張 露，王夜寒，梅強(qiáng)根，嚴(yán)玉杰，程鑫鵬，謝作樺，賈曉燕，涂宗財,3,*

（1.江西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，國家淡水魚加工技術(shù)研發(fā)專業(yè)中心，江西 南昌 330022；2.江西德上制藥股份有限公司，江西 贛州 331200；3.南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗室，江西 南昌 330022）

多酚類化合物是廣泛存在于植物體的次生代謝產(chǎn)物，是重要的生物活性物質(zhì)，能有效預(yù)防炎癥、高血壓、癌癥、糖尿病、衰老等。根據(jù)多酚類化合物在植物組織中的存在形式，可分為游離多酚（free polyphenols，F(xiàn)P）和結(jié)合多酚（bound polyphenols，BP）。FP是指可通過有機(jī)溶劑和水溶劑直接從植物中浸提出來的多酚類化合物，根據(jù)溶劑類型又可分為水溶性多酚（water-soluble polyphenols，WSP）和醇溶性多酚（ethanol-soluble polyphenols，ESP）；BP是指與細(xì)胞壁物質(zhì)（纖維素、蛋白、木質(zhì)素等）以共價鍵、氫鍵或疏水作用結(jié)合的不溶性多酚類化合物，不能通過水或有機(jī)溶劑直接提取，須先采用堿、酸或酶水解的方式對原料進(jìn)行處理，再用有機(jī)溶劑萃取。通常，直接溶劑浸提后的固體殘渣中仍含有大量的BP，Pérez-Jiménez等比較分析了24 種蔬菜水果中結(jié)合態(tài)多酚的含量，其中蘋果、香蕉、西蘭花、牛皮菜、萵苣葉、橙子、梨中BP的含量均超過1 000 mg/100 g干原料，香蕉的BP含量最高，為3 283.4 mg/100 g干原料。Huang Zhiting等對羊棲菜、海帶、龍須菜等7 種藻類的BP進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)藻類中BP的含量和抗氧化活性均高于FP。Reynoso-Camacho等發(fā)現(xiàn)橙子、柑橘和葡萄柚中也含有豐富的BP。研究表明，BP具有多種功能活性，如Liu Shuai等發(fā)現(xiàn)胡蘿卜BP具有抗氧化和促進(jìn)鼠李糖乳桿菌生長的功能；Zheng Yuting等研究發(fā)現(xiàn)，綠豆皮膳食纖維BP具有很好的抗氧化、-淀粉酶和-葡萄糖苷酶活性抑制能力，酚酸為其主要活性成分。

覆盆子（Hu）是薔薇科懸鉤子屬多年生灌木，又稱懸鉤子、覆盆莓、樹莓、野莓等，廣泛分布于中國東部和東南部。其紅色成熟果實(shí)可作為漿果直接食用，或加工成果漿等，未成熟綠色果實(shí)干燥后可入藥。研究表明，覆盆子提取物具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤、抗糖尿病、降血脂等功能活性，多酚類化合物，如可水解單寧、酚酸、黃酮類為其主要活性成分。但目前只研究了覆盆子FP的組成和活性，鮮見關(guān)于覆盆子BP的相關(guān)研究。

本研究采用不同方法分別提取覆盆子中的WSP、ESP、FP和BP，評價不同類型多酚提取物中總酚、總黃酮和可水解單寧的含量，通過體外實(shí)驗評價不同類型多酚的抗氧化和抗糖尿病活性，并通過超高效液相色譜-串聯(lián)四極桿飛行時間質(zhì)譜（ultra-high performance liquid chromatography-tandem quadrupole time of flight mass spectrometry，UPLC-QTOF-MS/MS）技術(shù)對BP的化學(xué)組成進(jìn)行鑒定，為覆盆子的綜合利用提供一定理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

覆盆子干燥果實(shí)于2019年購自江西省德興市利秋覆盆子種植專業(yè)合作社，粉碎機(jī)粉碎后4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2,2’-聯(lián)氨-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（2,2’-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、對硝基苯---葡萄糖苷（-nitrophenyl---glucopyranoside，NPG）、阿卡波糖、-葡萄糖苷酶（分析純） 美國Sigma公司；沒食子酸、槲皮素（分析純） 北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

