史沛青，鄭艷茹，陳 暉,2，王軒棟，韓明明，施小寧,3,*

（1.甘肅中醫(yī)藥大學藥學院，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅中醫(yī)藥大學理化實驗中心，甘肅 蘭州 730000；3.甘肅省中醫(yī)藥研究中心，甘肅 蘭州 730000）

桉葉精油是桃金娘科（Myrtaceae）桉屬（Eucalyptus）桉樹葉的油腺細胞分泌物，主要成分為萜烯類和醇類化合物，有廣譜抑菌性和抗氧化性，已被廣泛應用于食品、化妝品、香料和制藥領域。桉葉精油對人畜安全，低濃度可殺死食品中的微生物，開發(fā)桉葉精油抑菌劑備受關(guān)注。但桉葉精油易揮發(fā)，易氧化，穩(wěn)定性差，功效持續(xù)時間短，不耐儲藏保存，限制了其在食品、藥品、化妝品等領域的應用。提高精油穩(wěn)定性常用的方法有脂質(zhì)化技術(shù)、環(huán)糊精包合技術(shù)、微囊化技術(shù)和微乳化技術(shù)，其中微乳化技術(shù)由于操作簡便而被廣泛應用。

Pickering乳液是一種以固體粒子替代傳統(tǒng)表面活性劑穩(wěn)定乳液體系的新型乳液。相比傳統(tǒng)乳劑，其具有高抗聚結(jié)穩(wěn)定性、低毒性和可生物相容性等特點，對改善植物精油的穩(wěn)定性具有良好的應用優(yōu)勢。Pickering乳液制備使用的固體粒子按來源有天然粒子（如植物蛋白、天然多糖和黏土礦物等）和合成粒子（如石墨烯、SiO、TiO

等）。由于天然粒子較合成粒子更綠色無毒、價格低廉，在食品級Pickering乳液制備方面應用更廣。羧甲基殼聚糖（carboxymethyl chitosan，CMCS）作為殼聚糖的兩性衍生物，可水溶，有良好抑菌活性、生物相容性和生物降解性，使其更適用于生物活性物質(zhì)遞送系統(tǒng)。但是由于CMCS的強親水特性，使其無法單獨作為穩(wěn)定劑制備Pickering乳液。Xie Bing等以CMCS與納米微纖絲為穩(wěn)定劑，制備了可食性的蜂蠟水基Pickering乳液，可用于水果和蔬菜保鮮。

凹凸棒黏土（attapulgite，APT）是一種天然層鏈狀含水富鎂鋁硅酸鹽黏土礦物，具有獨特的納米棒狀形貌，外表面凹凸相間，比表面積大，有良好的吸附性與抑菌性能，是醫(yī)藥工業(yè)中優(yōu)良的藥用輔料，可直接穩(wěn)定或改性穩(wěn)定Pickering乳液。APT在穩(wěn)定Pickering乳液方面，主要取決于其棒晶結(jié)構(gòu)、負電性以及表面的活性基團特性。為使APT納米粒子實現(xiàn)對桉葉精油滴的吸附包封，本研究通過油酸鈉物理吸附對APT表面潤濕性適當改性，與CMCS鏈自組裝協(xié)同穩(wěn)定制備桉葉精油Pickering乳液，通過乳液靜置乳析和乳滴顯微形貌考察影響乳液穩(wěn)定性的各因素，獲得最佳制備條件，并對比考察桉葉精油和其乳液對革蘭氏陽性菌的抑制活性和緩釋抑菌性能，為該乳劑在食品、藥品、化妝品等領域的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

桉葉精油 江西恒誠天然香料油有限公司；CMCS和尼羅紅（純度≥95.0%） 上海麥克林生化科技有限公司；APT 江蘇鼎邦礦產(chǎn)品科技有限公司；油酸鈉（化學純） 上海試劑一廠；LB瓊脂 上海博微生物科技有限公司；金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌及黃曲霉菌 上海保藏生物技術(shù)中心。

