(fù)電荷殘基數(shù)；使用SOPMA、ProtScale和Prosite分別預(yù)測GSKIP蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)、疏水結(jié)構(gòu)和功能位點(diǎn)；通過TMHMM 2.0和SignalP 5.0工具分別預(yù)測GSKIP蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)和信號肽；使用MEGA-X軟件構(gòu)建GSKIP蛋白的多物種系統(tǒng)發(fā)育樹.

1.5 GSKIP相互作用蛋白PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

用Weblogo工具對GSKIP多物種結(jié)構(gòu)域區(qū)的氨基酸序列進(jìn)行保守性分析，用String 11.5進(jìn)行蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 GSKIP基因特征信息

利用GSKIP引物擴(kuò)增GSKIP基因的完整編碼區(qū)(CDS)及部分非編碼區(qū)(UTR)，獲得543 bp的產(chǎn)物(圖1)，編碼139個氨基酸(圖2).GSKIP基因全長20 630 bp，含4個外顯子和3個內(nèi)含子(圖3A).開放閱讀框(ORF)分析表明，存在6個ORF，其中全長開放閱讀框ORF1(即完整CDS區(qū))420 bp為正確的編碼ORF(圖3B)，含有1個保守結(jié)構(gòu)域DUF727(圖3C).

M為DL2000 DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，1為GSKIP PCR產(chǎn)物.

雙下劃線表示起始密碼子，單劃線為保守結(jié)構(gòu)域DUF727(33～133位氨基酸)，*表示終止密碼子；上一行字母為核酸序列，對應(yīng)的下一行為其編碼的氨基酸序列.

A：染色體位置；B：開放閱讀框；C：蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域.

2.2 豬GSKIP功能注釋及ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

對豬GSKIP進(jìn)行功能注釋發(fā)現(xiàn)，在細(xì)胞組分(cellular component)方面，主要定位于細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核.在分子功能(molecular function)方面，主要涉及蛋白激酶結(jié)合、激酶調(diào)節(jié)活性、蛋白質(zhì)結(jié)合、β-catenin結(jié)合、蛋白激酶抑制劑活性、蛋白激酶A調(diào)節(jié)亞基結(jié)合.在生物學(xué)過程(biological process)方面，主要涉及調(diào)節(jié)Wnt信號通路、響應(yīng)氧化應(yīng)激的內(nèi)在凋亡信號通路、正調(diào)控Wnt信號通路、蛋白激酶的負(fù)調(diào)控(圖4).ceRNA網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)：豬GSKIP主要受5個miRNA的靶向調(diào)控(圖4).并且有7個lncRNAs與GSKIP競爭性結(jié)合ssc-miR-181a，3個lncRNAs與GSKIP競爭性結(jié)合ssc-miR-181b，5個lncRNAs與GSKIP競爭性結(jié)合ssc-miR-181c，6個lncRNAs與GSKIP競爭性結(jié)合ssc-miR-335，2個lncRNAs與GSKIP競爭性結(jié)合ssc-miR-664-5p(圖4).

圖4 GSKIP的功能注釋及潛在的ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

2.3 GSKIP蛋白質(zhì)序列及結(jié)構(gòu)分析

豬GSKIP蛋白質(zhì)分子質(zhì)量15.59 ku，分子式C672H1042N182O227S9，等電點(diǎn)4.19，負(fù)電荷殘基為26，正電荷殘基為10.GSKIP蛋白質(zhì)139個氨基酸的二級結(jié)構(gòu)中α螺旋占比最多，包含61個氨基酸；無規(guī)則卷曲次之，包含51個氨基酸；延伸鏈19個氨基酸；β轉(zhuǎn)角最少，有13個氨基酸(圖5A).GSKIP蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)分析表明(圖5B)，第44位氨基酸具有最大疏水值2.022，第71位處具有最小疏水值-2.211，N端和C端均疏水.含有酶磷酸化、亮氨酸富集的核輸出信號.不含信號肽和跨膜結(jié)構(gòu).

A：二級結(jié)構(gòu)；B：三級結(jié)構(gòu).