KQ5200E型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；RV10旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 日本EYELA公司；Synergy H1型酶標(biāo)儀 美國Bio Tek公司；UPLC-TripleTOF 6600-MS/MS美國Sciex公司；FA1104N型電子分析天平 上海丙林電子科技有限公司；F-7000熒光分光光度計 日本日立公司；LGJ-1D-80冷凍干燥機(jī) 北京亞泰科隆儀器技術(shù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 覆盆子中WSP、ESP、FP和BP的提取

稱取一定質(zhì)量的覆盆子粉末按1∶20（g/mL）的料液比分別與水、40%乙醇溶液混合，50 ℃浸提2 h后抽濾，收集上清液，將殘渣在相同條件下再次提取，4 000 r/min離心5 min后合并上清液。

水提物濃縮至1/5～1/6體積后加入5 倍體積的無水乙醇過夜醇沉，除去部分蛋白、糖等雜質(zhì)，抽濾，收集濾液，濃縮得到WSP提取物。

水提取后的殘渣再用70%乙醇溶液按照1∶20（g/mL）的料液比超聲波提取2 h，重復(fù)提取2 次。合并上清液后濃縮干燥得到ESP提取物。

40%乙醇提取物直接濃縮干燥后得可溶性FP提取物。

向40%乙醇溶液提取后的殘渣中加入4 mol/L NaOH溶液，無氧條件下處理90 min。用6 mol/L 鹽酸溶液調(diào)pH值至2.0，抽濾。收集濾液，濃縮濾液到原體積的1/5后加入等體積的乙酸乙酯進(jìn)行萃取，重復(fù)萃取3 次，合并3 次萃取得到的乙酸乙酯相，濃縮干燥后得到不可溶性BP提取物。

1.3.2 覆盆子多酚提取物中總酚、總黃酮、總可水解單寧含量測定

1.3.2.1 總酚含量測定

參照Huang Zhiting等的方法，采用Folin-Ciocalteau比色法。200 μL適宜濃度的復(fù)溶提取物溶液或沒食子酸與0.1 mL Folin-Ciocalteau試劑反應(yīng)5 min，加入0.3 mL 0.2 g/mL NaCO溶液和1.0 mL蒸餾水，避光反應(yīng)25 min后，采用酶標(biāo)儀測定反應(yīng)體系在765 nm處的吸光度，以蒸餾水代替樣品作空白。以20～100 μg/mL的沒食子酸溶液為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果以每毫克提取物中所含沒食子酸當(dāng)量表示（μg/mg）。

1.3.2.2 總黃酮含量測定

采用AlCl·6HO比色法。100 μL適宜濃度的復(fù)溶提取物溶液或槲皮素與100 μL 60 mg/mL AlCl·6HO溶液在室溫條件下反應(yīng)15 min后，測定其在430 nm處的吸光度，用無水乙醇代替樣品作空白。以31.25～250 μg/mL槲皮素溶液標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果以每毫克提取物中所含槲皮素當(dāng)量表示（μg/mg）。

1.3.2.3 可水解單寧含量測定

采用Zhang Lu等的方法。100 μL適宜濃度的提取物與150 μL 2.5%（g/mL）碘酸鉀溶液室溫反應(yīng)15 min后，于550 nm處測定吸光度，以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果以每毫克提取物中所含沒食子酸當(dāng)量表示（μg/mg）。

1.3.3 抗氧化活性測定

采用DPPH自由基和ABTS陽離子自由基清除能力評價不同提取物的抗氧化能力。取50 μL不同濃度的復(fù)溶提取物溶液或槲皮素于96 孔酶標(biāo)板中，加入150 μL 0.15 mmol/L DPPH自由基乙醇溶液或ABTS陽離子自由基溶液，室溫避光反應(yīng)一定時間后，分別測定其在517 nm和734 nm處的吸光度（）。用70%甲醇溶液代替樣品、分別用70%甲醇溶液和無水乙醇代替樣品和自由基溶液、用無水乙醇代替自由基溶液的反應(yīng)體系分別為控制組（）、空白組（）和樣品空白組（）。自由基清除率的計算公式如下：