1.2 儀器與設備

HR-6B型高速剪切乳化機 上海滬析實業(yè)有限公司；SB25-12DTD型超聲波清洗儀 寧波新芝生物科技股份有限公司；HY-4型調(diào)速多用振蕩器 江蘇榮華儀器制造有限公司；UV8100A型紫外-可見分光光度計北京萊伯泰科儀器股份有限公司；JL-1198型納米激光粒度儀 成都精新粉體測試設備有限公司；Gemini HR型流變儀 英國馬爾文儀器有限公司；BX53型生物顯微鏡 日本Olympus公司；SPX-400L型生化培養(yǎng)箱上海龍躍儀器設備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 油酸鈉改性APT（M-APT）納米粒子制備及結(jié)構(gòu)表征

將1.00 g APT按固液質(zhì)量比1∶20用電動攪拌機在800 r/min下均勻分散于蒸餾水中，用0.1 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)懸浮液pH 4，然后置于60 ℃水浴中，加入2.0%油酸鈉（按APT加入量計算），超聲作用1 h，過濾，固體物用50 ℃蒸餾水充分洗滌，洗去表面可洗脫的油酸鈉后冷凍干燥，備用。

傅里葉紅外光譜分析：采用KBr壓片法，在4 000～400 cm波長范圍內(nèi)掃描，設置分辨率為2 cm。

粒徑測定：以蒸餾水為分散介質(zhì)，使用納米激光粒度儀對油酸鈉改性前后APT的粒徑進行測定，分散介質(zhì)折射率1.330，測試溫度25 ℃。

三相接觸角θ測定：用壓片機將APT樣品壓成13 mm×2 mm的圓柱形片劑，在樣品表面滴2 μL蒸餾水，平衡10 s后，用像片量角法測定其θ值。

1.3.2 M-APT/CMCS協(xié)同穩(wěn)定桉葉精油Pickering乳液制備

稱取一定量CMCS，用去離子水配成質(zhì)量分數(shù)分別為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%和2.5%的溶液，調(diào)節(jié)pH值為6.0，完全排除其中氣泡，備用；稱取一定量M-APT，超聲分散制備質(zhì)量分數(shù)分別為0.05%、0.10%、0.15%、0.20%和0.30%的懸浮液，備用。

量取一定體積的桉葉精油，加入5 mL一定質(zhì)量分數(shù)的M-APT懸浮液，用高速剪切乳化機10 000 r/min分散1 min，靜置30 min，使M-APT納米粒子充分在油滴表面吸附平衡后再加入5 mL一定質(zhì)量分數(shù)的CMCS溶液，同樣高速剪切分散1 min，即得M-APT/CMCS協(xié)同穩(wěn)定的桉葉精油Pickering乳液。

尼羅紅油相標記的乳液制備方法與上述相同，需提前在桉葉精油中加入0.1 mL 1%的尼羅紅溶液。

1.3.3 M-APT/CMCS協(xié)同穩(wěn)定桉葉精油Pickering乳液表征

將1.3.2節(jié)所制乳液倒入沉降瓶中（約10 mL），拍照記錄其在不同靜置時間（1、5、10、15、30 d）的外觀分層和表面油析狀況；乳液穩(wěn)定性以乳析指數(shù)（cream index，CI）表征。

式中：V為乳化相體積/mL；V為乳液總體積/mL。

乳滴微觀形貌用生物顯微鏡觀察，用Image J軟件計算乳滴粒徑分布（選取乳滴約300 個）；通過用尼羅紅對油相熒光標記，在277 nm激發(fā)波長下驗證M-APT/CMCS對桉葉精油滴的協(xié)同包裹作用；通過流變學剪切速率及表觀黏度參數(shù)，對不同CMCS質(zhì)量分數(shù)（0.5%、1.0%、2.0%和2.5%）的Pickering乳液樣品的流變學特性進行表征。黏彈性模量在0.5 Hz條件下0～100 Pa范圍內(nèi)測量；存儲模量（G’）和損耗模量（G”）在1 Pa條件下0.1～100 Hz范圍內(nèi)測量。

