李 文, 李建安, 陳小梅, 李成悅, 尚娟娥, 魁小花, 楊宏娟, 曾志芳, 馬翠蘭, 邱棟梁

(1.福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院，福建 福州 350002；2.古田縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局經(jīng)濟(jì)作物站，福建 寧德 352200)

芽變是體細(xì)胞突變的一種，既是植物產(chǎn)生新變異的豐富源泉，也是果樹(shù)選育新品種的一種簡(jiǎn)易而有效的方法.果樹(shù)芽變是一種遺傳物質(zhì)變異，而DNA分子標(biāo)記技術(shù)以蛋白質(zhì)、核酸分子的突變作為基礎(chǔ)，能夠檢測(cè)生物的遺傳結(jié)構(gòu)及其變異.目前，分子標(biāo)記技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于桃[1-2]、棗[3]、葡萄[4]、杧果[5]、杏[6]、李[7]、楊桃[8]等果樹(shù)遺傳多樣性分析、品種鑒定、遺傳圖譜構(gòu)建、基因定位及克隆中.簡(jiǎn)單重復(fù)序列間擴(kuò)增(inter-simple sequence repeat, ISSR)是通過(guò)PCR技術(shù)，對(duì)相隔不遠(yuǎn)的SSR序列間的基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增的分子標(biāo)記技術(shù)，因其引物與試驗(yàn)易設(shè)計(jì)、操作簡(jiǎn)單、成本低、效率高、多態(tài)性高、適用更廣泛等優(yōu)點(diǎn)深受科研工作者青睞[9]；相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性(sequence-related amplified polymorphism, SRAP)是一種基于PCR反應(yīng)，通過(guò)獨(dú)特的引物設(shè)計(jì)對(duì)可讀框進(jìn)行擴(kuò)增的分子標(biāo)記技術(shù)[10]，具有穩(wěn)定、簡(jiǎn)便、在基因組中均勻分布、克隆目標(biāo)片段方便等優(yōu)點(diǎn).Huang et al[11]研究表明，隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)DNA(RAPD)、簡(jiǎn)單重復(fù)序列(SSR)、反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子間擴(kuò)增多態(tài)性(IRAP)和反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子微衛(wèi)星擴(kuò)增多態(tài)性(REMAP)等4種分子標(biāo)記方法不能區(qū)分‘砂糖橘’及其芽變株‘無(wú)籽砂糖橘’，僅有少數(shù)ISSR和SRAP引物獲得了特異性條帶，說(shuō)明了這兩種分子標(biāo)記方法在鑒定芽株系中的可行性.分子標(biāo)記在桃及其芽變株系的鑒定中發(fā)揮著重要作用.如：孫淑霞等[12]通過(guò)ISSR、SSR標(biāo)記分析結(jié)合物候期觀察及果實(shí)性狀，比較了‘北京28號(hào)’桃及其芽變材料的親緣關(guān)系；李海炎等[13]采用SRAP分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)‘川中島’桃及其芽變株系的遺傳關(guān)系進(jìn)行了鑒定；文露等[1]通過(guò)ISSR和SRAP兩種分子標(biāo)記技術(shù)，對(duì)‘皮球桃’及其黃肉芽變變異株進(jìn)行了鑒定.

桃在自然和栽培條件下具有較高的芽變頻率，其品種(系)多，存在親緣關(guān)系不詳或同物異名的問(wèn)題.‘韋端蜜紅’桃是福建省寧德市古田縣吉巷鄉(xiāng)韋端村1994年定植的‘頤紅’桃芽變優(yōu)良單株的無(wú)性系后代，具有晚熟、果大、肉脆、味甜、植株抗流膠病等優(yōu)良性狀.本研究以‘韋端蜜紅’和‘頤紅’等6份桃材料為研究對(duì)象，利用ISSR和SRAP分子標(biāo)記技術(shù)，分析其在遺傳上的相似性與差異性，進(jìn)一步探討其親緣關(guān)系，旨在為該種質(zhì)的收集、利用及推廣應(yīng)用提供參考.