1.3.4 體外抗糖尿病活性測定

1.3.4.1-葡萄糖苷酶抑制活性的測定

參照Chen Yue等的方法。取50 μL適宜濃度的復(fù)溶提取物溶液與50 μL 0.1 U/mL的-葡萄糖苷酶于96 孔酶標(biāo)板上混勻，室溫反應(yīng)6 min后加入50 μL 5.0 mmol/L的NPG，37 ℃反應(yīng)10 min后加入100 μL 0.2 mol/L NaCO溶液終止反應(yīng)，在405 nm處測定吸光度（）。以阿卡波糖為陽性對照品，以不含提取物樣品的反應(yīng)體系為控制組，以不含酶的反應(yīng)體系為樣品空白組，以不加酶和提取物樣品的反應(yīng)體系為空白組，最后計算樣品的-葡萄糖苷酶抑制率和半抑制濃度（IC值）。

1.3.4.2 抗糖基化活性的測定

參照前期實(shí)驗方法，以抑制晚期糖基化產(chǎn)物（advanced glycation end-products，AGEs）形成的能力為評價指標(biāo)，采用牛血清白蛋白-丙酮醛（bovine serum albumin-methylglyoxal，BSA-MGO）模型評價樣品抗糖基化能力。20 mg/mL BSA、30 mmol/L MGO和氨基胍鹽酸鹽溶液均由pH 7.4 0.2 mol/L 磷酸鹽緩沖液配制，將BSA、MGO和提取物溶液按照體積比10∶10∶1混合。37 ℃避光反應(yīng)3 d后，采用熒光分光光度計測定反應(yīng)體系在激發(fā)波長370 nm、發(fā)射波長440 nm處的熒光強(qiáng)度值（FI），激發(fā)和發(fā)射的狹縫寬度均為5 nm，掃描速率為1 200 nm/min，電壓為400 V。以提取物的溶劑代替提取物溶液的反應(yīng)體系為控制組（FI）、以磷酸鹽緩沖液代替MGO溶液的反應(yīng)體系為樣品空白組（FI）、分別以提取物樣品溶劑和磷酸鹽緩沖液代替樣品和MGO溶液的反應(yīng)體系為空白組（FI），熒光性AGEs形成抑制率的計算公式如下：

1.3.5 覆盆子多酚提取物化學(xué)成分測定

采用UPLC-QTOF-MS/MS對提取物中的主要化學(xué)成分進(jìn)行定性分析。用80%乙醇溶液溶解1.3.1節(jié)中制備的提取物，加入-2-氯苯丙氨酸為內(nèi)標(biāo)，4 ℃、13 000 r/min離心10 min，取上清液過0.22 μm有機(jī)膜后上樣分析。

1.3.5.1 色譜條件

ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流動相A：0.1%甲酸-水；流動相B：0.1%甲酸-乙腈；梯度洗脫：0.01 min，95% A、5% B；2 min，95% A、5% B；4 min，70% A、30% B；8 min，50% A、50% B；10 min，20% A、80% B；14～15 min，0% A、100% B；15.1～16 min，95% A、5% B；柱溫：45 ℃；洗脫流速：0.35 mL/min；進(jìn)樣體積：2.0 μL。

1.3.5.2 質(zhì)譜條件

掃描模式：負(fù)離子；離子源：電噴霧離子源；離子源溫度：550 ℃；質(zhì)量掃描范圍：/40～2 000；離子噴霧電壓：-4 000 V；一級質(zhì)譜碰撞能：-10 eV；二級質(zhì)譜碰撞能：-35 eV；霧化氣體壓力：55 psi；輔助氣體壓力：55 psi。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗重復(fù)3 次，結(jié)果用 ±表示。采用SPSS 13.0軟件中的單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計分析（＜0.05，差異顯著），采用Pearson相關(guān)性分析法對總酚、總黃酮和總水解單寧含量與生物活性間的相關(guān)性進(jìn)行分析，采用PeakView軟件對質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，所有圖形由Origin 8.0軟件繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 覆盆子多酚提取物中總酚、總黃酮和總可水解單寧含量分析