1.3.4 桉葉精油Pickering乳液抑菌性能考察

1.3.4.1 抑菌圈直徑（diameters of inhibition zones，DIZ）的測定

將100 μL菌濃度為10～10CFU/mL的菌懸液均勻涂布在LB瓊脂培養(yǎng)基上。無菌條件下，用直徑為6 mm的無菌槍頭在含菌培養(yǎng)基上打孔。以無菌水為空白對照，向孔內(nèi)加入一定體積的桉葉精油和乳液（控制乳液中精油含量與純精油體積一致）。將培養(yǎng)皿置于37 ℃生物培養(yǎng)柜中培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結(jié)束，用十字交叉法測量各DIZ。每個菌種均重復實驗3 次，取平均值。

1.3.4.2 最小抑菌濃度（minimal inhibitory concentration，MIC）的測定

將一系列不同濃度的桉葉精油Pickering乳液與100 μL菌濃度為10CFU/mL的菌懸液室溫混勻，然后將其均勻涂布于LB瓊脂培養(yǎng)基上，置于37 ℃生物培養(yǎng)柜中培養(yǎng)24 h。以不生長菌樣品的最低濃度作為桉葉精油乳劑對該菌的MIC值。每個菌種測試至少重復3 次，取其平均值。

1.3.4.3 桉葉精油Pickering乳液抑菌動力學測定

以金黃色葡萄球菌為受試菌種，通過LB肉湯培養(yǎng)，將菌種濃度調(diào)整為5×10CFU/mL。然后將菌懸液轉(zhuǎn)移到離心管中，分別加入桉葉精油和桉葉精油乳劑，控制使二者中桉葉精油質(zhì)量濃度為1.5 μL/mL。陰性對照為只含有LB肉湯和金黃色葡萄球菌樣。上述菌懸液在恒溫搖床（37 ℃）上150 r/min振搖孵育不同時間（0.25、0.5、1、2、3、6、12 h）后用紫外分光光度計在600 nm波長處測定金黃色葡萄球菌生存OD值。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 油酸鈉改性APT表征

圖1 APT（a）、油酸鈉（b）和M-APT（c）的傅里葉變換紅外光譜圖Fig. 1 FTIR spectra of APT (a), sodium oleate (b) and modified APT (c)

如圖1所示，譜線a中3 551 cm和1 655 cm處為APT表面O—H的伸縮和彎曲振動吸收峰，1 197 cm和984 cm處為APT晶體結(jié)構(gòu)中Si—O—Si的特征峰，這些峰在M-APT譜線（c）中繼續(xù)出現(xiàn)。譜線b中2 972 cm和2 865 cm處油酸鈉分子鏈中的—CH、—CH—的C—H伸縮振動吸收峰和1 552 cm和1 449 cm處—COO的特征吸收峰也均原位出現(xiàn)在M-APT譜線（c）中，這說明油酸鈉對APT的改性為物理吸附改性。

圖2 油酸鈉改性APT前（a）和改性后（b）的三相接觸角Fig. 2 Three-phase contact angle of APT before (a) and after (b)modification by sodium oleate

圖3 APT改性前后粒徑分布Fig. 3 Particle size distribution of APT and M-APT

固體粒子潤濕性及粒徑大小對Pickering乳液穩(wěn)定性影響至關(guān)重要。從圖2可知，原始APT θ為15.2°，親水性很強，不能直接用于穩(wěn)定Pickering乳液，改性后θ為83.7°，有利于吸附在油滴表面。從圖3可知，油酸鈉物理吸附改性對APT納米粒子粒徑影響不大，其平均粒徑約為84.7 nm。

2.2 影響桉葉精油Pickering乳液穩(wěn)定性因素

Pickering乳液的穩(wěn)定性受多種因素的影響，包括固體粒子表面潤濕性、粒子用量、油/水體積比等。為克服油酸鈉改性APT表面親水性不足，采用親水性CMCS鏈與M-APT協(xié)同作用穩(wěn)定桉葉精油Pickering乳液，單因素法考察M-APT、CMCS用量及桉葉精油體積分數(shù)對乳液靜置穩(wěn)定性、乳滴粒徑和微觀形貌的影響。