1 材料與方法

1.1 材料

供試的6份桃材料信息如表1所示，采集時(shí)間為2019年6月.選取新鮮嫩葉，放進(jìn)自封袋中，置于冰上，帶回實(shí)驗(yàn)室，經(jīng)液氮速凍后置于冰箱(-80 ℃)中保存.供試的6份晚熟桃品種(系)分別采自福建省寧德市古田縣鳳埔鄉(xiāng)巒垅村的福建省益康園農(nóng)場(chǎng)有限公司(簡(jiǎn)稱‘益康園’)、湖南省懷化市的芷江侗族自治縣康瑞農(nóng)生態(tài)農(nóng)業(yè)有限公司(簡(jiǎn)稱‘康瑞農(nóng)’)、福建省寧德市古田縣吉巷鄉(xiāng)韋端村(簡(jiǎn)稱‘韋端村’).C4是以芷江‘頤紅’為接穗，毛桃為砧木嫁接而來(lái).

1.2 方法

1.2.1 桃葉片DNA的提取 采用改良的 CTAB 法提取桃葉片DNA，參照孫月婷等[14]的方法并進(jìn)行改進(jìn)，提取的DNA置于冰箱(-20 ℃)保存?zhèn)溆?

1.2.2 ISSR-PCR擴(kuò)增 20 μL體系總體積包括：10 μL 2×easy taq PCR Super Mix(+dye)(北京全式金生物技術(shù)有限公司)、0.3 μmol·L-1引物(福州尚亞生物技術(shù)有限公司)、50 ng·μL-1DNA模板，用ddH2O補(bǔ)充至20 μL.PCR擴(kuò)增程序設(shè)置為：94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性30 s，52 ℃(退火溫度因引物不同而有所不同)退火45 s，72 ℃延伸90 s，循環(huán)35次；而后于72 ℃延伸7 min；最后置4 ℃保存.在1%瓊脂糖凝膠中用1×TAE緩沖液進(jìn)行電泳分離，之后用JS-3000全自動(dòng)凝膠成像分析儀(上海培清科技有限公司)進(jìn)行拍照分析.

1.2.3 SRAP-PCR擴(kuò)增 25 μL體系總體積包括：12.5 μL 2×easy taq PCR Super Mix(+dye)(北京全式金生物技術(shù)有限公司)、0.5 μmol·L-1引物(福州尚亞生物技術(shù)有限公司)、80 ng·μL-1DNA模板，加ddH2O補(bǔ)充至25 μL.PCR擴(kuò)增程序設(shè)置為：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性1 min，35 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，循環(huán)5次；而后于94 ℃變性1 min，50 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，循環(huán)35次；最后于72 ℃延伸10 min.PCR擴(kuò)增結(jié)束后保持12 ℃，最后置4 ℃保存.在1.5%瓊脂糖凝膠中用1×TAE緩沖液進(jìn)行電泳分離，之后用JS-3000全自動(dòng)凝膠成像分析儀(上海培清科技有限公司)進(jìn)行拍照分析.

1.2.4 引物篩選 根據(jù)已經(jīng)優(yōu)化好的體系，選用高純度DNA樣品為模板，ISSR引物參照哥倫比亞大學(xué)(UBC)公布的第9套引物序列進(jìn)行篩選，根據(jù)前人的研究結(jié)果[12,15-18]，選擇55 條引物進(jìn)行篩選，用退火溫度范圍內(nèi)較為合適的溫度進(jìn)行PCR擴(kuò)增；SRAP引物參考前人研究的結(jié)果[10,19-20]，選擇12條正向引物與14條反向引物進(jìn)行交叉篩選，以獲得適合的引物.

1.3 數(shù)據(jù)處理

參考孫月婷等[14]的方法，建立二元矩陣，構(gòu)建聚類樹(shù)狀圖并分析遺傳相似系數(shù).

2 結(jié)果與分析

2.1 6份桃材料的ISSR分析

2.1.1 引物篩選與多態(tài)性分析 采用篩選出的17條多態(tài)性好、穩(wěn)定性高、條帶清晰的ISSR引物對(duì)6份桃材料進(jìn)行PCR擴(kuò)增，最終共擴(kuò)增出91條DNA條帶，其中，多態(tài)性條帶18條，多態(tài)百分率為19.78%.ISSR引物擴(kuò)增結(jié)果及其多態(tài)性如表2所示.17條引物平均擴(kuò)增出5.35條條帶，能有效區(qū)分‘韋端蜜紅’與‘頤紅’.引物UBC855的擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖1，UBC880的擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖2，可以發(fā)現(xiàn)‘韋端蜜紅’出現(xiàn)了不同于‘頤紅’的多態(tài)性條帶.