如表1所示，不同提取物中的總酚、總黃酮和可水解單寧含量有一定差異，不同提取物中總酚含量從高到低的順序為：ESP＞FP＞BP＞W(wǎng)SP；總黃酮含量為：BP＞ESP＞FP＞W(wǎng)SP；可水解單寧含量為：ESP＞FP＞BP＞W(wǎng)SP。所有提取物中，ESP提取物中的總酚和可水解單寧含量最高，分別為414.95 μg/mg和182.47 μg/mg，其次為FP提取物，而WSP提取物中的總酚、總黃酮和可水解單寧含量均為最低。

總酚和可水解單寧含量在ESP提取物中分別為FP提取物中1.32 倍和1.89 倍。這是因為，覆盆子粉在水浸提過程中，原料中大部分蛋白、多糖、礦物質(zhì)、維生素等非多酚類化合物溶于水，使70%乙醇溶液二次提取制備的樣品中蛋白、多糖等雜質(zhì)的含量遠(yuǎn)低于直接使用40%乙醇溶液提取的樣品。Zhang Lu等研究發(fā)現(xiàn)，藜蒿水提物中多糖含量約為乙醇提取物的6.9 倍。另外，多糖、蛋白等非多酚類化合物在高濃度乙醇中的溶解性往往低于低濃度乙醇，這進(jìn)一步促使ESP提取物的多酚含量高于40%乙醇提取物。Wu Chunnan等研究表明，啤酒花醇提物的總酚含量高于熱水提取物，其提取物中黃酮含量隨乙醇濃度的增加而增加。以上結(jié)果表明，在實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用中，水提取后的覆盆子殘渣，可作為提取覆盆子多酚的優(yōu)質(zhì)原料。

所有提取物中，BP提取物的總黃酮含量最高（177.48 μg/mg），其次為ESP提取物，這說明覆盆子中存在豐富的與膳食纖維等細(xì)胞壁成分結(jié)合的黃酮類物質(zhì)，乙醇溶液提取后的覆盆子殘渣同樣具有很好的進(jìn)一步利用的潛力。目前已發(fā)現(xiàn)黑豆、紅米、芒果、橙子等谷物、水果的BP提取物含有豐富的黃酮類化合物。

表1 覆盆子中WSP、FP、ESP和BP提取物的總酚、總黃酮和可水解單寧含量及其清除自由基和抑制α-葡萄糖苷酶活性的IC50Table 1 Contents of total phenols, total flavonoids and hydrolyzable tannins in WSP, FP, ESP and BP-rich extracts of R. chingii Hu, and IC50 for radical scavenging and α-glucosidase inhibitory activity

2.2 覆盆子多酚提取物的抗氧化活性分析

2.2.1 DPPH自由基清除能力分析

DPPH是一種比較穩(wěn)定的自由基，被廣泛用于評價天然產(chǎn)物的抗氧化活性，樣品清除自由基的IC值越低，說明其抗氧化活性越高。如表1和圖1A所示，所有提取物均具有較好的DPPH自由基清除能力，在質(zhì)量濃度低于250 μg/mL時呈很好的量效關(guān)系，ESP提取物的DPPH自由基清除能力最強(qiáng)，其IC值為40.68 μg/mL，略低于陽性對照品槲皮素的DPPH自由基清除能力（IC＝15.20 μg/mL），其次是BP提取物，IC值為44.57 μg/mL，自由基清除能力最弱的是WSP，IC值為128.12 μg/mL。可能是因為ESP提取物含有最高的總酚和可水解單寧含量。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，提取物的DPPH自由基清除能力與可水解單寧含量極顯著相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.773；與總酚和總黃酮含量顯著相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.667和0.697。另外，BP提取物的DPPH自由基清除能力大約為FP的1.7 倍，進(jìn)一步說明提取FP后的覆盆子殘渣具有很好的抗氧化開發(fā)潛力。

圖1 覆盆子不同多酚提取物DPPH自由基（A）和ABTS陽離子自由基清除能力（B）Fig. 1 DPPH radical (A) and ABTS cation radical scavenging capacity (B) of different polyphenol-rich extracts of R. chingii Hu