2.2.1 M-APT用量對乳液靜置穩(wěn)定性及乳滴粒徑的影響

Pickering乳液是通過固體粒子在油滴表面的不可逆吸附并形成空間屏障以防止乳滴聚結(jié)。固定CMCS質(zhì)量分數(shù)2.0%、油相體積分數(shù)30%，考察不同M-APT質(zhì)量分數(shù)乳液的靜置穩(wěn)定性，如圖4所示。當M-APT質(zhì)量分數(shù)小于0.10%，體系經(jīng)高速剪切分散，靜置30 min后，即發(fā)生乳析，這主要是因為M-APT量較少時，體系中沒有足夠的固體粒子吸附在油滴表面，油滴和水相的CMCS溶液親和作用弱，油滴合并變大，從水相中析出。而當M-APT質(zhì)量分數(shù)不小于0.15%時，足夠的M-APT納米粒子均勻不可逆吸附于油滴表面，并與CMCS鏈靜電吸引，形成穩(wěn)定的Pickering乳液，即使放置60 d仍可保持穩(wěn)定。

圖4 不同M-APT質(zhì)量分數(shù)桉葉精油乳液在不同靜置時間的外觀形貌圖Fig. 4 Appearance of eucalyptus leaf essential oil Pickering emulsion stabilized with different concentrations of M-APT

M-APT用量對乳滴分布和粒徑大小也有重要影響。由圖5可知，隨M-APT質(zhì)量分數(shù)增加，乳滴粒徑減??；當M-APT為0.15%時，其平均粒徑最小，為3.67 μm，粒徑分布范圍也比較窄；當隨著M-APT質(zhì)量分數(shù)進一步增加，乳滴粒徑略有增大，這主要是因為較多的M-APT吸附在油滴周圍，即吸附層增厚，乳滴粒徑增大。為了進一步證明M-APT納米粒子在油滴表面的吸附作用，預先將百里香精油用尼羅紅染色，對比觀察乳液滴在明場和熒光顯微鏡下微觀形貌，可明顯看到紅色油滴表面吸附淡黃色的M-APT包裹層（圖6）。

圖5 不同M-APT質(zhì)量濃度乳液滴顯微形貌圖及相應粒徑分布計算圖Fig. 5 Micromorphology and particle size distribution of emulsion droplets stabilized with different concentrations of M-APT

圖6 乳液滴在明場（a）和熒光（b）顯微鏡下的微觀形貌Fig. 6 Micromorphology of emulsion droplets observed under bright field (a) and fluorescence (b) microscope

2.2.2 CMCS用量對乳液靜置穩(wěn)定性及乳滴粒徑的影響

固定M-APT質(zhì)量分數(shù)0.15%、油相體積分數(shù)30%。由圖7可知，CMCS質(zhì)量分數(shù)對乳滴粒徑無明顯影響，其大小集中在（3.56±0.31） μm之間；CMCS質(zhì)量分數(shù)主要影響乳液靜置穩(wěn)定性。當CMCS質(zhì)量分數(shù)小于1.5%時，乳液在靜置3 d后發(fā)生明顯乳析；而CMCS質(zhì)量分數(shù)不小于2.0%時，乳液CI接近1.0，即使靜置60 d仍保持穩(wěn)定。這主要是因為親水性的CMCS大分子鏈在乳液體系中纏繞自組裝，其鏈上的—NH與M-APT表面吸附的油酸鈉—COO靜電吸引，或二者氫鍵作用，形成三維網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)穩(wěn)定M-APT包裹的精油滴。當其用量較少時，不足以形成三維網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)，表面親水作用弱的M-APT粒子包裹的精油滴易合并變大，發(fā)生乳析。