2.4 GSKIP多物種氨基酸序列同源性

8個哺乳動物GSKIP氨基酸序列分析表明，版納微型豬近交系與綿羊(XP_027813176.1)、牛(NP_001071524.1)、羊駝(XP_006213965.1)、大鼠(XP_00624058)、土撥鼠(KAF7464783.1)、人(BAA91380.1)、恒河猴(NP_001181120.1)的同源性分別為93.8%、93.1%、92.4%、90.3%、89.0%、92.4%、93.1%，同源性均≥89%.豬與綿羊、牛、羊駝聚為一大支，大鼠與土撥鼠聚為一支，人和恒河猴聚為一支，表明豬GSKIP與綿羊、牛、羊駝在進(jìn)化上關(guān)系最近(圖6).結(jié)構(gòu)域分析表明，豬GSKIP氨基酸33～133位點(diǎn)處的DUF727結(jié)構(gòu)域在不同物種間的氨基酸差異位點(diǎn)僅24個(圖7)，說明DUF727結(jié)構(gòu)域在哺乳動物間保守性較高.

圖6 GSKIP氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹

A：氨基酸保守性；B：差異分析.

2.5 GSKIP蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(PPI)分析顯示，BMI GSKIP與10個蛋白可能存在相互作用，包括GSK3β、GSK3α、ATG2A、ATG2B、NBR1、ZNF10、ENSSSCG00000002499、EPB41L3、PRUNE、AKAP11，其中與GSK3β作用關(guān)系最強(qiáng)(圖8).

線表示不同蛋白質(zhì)之間的相互作用，線越多置信度越高.

3 討論

本試驗(yàn)利用BMI睪丸cDNA擴(kuò)增獲得了GSKIP基因序列543 bp，其中，CDS序列420 bp，編碼139個氨基酸，序列提交GenBank獲得基因登錄號為OL449474.GSKIP含有1個功能域DUF727，是根據(jù)不同物種的蛋白質(zhì)的序列相似性引入，這些蛋白質(zhì)可能是GSKIP的直系同源物[21]，在BMI中對應(yīng)于GSKIP氨基酸的33～133位.GSKIP在L130保留了1個具有25個氨基酸的區(qū)域，與Axin的GSK3β相互作用域(GID)同源，在V41/L45處保留了PKA RII結(jié)合位點(diǎn)[22].GSKIP和GSK3β之間通過GID的相互作用在脊椎動物和無脊椎動物中高度保守，而它與PKA RII亞基的相互作用僅限于脊椎動物，這表明它僅在脊椎動物中作為AKAP起作用[5].8種動物GSKIP氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明，共分為靈長目、嚙齒目和偶蹄目三支，其中BMI與綿羊、牛聚在一起，并與羊駝聚為一大類，屬于偶蹄目，與物種的系統(tǒng)分一致，并且8種哺乳動物GSKIP氨基酸序列同源性均≥89%，說明GSKIP在進(jìn)化上具有高度的保守性和序列同源性.

競爭性內(nèi)源RNA(competing endogenous RNA, ceRNA)，可通過競爭共享的microRNAs(miRNAs)調(diào)節(jié)其他RNA轉(zhuǎn)錄本[23].對BMIGSKIP基因功能注釋及潛在ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖分析表明，有5個潛在的miRNAs靶向調(diào)控GSKIP，分別是ssc-miR-181a、ssc-miR-181b、ssc-miR-181c、ssc-miR-335和miR-644-5p.其中，ssc-miR-181a、ssc-miR-181b和ssc-miR-181c均來源于mir-181家族，mir-181家族基因通過調(diào)節(jié)腫瘤相關(guān)基因的表達(dá)與多種腫瘤的發(fā)生相關(guān)，miR-181a不僅參與細(xì)胞增殖、生長、維持、存活和死亡[24]，還是T細(xì)胞敏感性和選擇的內(nèi)在調(diào)節(jié)劑，在T細(xì)胞發(fā)育過程中充當(dāng)內(nèi)在抗原敏感性“變阻器”[25].miR-181b是慢性淋巴細(xì)胞白血病進(jìn)展的生物標(biāo)志物[26]，此外，miR-181b可通過靶向人類癌細(xì)胞系中的BCL2調(diào)節(jié)多藥耐藥性[27].mir-181c-5p能夠通過靶向GSKIP基因抑制宮頸鱗狀細(xì)胞的癌細(xì)胞特征和侵襲特性[28].ssc-miR-335來源于mir-335家族，miR-335調(diào)控人間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖、遷移和分化[29].miR-664-5p控制肌細(xì)胞生成中的SRF和經(jīng)典的Wnt/β-catenin信號通路[30].miR-644-5p通過靶向細(xì)胞p53抑制卵巢顆粒細(xì)胞凋亡，提示miR-644-5p有治療卵巢功能早衰和恢復(fù)卵巢功能的潛力[31].

蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果表明，GSKIP與GSK3β、GSK3α、ATG2A、ATG2B、NBR1、ZNF10、ENSSSCG00000002499、EPB41L3、PRUNE、AKAP11等10個蛋白存在相互作用.其中，ENSSSCG00000002499還未注釋基因名字；GSK3β與GSK3α是哺乳動物中糖原合成激酶3(GSK3)的2個亞型，它們具有90%以上相同的催化結(jié)構(gòu)域[32].GSKIP被鑒定為GSK3β相互作用蛋白，其與GSK3β相互作用參與了經(jīng)典的Wnt信號通路，GSKIP作為GSK3β的負(fù)調(diào)控因子，是GSK3β的良好底物，GSK3β參與了胚胎發(fā)育、細(xì)胞周期進(jìn)程、糖原代謝和免疫調(diào)節(jié)等不同生物過程的調(diào)節(jié)，GSK3β失調(diào)與癌癥、阿爾茨海默癥(AD)、2型糖尿病、雙相情感障礙、心臟肥大炎癥和帕金森病等多種疾病相關(guān)[33-37].GSK3α的活性受到Wnt信號傳導(dǎo)的調(diào)節(jié)與GSK3β類似[38].GSK3β和GSK3α都在精子中表達(dá)，但GSK3α的表達(dá)超過GSK3β[39]，而在其他組織中都是GSK3β的表達(dá)超過GSK3α[40]，在精子中GSK3α和GSK3β的絲氨酸磷酸化與其運(yùn)動性成正比[39].ATG2A和ATG2B是哺乳動物中Atg2的直向同源物，Atg2可引發(fā)細(xì)胞自噬，是吞噬細(xì)胞增殖所必需的，在酵母中其可將隔離膜的邊緣鏈接到內(nèi)置網(wǎng)，并介導(dǎo)脂質(zhì)從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)移，使隔離膜擴(kuò)張，在人類中，ATG2A和ATG2B都具有脂質(zhì)轉(zhuǎn)移活性[41-42]，并且ATG2B參與降解前與溶酶體融合的自噬體的形成[17].NBR1對于熱誘導(dǎo)的自噬囊泡的形成是必須的[43]，并且是調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞異質(zhì)性和轉(zhuǎn)移性疾病的關(guān)鍵決定因素[44]，其自噬降解可限制乳腺腫瘤進(jìn)展過程中的轉(zhuǎn)移生長[45].ZNF10可通過β-catenin信號通路促進(jìn)乳腺浸潤性導(dǎo)管癌的癌變和進(jìn)展[46].ZNF10通過與NF-κB和Sp1結(jié)合模體的相互作用抑制HIV-1 LTR活性[47].EPB41L3在維持神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞結(jié)合以及髓鞘的節(jié)點(diǎn)排列方面發(fā)揮作用，EPB41L3可與CD44的C端結(jié)合并將信號傳輸?shù)郊?xì)胞骨架，它與阿爾茨海默癥的生物標(biāo)志物呈負(fù)相關(guān)，并且是多種癌癥的候選腫瘤抑制基因[48].PRUNE在細(xì)胞運(yùn)動及中樞神經(jīng)系統(tǒng)的正確發(fā)育中起重要作用，其基因突變會引起小頭畸形、皮質(zhì)和小腦萎縮并伴隨整體發(fā)育遲緩等的復(fù)合神經(jīng)發(fā)育障礙[49]，此外，PRUNE還是nm23-H1的負(fù)調(diào)節(jié)因子[50].AKAP11蛋白在精子發(fā)生和成熟精子中高表達(dá)，并有助于生殖細(xì)胞和體細(xì)胞的細(xì)胞周期控制[51]，它還能與蛋白激酶A(PKA)的調(diào)節(jié)亞基結(jié)合，將PKA限制在細(xì)胞中的離散位置，以靶向特定底物進(jìn)行磷酸化和去磷酸化，此外，AKAP11的選擇性自噬激活cAMP/PKA以促進(jìn)線粒體代謝和腫瘤細(xì)胞生長[52].這些與GSKIP相互作用蛋白的發(fā)現(xiàn)，為進(jìn)一步研究GSKIP的功能提供了依據(jù).