2.2.2 ABTS陽離子自由基清除能力分析

如表1和圖1B所示，4 個提取物均具有很強(qiáng)的ABTS陽離子自由基清除能力，其變化趨勢總體與其DPPH自由基清除能力（圖1A）相似。ESP提取物具有最高的ABTS陽離子自由基清除能力，其IC值為23.90 μg/mL，優(yōu)于陽性對照品槲皮素的ABTS陽離子自由基清除能力（IC＝28.66 μg/mL）。BP與FP的ABTS陽離子自由基清除能力相差不大（＞0.05），而WSP清除ABTS陽離子自由基的能力相對較低，其IC值為72.10 μg/mL。相關(guān)性分析結(jié)果顯示，可水解單寧和總酚含量與ABTS陽離子自由基清除能力極顯著相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.950和0.915，而總黃酮含量與ABTS陽離子自由基清除能力無相關(guān)性（相關(guān)系數(shù)為0.344），說明可水解單寧和酚酸為覆盆子多酚中的主要抗氧化活性成分。目前已從覆盆子中分離鑒定出個25 個單寧和23 個酚酸類化合物。

2.3 覆盆子多酚提取物的體外抗糖尿病活性分析

2.3.1-葡萄糖苷酶的抑制活性分析

-葡萄糖苷酶的活性被抑制時，能有效緩解碳水化合物的水解，降低人腸道對葡萄糖的吸收，從而降低餐后和空腹血糖水平，對于治療和預(yù)防II型糖尿病具有重要意義。如表1和圖2A所示，所有提取物均具有很強(qiáng)的-葡萄糖苷酶活性抑制能力，IC值均低于25.0 μg/mL，遠(yuǎn)低于陽性對照品阿卡波糖的813.33 μg/mL，說明覆盆子多酚提取物具有很好的降血糖應(yīng)用潛力。ESP具有最強(qiáng)的-葡萄糖苷酶活性抑制能力（IC1.65 μg/mL），約為阿卡波糖的493 倍，F(xiàn)P提取物次之，WSP的抑制能力最弱。相關(guān)性分析表明，-葡萄糖苷酶活性抑制能力與提取物樣品中總酚與可水解單寧含量極顯著相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.926和0.892，而與黃酮含量的相關(guān)性僅為0.172，說明酚酸和單寧是覆盆子提取物抑制-葡萄糖苷酶活性的主要貢獻(xiàn)者。Chen Yue等研究也表明，覆盆子多酚提取物能有效抑制-葡萄糖苷酶和-淀粉酶活性，鞣花單寧為其主要活性成分。

圖2 覆盆子不同多酚提取物的α-葡萄糖苷酶活性抑制（A）和抗糖基化能力（B）Fig. 2 α-Glucosidase inhibitory (A) and antiglycation (B)capacity of different polyphenol-rich extracts of R. chingii Hu

2.3.2 抗糖基化活性分析

抑制蛋白糖基化和AGEs的積累被認(rèn)為是延緩衰老和緩解糖尿病并發(fā)癥的潛在有效方法之一。如圖2B所示，BP具有最高的AGEs形成抑制活性，當(dāng)樣品質(zhì)量濃度為95 μg/mL時，其抑制率高達(dá)64.94%，遠(yuǎn)高于ESP提取物（AGEs形成抑制率32.61%），并且是WSP和FP的4.5 倍和3.8 倍，表明覆盆子BP具有較好的抗糖基化潛力。

2.4 覆盆子多酚提取物化學(xué)組成分析

由于覆盆子ESP提取物中具有最高的總酚和可水解單寧含量，以及最強(qiáng)的抗氧化能力和-葡萄糖苷酶活性抑制能力，因此，采用UPLC-QTOF-MS/MS技術(shù)對其主要化學(xué)組成進(jìn)行定性分析。覆盆子BP提取物的總離子流圖如圖3所示。根據(jù)化合物的保留時間、母離子、分子式、二級質(zhì)譜碎片等信息，結(jié)合參考數(shù)據(jù)庫和相關(guān)文獻(xiàn)，對主要化學(xué)成分進(jìn)行初步鑒定。如表2所示，共鑒定出31 個化合物，包括11 個單寧類化合物、6 個黃酮類化合物、5 個脂肪酸類化合物、3 個酚酸類化合物、3 個萜類化合物和3 個其他類型化合物。