圖7 不同CMCS質(zhì)量分數(shù)乳液滴平均粒徑（a）和靜置時間CI值（b）Fig. 7 Average particle size of emulsion droplets with different CMCS contents (a) and CI values as a function of storage time (b)

2.2.3 桉葉精油體積分數(shù)對乳液穩(wěn)定性的影響

固定M-APT質(zhì)量分數(shù)0.15%、CMCS質(zhì)量分數(shù)2.0%，考察桉葉精油體積分數(shù)對乳液靜置穩(wěn)定性和乳滴微觀形貌的影響，結(jié)果如圖8、9所示。當精油體積分數(shù)大于50%，靜置30 min即有少量油相析出浮于乳液表面，析出量隨精油體積分數(shù)增大而增多（圖8，油相尼羅紅染色），相應乳滴粒徑也隨著精油體積分數(shù)增多而變大（圖9）。這主要是因為M-APT含量在體系中固定，隨著精油體積分數(shù)增加，油滴表面無法被足夠M-APT粒子包覆。因此，在水相中，油滴迅速聚結(jié)在一起，以減少界面面積，相應的乳滴粒徑增大。

圖8 不同桉葉精油體積分數(shù)乳液靜置穩(wěn)定圖Fig. 8 Appearance of emulsion with different concentrations of eucalyptus essential oil

圖9 不同桉葉精油體積分數(shù)乳液乳滴顯微形貌圖Fig. 9 Micromorphology of emulsion droplets with different volume fractions of eucalyptus essential oil

2.3 M-APT/CMCS協(xié)同穩(wěn)定桉葉精油Pickering乳液的流變學行為

圖10 不同CMCS質(zhì)量分數(shù)乳液流變學行為曲線Fig. 10 Rheological curves of eucalyptus essential oil Pickering emulsion with different contents of CMCS

Pickering乳液的流變性能可反映其微觀結(jié)構(gòu)和抗乳化穩(wěn)定性。CMCS在pH 6.0體系中Zeta電位3.22，荷正電，在乳液中主要通過大分子鏈纏繞自組裝，形成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，通過靜電引力將表面荷負電的吸附M-APT粒子的油滴包裹其中，阻止油滴合并變大和沉降。為進一步驗證CMCS在乳劑體系中的作用，測定不同CMCS質(zhì)量分數(shù)的桉葉精油Pickering乳劑的G’和G”隨頻率變化關(guān)系，結(jié)果如圖10a所示。隨著CMCS質(zhì)量分數(shù)增加，乳液的G’明顯增大，說明乳液的黏彈性增強。而且，當CMCS質(zhì)量分數(shù)大于1.0%時，其G’大于G”，tanδ小于1，乳液表現(xiàn)典型的“彈性凝膠”行為（圖10b）。這種質(zhì)量分數(shù)依賴的凝膠流變行為在其他多糖粒子穩(wěn)定的Pickering乳液體系中也有報道，這主要是因為多糖大分子鏈在連續(xù)相中的氫鍵纏繞形成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。凝膠網(wǎng)絡的形成，可將油滴固定在其網(wǎng)絡空隙結(jié)構(gòu)中，阻礙了液體膜的排液和油滴的聚結(jié)，乳液穩(wěn)定性更強。

2.4 桉葉精油Pickering乳液抑菌性能

通過瓊脂擴散法對比考察桉葉精油和其乳液對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌和黃曲霉菌的抑制性能，如圖11所示。對金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的抑制活性明顯優(yōu)于大腸桿菌和黃曲霉菌，此結(jié)果與相關(guān)文獻報道一致。十字交叉法測定的金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌體系培養(yǎng)12 h和24 h的DIZ結(jié)果如表1所示。所有乳液體系DIZ值均大于純精油體系。這主要是因為M-APT與CMCS協(xié)同作用實現(xiàn)了對精油的包封，提高了精油在水相體系中的分散性，增大了與菌類的接觸面積，可快速的侵入其細胞膜，導致內(nèi)容物外泄，抑菌活性提高。此結(jié)果與Jiang Yang等報道的以玉米果膠復合納米顆粒作為穩(wěn)定劑制備的肉桂精油Pickering乳劑的分散性和抑菌活性優(yōu)于純?nèi)夤鹁鸵恢?。另外，對所有菌種，精油添加組在培養(yǎng)24 h后，DIZ值略降低，而乳液組均增大，這證實了M-APT/CMCS協(xié)同對精油滴的包封和緩釋作用。梯度法測得的桉葉精油乳液對金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的MIC值為18.0 μL/mL和12.5 μL/mL（圖12）。