圖1 ISSR引物UBC855擴(kuò)增6份桃材料的電泳圖譜

2.1.2 聚類分析 用非加權(quán)組平均法(unweighted pair-group method with arithmetic means, UPGMA)進(jìn)行聚類分析，得到了6份桃材料的聚類樹(shù)狀圖(圖3)，其相似系數(shù)為0.88～0.94.當(dāng)以相似系數(shù)0.92為閾值時(shí)分為兩類，第一類包含‘韋端蜜紅’(C1、C2、C3)，第二類包含芷江‘頤紅’(C4、C5)和古田‘頤紅’(C6)，此時(shí)可將‘韋端蜜紅’與‘頤紅’區(qū)分.

圖3 基于ISSR標(biāo)記的6份桃材料的UPGMA聚類樹(shù)狀圖

2.1.3 遺傳相似系數(shù)分析 采用Ntsys-pc 2.10e軟件計(jì)算6份桃材料之間的遺傳相似系數(shù)，結(jié)果(表3)顯示，‘韋端蜜紅’與‘頤紅’間的遺傳相似系數(shù)為0.844 4～0.943 2，平均遺傳相似系數(shù)為0.900 6.‘韋端蜜紅’(C1、C2、C3)間的遺傳相似系數(shù)為0.931 0～0.943 2，芷江‘頤紅’(C4、C5)與古田‘頤紅’(C6)間的遺傳相系數(shù)為0.918 6～0.941 2，遺傳相似程度均較高.

表3 基于ISSR標(biāo)記的6份桃材料之間的遺傳相似系數(shù)

2.2 6份桃材料的SRAP分析

2.2.1 引物篩選與多態(tài)性分析 17對(duì)SRAP引物共擴(kuò)增出85條DNA條帶，其中，多態(tài)性條帶21條，多態(tài)百分率為24.71%.SRAP引物擴(kuò)增結(jié)果及其多態(tài)性如表4所示.17對(duì)引物平均擴(kuò)增出5條條帶，可將‘韋端蜜紅’與‘頤紅’區(qū)分.引物me1/em8的擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖4，me4/e11的擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖5，可以發(fā)現(xiàn)‘韋端蜜紅’在不同引物中均出現(xiàn)了不同于‘頤紅’的多態(tài)性條帶.

圖4 SRAP引物me1/em8擴(kuò)增6份桃材料的電泳圖譜

表4 SRAP引物及其產(chǎn)物多態(tài)性

2.2.2 聚類分析 使用UPGMA方法進(jìn)行聚類分析，得到6份桃材料的聚類樹(shù)狀圖(圖6)，其相似系數(shù)為0.85～0.94.當(dāng)以相似系數(shù)0.89為閾值時(shí)分為兩類，第一類包含‘韋端蜜紅’(C1、C2、C3)，第二類包含芷江‘頤紅’(C4、C5)和古田‘頤紅’(C6)，此時(shí)可將‘韋端蜜紅’與‘頤紅’區(qū)分.

圖6 基于SRAP標(biāo)記的6份桃材料的UPGMA聚類樹(shù)狀圖

2.2.3 遺傳相似系數(shù)分析 采用Ntsys-pc 2.10e軟件計(jì)算6份桃材料之間的遺傳相似系數(shù)為0.807 2～0.935 9，平均遺傳相似系數(shù)為0.870 0(表5).‘韋端蜜紅’(C1、C2、C3)間的遺傳相似系數(shù)為0.898 7～0.935 9，芷江‘頤紅’(C4、C5)與古田‘頤紅’(C6)間的遺傳相系數(shù)為0.881 6～0.910 3，均具有較高的遺傳相似系數(shù).

表5 基于SRAP標(biāo)記的6份桃材料之間的遺傳相似系數(shù)

2.3 6份桃材料的ISSR與SRAP聯(lián)合分析

2.3.1 聚類分析 采用UPGMA方法對(duì)ISSR和SRAP數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析，得到6份桃材料的聚類樹(shù)狀圖(圖7)，其相似系數(shù)為0.86～0.94.當(dāng)以相似系數(shù)0.90為閾值時(shí)，可將6份桃材料分為兩類，第一類包含‘韋端蜜紅’(C1、C2、C3)，第二類包含芷江‘頤紅’(C4、C5)和古田‘頤紅’(C6)，此時(shí)可將‘韋端蜜紅’與‘頤紅’區(qū)分.

圖7 基于ISSR和SRAP標(biāo)記的6份桃材料的UPGMA聚類樹(shù)狀圖

2.3.2 遺傳相似系數(shù)分析 采用Ntsys-pc 2.10e軟件計(jì)算6份桃材料之間的遺傳相似系數(shù)為0.826 6～0.939 4，平均遺傳相似系數(shù)為0.886 0(表6).‘韋端蜜紅’(C1、C2、C3)間的遺傳相似系數(shù)為0.915 7～0.939 4，芷江‘頤紅’(C4、C5)與古田‘頤紅’(C6)間的遺傳相系數(shù)為0.901 2～0.926 4，均具有較高的遺傳相似系數(shù).