圖3 覆盆子ESP提取物總離子流圖Fig. 3 Total ion current chromatogram of ESP-rich extract from R. chingii Hu

2.4.1 覆盆子多酚提取物的黃酮類化合物

峰15的母離子為449.109 7[M-H]，特征苷元離子287.055 8由母離子丟失一分子六碳糖（-162 Da），碎片離子269.046 2和259.061 5由苷元離子分別丟失一分子的HO和CO所產(chǎn)生，因此鑒定為二氫山柰酚-己糖苷。峰19和20的母離子均為593.151 9[M-H]，相同的MS/MS產(chǎn)物離子285.04[M-308-H]和284.03[M-308-2H]表明其苷元均為山柰酚，由母離子丟失鼠李糖己糖苷部分所產(chǎn)生，通過文獻(xiàn)查閱確定峰19和20為山柰酚-3--鼠李糖己糖苷，其中山柰酚-3--蕓香糖苷已被Li Kuangyu等從覆盆子中鑒定。相似地，化合物11（[M-H]，289.072 1，CHO）鑒定為(表)兒茶素?；衔?1（[M-H]，447.094 1，CHO）和24（[M-H]，593.131 5，CHO）分別被鑒定為山柰酚-3--己糖苷和銀鍛苷，化合物銀鍛苷已被Li Kuangyu等從覆盆子中鑒定。

2.4.2 盆子多酚提取物的單寧類化合物

可水解單寧是覆盆子中已知的主要單寧類化合物，在負(fù)離子模式下，通常具有以下特征丟失片段：葡萄糖基（162 Da）、葡萄糖醛酸基（176 Da）、五碳糖基（132 Da）、沒食子?；?52 Da）、沒食子酸（170 Da）、六羥基聯(lián)苯二甲?；℉HDP）或鞣花酸（302 Da）和沒食子酸?；?葡萄糖（332 Da）?？偣矎腅SP提取物中鑒定出11 個可水解單寧類化合物，包括1 個鞣花酸（峰18）、4 個鞣花酸衍生物（峰7、14、16、17）、5 個鞣花單寧（峰2、5、8、9、10）和1 個沒食子單寧（峰13）。

峰2的母離子為481.063 9[M-H]，特征碎片離子300.999 1表明結(jié)構(gòu)中存在HHDP部分結(jié)構(gòu)，由母離子丟失一分子葡萄糖（-180 Da）所產(chǎn)生，因此鑒定為HHDP-葡萄糖。峰5和8具有相同的母離子783.07[M-H]和MS/MS產(chǎn)物離子301.00[HHDP-H]、275.01[HHDPHO-H]，由母離子依次丟失HHDP和葡萄糖部分所產(chǎn)生，根據(jù)化合物保留時間差，分別鑒定為木麻黃素和赤芍素。峰9和峰10的特征碎片離子463.066 9[M-170-H]和300.999 6[HHDP-H]表明化合物中存在沒食子酸和HHDP結(jié)構(gòu)，因此鑒定為沒食子酰-HHDP-葡萄糖，同理，化合物13鑒定為沒食子酰-HHDP-己糖苷。通過與文獻(xiàn)對比化合物的母離子和MS/MS裂解方式，化合物18（301.000 1，CHO）鑒定為鞣花酸，化合物16和17分別鑒定為鞣花酸-戊糖苷，碎片離子301.00由母離子丟失一分子戊糖基所產(chǎn)生（-132 Da），根據(jù)表留時間差異，化合物7和14分別被鑒定為血脂酸雙內(nèi)酯和戊酸雙內(nèi)酯，MS/MS離子由母離子依次丟失羧基（-CO）和羥基（-HO）部分所產(chǎn)生，300.999 1對應(yīng)鞣花酸部分。