圖11 桉葉精油及其乳液的抑菌性能對照圖Fig. 11 Aantibacterial activity of eucalyptus essential oil and emulsion

表1 桉葉精油及其乳液對金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌培養(yǎng)12 h和24 h的DIZ值Table 1 DIZ values of eucalyptus essential oil and emulsion against S. aureus and B. subtilis at 12 h and 24 h

圖12 桉葉精油乳液對金黃色葡萄球菌（A）和枯草芽孢桿菌（B）的MIC值測定圖Fig. 12 MIC values of eucalyptus essential oil Pickering emulsion against S. aureus (A) and B. subtilis (B)

為了進一步驗證M-APT/CMCS協(xié)同對精油的包封，以金黃色葡萄球菌為受試菌種，通過菌類生長動力學實驗考察M-APT/CMCS協(xié)同穩(wěn)定桉葉精油乳液的緩釋抑菌性能，如圖13所示。在空白組中，隨著時間延長，金黃色葡萄球菌懸浮液OD值持續(xù)升高；純CMCS體系在起初1 h OD值略有降低，表現(xiàn)弱的抑菌活性；純桉葉精油組OD值在起初3 h內(nèi)下降，但隨后略有升高。這主要是因為精油水溶性低，易揮發(fā)，與水相菌懸液中菌種不能充分接觸。而桉葉精油Pickering乳液組的OD值隨時間延長呈現(xiàn)持續(xù)下降趨勢，6 h后OD值小于0.05。這一結(jié)果也驗證了M-APT/CMCS對精油的包封，減小精油揮發(fā)和增大與菌種的接觸面積，不僅可實現(xiàn)長效抑菌，而且提高抑菌活性。

圖13 桉葉精油及其Pickering乳液對金黃色葡萄球菌的緩釋抑菌生存曲線Fig. 13 Survival curves of S. aureus in LB broth containing eucalyptus essential oil and Pickering emulsion

3 結(jié) 論

以油酸鈉對APT表面潤濕性進行適當改性，使其θ從15.2°增大到83.7°，可不可逆吸附在油滴表面，與CMCS鏈協(xié)同作用制備了桉葉精油Pickering乳液。考察M-APT、CMCS質(zhì)量分數(shù)以及油相體積分數(shù)對乳液穩(wěn)定性影響，結(jié)果表明，當M-APT質(zhì)量分數(shù)0.15%、CMCS質(zhì)量分數(shù)2.0%、油相體積分數(shù)30%時，制備的乳液靜置60 d仍保持穩(wěn)定。熒光顯微鏡分析和流變數(shù)據(jù)表明，M-APT在油/水界面吸附，CMCS在連續(xù)相中自組裝形成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，將吸附M-APT的油滴鑲嵌其中以形成穩(wěn)定的Pickering乳液。瓊脂盤打孔法對比考察桉葉精油和乳液對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和黃曲霉菌的抑菌活性，發(fā)現(xiàn)其對革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌有顯著的抑制活性，且乳液體系的DIZ值大于純精油體系，并表現(xiàn)延長的抑菌活性，這主要是因為M-APT粒子在油滴表面吸附實現(xiàn)了對精油的包封，降低了其揮發(fā)性。菌類生長動力學實驗也證明了這一結(jié)果，即M-APT/CMCS協(xié)同作用可實現(xiàn)對精油的包封和緩釋，提高抑菌活性和延長抑菌時間，這對拓展植物精油在生物抑菌劑方面的應用具有重要參考價值。