表6 基于ISSR和SRAP標(biāo)記的6份桃材料之間的遺傳相似系數(shù)

3 討論與結(jié)論

ISSR分子標(biāo)記具有RAPD、SSR分子標(biāo)記的較高多態(tài)性、較少的非特異性擴(kuò)增和操作簡(jiǎn)捷的特點(diǎn)；而SRAP在保持RAPD、AFLP優(yōu)點(diǎn)的基礎(chǔ)上，更具穩(wěn)定和簡(jiǎn)單的特點(diǎn).本研究比較ISSR、SRAP擴(kuò)增的總條帶數(shù)和多態(tài)性條帶比率，發(fā)現(xiàn)ISSR擴(kuò)增條帶總數(shù)為91條，多于SRAP的擴(kuò)增條帶總數(shù)85條；而SRAP標(biāo)記多態(tài)性為24.71%，高于ISSR標(biāo)記，此結(jié)果與前人[21-23]在其他植物進(jìn)行的遺傳多樣性研究結(jié)果相一致.通過(guò)比較ISSR、SRAP分子標(biāo)記的遺傳相似系數(shù)范圍，發(fā)現(xiàn)SRAP所揭示的遺傳相似系數(shù)范圍(0.807 2～0.935 9)廣于ISSR分子標(biāo)記(0.844 4～0.943 2)，SRAP相對(duì)于ISSR而言能反映較多的遺傳信息，檢測(cè)到種質(zhì)間較高的遺傳差異，Huang et al[11]和陳大霞等[24]也得出了相類似的結(jié)論.‘韋端蜜紅’和‘頤紅’等6份桃材料的擴(kuò)增電泳結(jié)果顯示所有材料之間具有相同的主擴(kuò)增帶，說(shuō)明桃品種(系)間具有一定的同源性，同時(shí)在DNA水平上存在差異.ISSR呈顯性遺傳因子，不能直接區(qū)分顯性純合基因型和雜合基因型[25]，而SRAP則是共顯性標(biāo)記，二者的擴(kuò)增序列和原理均存在差別，將ISSR和SRAP標(biāo)記結(jié)合使用，可以達(dá)到優(yōu)缺點(diǎn)互補(bǔ)的目的，也可以增加基因組的覆蓋面積，實(shí)現(xiàn)更完整的遺傳多樣性分析[26-27].ISSR、SRAP聯(lián)合分析發(fā)現(xiàn)，在以相似系數(shù)0.90為閾值時(shí)可區(qū)分‘韋端蜜紅’和‘頤紅’.ISSR、SRAP及其聯(lián)合分析的結(jié)果具有較好的一致性，其聚類結(jié)果均顯示，相似系數(shù)為0.89～0.92時(shí)‘韋端蜜紅’與‘頤紅’被分為兩個(gè)組，而在相似系數(shù)小于0.85時(shí)則聚為同一組，說(shuō)明‘頤紅’與‘韋端蜜紅’之間在具有較高遺傳相似度的同時(shí)也存在一定的遺傳差異.

陳小梅等[28]對(duì)‘韋端蜜紅’、‘頤紅’的感官品質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)進(jìn)行了測(cè)定，發(fā)現(xiàn)‘韋端蜜紅’和‘頤紅’的花期均集中在3月中上旬，‘頤紅’的成熟期在7月10—30日，而‘韋端蜜紅’的成熟期在7月20日至8月10日，比‘頤紅’晚10～15 d成熟；‘韋端蜜紅’果大(平均單果重206.58 g)且果頂微凸，果實(shí)有縫合線且較明顯，而‘頤紅’果小(平均單果重190.50 g)且果頂深凹，果實(shí)縫合線不明顯；‘韋端蜜紅’的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)高于‘頤紅’.

綜上所述，ISSR、SRAP標(biāo)記及其聯(lián)合分析均顯示‘韋端蜜紅’與‘頤紅’在遺傳背景上有較高的相似性，在DNA水平上又存在一定的差異，物候期、外觀形態(tài)等也存在一定的差異，說(shuō)明‘韋端蜜紅’是由‘頤紅’芽變而來(lái)，是一個(gè)新的晚熟桃優(yōu)良種質(zhì)資源.