2.4.3 覆盆子多酚提取物的脂肪酸類化合物

總共從ESP提取物中鑒定出了5 個脂肪酸類化合物，峰32被鑒定為9,12,13-三羥基十八烯酸，碎片離子293.213 2由母離子丟失兩分子水產(chǎn)生，表明化合物中存在兩個羥基，離子229.145 1和211.144 6由C～C鍵斷裂和產(chǎn)物離子脫水作用所產(chǎn)生，碎片離子171.103由C～C鍵斷裂所產(chǎn)生。峰36的母離子為311.224 4（[MH]，CHO），碎片離子275.205 2[M-2HO-H]由母離子丟失2 分子水產(chǎn)生，離子223.172 5（CHO）和201.115 0（CHO）分別由C～C和C～C鍵斷裂所產(chǎn)生，離子183.103 7（CHO）由201.115 0脫水所產(chǎn)生，表明所有氧原子在C～C之間，因此鑒定為9,10-二羥基十八烷-12,15-二烯酸。同理，峰33鑒定為二羥基紫杉酸，峰39（277.218 3，CHO）和40（279.234 0，CHO）分別被鑒定為亞麻酸和亞油酸，這兩種化合物已在覆盆子果實(shí)中鑒定。

2.4.4 覆盆子多酚提取物的其他類型化合物

通過分析化合物的一級和二級裂解規(guī)律，并與文獻(xiàn)報道和覆盆子中已知化合物的數(shù)據(jù)進(jìn)行比對，從覆盆子ESP提取物中鑒定出了3 個酚酸：沒食子酸（峰4）、短葉蘇木酚酸（峰12）和肉桂酸（峰23）；3 個萜類化合物：2,19,24-三羥基烏蘇-12-烯-3-氧-28-酸（峰35）、薔薇酸A（峰37）和薔薇酸B（峰38）；2 個有機(jī)酸：檸檬酸（峰1）、黃尿酸（峰6），以及1 個核苷類化合物：鳥嘌呤核苷（峰3）。18、28、44、46 Da的質(zhì)量損失分別對應(yīng)著母離子羥基、醛基、羧基的斷裂。沒食子酸、短葉蘇木酚酸、檸檬酸和3 個萜類化合物均已在覆盆子中鑒定。峰22的母離子為723.504 2[M-H]，只有一個/為677.500 4[M-HCO-H]的碎片離子，無法鑒定化合物的初步結(jié)構(gòu)。峰25～31存在相似的碎片離子615.34、483.30和161.04，以及相同的裂解規(guī)律，說明為同類型化合物；連續(xù)的46、162 Da或132 Da的丟失，表明分子結(jié)構(gòu)中存在羧基/酯鍵和六碳糖結(jié)構(gòu)，但不能確定碎片離子321.24的結(jié)構(gòu)，后續(xù)需要通過核磁技術(shù)才能確定其結(jié)構(gòu)。

表2 覆盆子ESP提取物中主要化學(xué)成分鑒定質(zhì)譜信息Table 2 Mass spectral identification of the major chemical constituents in the ESP-rich extract of R. chingii Hu

續(xù)表2

3 結(jié) 論

研究了覆盆子WSP、FP、ESP和BP提取物中總酚、總黃酮和可水解單寧的含量，并通過自由基清除能力、酶抑制活性和抗糖基化能力評價其抗氧化和抗糖尿病活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所有提取物中，ESP提取物的總酚（414.95 μg/mg）和可水解單寧含量（182.47 μg/mg）最高，其次為FP提取物；BP提取物的總黃酮含量最高，達(dá)177.48 μg/mg，約為含量第二的ESP提取物的1.8 倍。不同提取物的抗氧化、-葡萄糖苷酶活性抑制和抗糖基化能力呈不同的變化趨勢，但ESP提取物具有最高的抗氧化和-葡萄糖苷酶抑制能力，且清除ABTS陽離子自由基和抑制-葡萄糖苷酶的能力均優(yōu)于對應(yīng)的陽性對照品槲皮素和阿卡波糖；BP提取物具有最強(qiáng)的抗糖基化能力，抑制率達(dá)64.94%；WSP提取物的活性最弱。共從ESP提取物中初步鑒定出31 個化合物，包括11 個單寧類化合物、6 個黃酮類化合物、5 個脂肪酸類化合物、3 個酚酸類化合物、3 個萜類化合物和3 個其他類型化合物，單寧和黃酮類化合物為其主要活性成分。因此，覆盆子ESP和BP具有良好的抗氧化和抗糖尿病潛力，提取多糖和FP后的覆盆子殘渣具有很好的進(jìn)一步高值化利用的價值。