張倩雯，陶 晴，趙婷婷，張 彤，顏 娟,2,*

（1.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306；2.上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室（上海），上海 201306）

食品安全是遍及世界的重大公共衛(wèi)生問題，其中由微生物導(dǎo)致的細(xì)菌感染事件是引發(fā)食品安全問題的最主要原因，據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，沙門氏菌感染主要來源于動(dòng)物食品，如肉類、家禽、蛋類和乳制品，常見的傳播路徑是被人類糞便污染的綠色蔬菜或餐飲服務(wù)中受污染的食物。目前發(fā)現(xiàn)的近1 000 種沙門氏菌菌株，根據(jù)其抗原成分可分為甲、乙、丙、丁、戊等，其中鼠傷寒沙門氏菌（）是臨床上最常見的食源性致病菌，其引起的沙門氏菌病是世界各地一種主要的食源性細(xì)菌胃腸炎感染，伴隨的中毒癥狀主要有惡心、嘔吐、腹痛、頭痛、畏寒和腹瀉等，不僅對(duì)人體健康造成了危害，也是食品安全、環(huán)境監(jiān)測(cè)、疾病預(yù)防的巨大威脅。因此，對(duì)沙門氏菌的監(jiān)測(cè)具有重要的公共衛(wèi)生意義。目前常規(guī)檢測(cè)沙門氏菌的方法有傳統(tǒng)培養(yǎng)法、基于大型儀器檢測(cè)、免疫學(xué)分析法等。傳統(tǒng)培養(yǎng)法的一般步驟是前增菌、選擇性增菌、選擇性平板分離、生物化學(xué)篩選、血清學(xué)技術(shù)提供培養(yǎng)物菌種的鑒定，這種細(xì)菌培養(yǎng)程序耗時(shí)，至少2 d獲得最終報(bào)告，需要專業(yè)的工作人員，成本高，且靈敏度有限。基于大型儀器檢測(cè)有高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法、質(zhì)譜（mass spectrometry，MS）分析法等，由于檢測(cè)儀器體積龐大、檢測(cè)成本高，需要復(fù)雜的準(zhǔn)備程序，存在一定的局限性。雖然免疫學(xué)分析方法能夠在較短的時(shí)間內(nèi)實(shí)時(shí)檢測(cè)致病菌，但與傳統(tǒng)方法相比，有一定的缺陷，例如對(duì)低濃度靶物質(zhì)的靈敏度差、抗體與相關(guān)抗原發(fā)生交叉反應(yīng)、某些抗體對(duì)其靶物質(zhì)的親和力低，必須由專業(yè)的操作人員進(jìn)行。因此，迫切需要開發(fā)一種靈敏、快速、簡(jiǎn)便的沙門氏菌檢測(cè)方法。

適配體傳感器的開發(fā)與應(yīng)用促進(jìn)了微生物檢測(cè)領(lǐng)域的發(fā)展，核酸適配體是指利用指數(shù)富集的配體進(jìn)化技術(shù)從寡核苷酸合成文庫中篩選出能與靶物質(zhì)特異性結(jié)合的DNA或RNA，長(zhǎng)度一般為25～60 個(gè)核苷酸，當(dāng)靶物質(zhì)存在時(shí)，適配體通過互補(bǔ)堿基間的配對(duì)、靜電作用、氫鍵作用等自發(fā)的適應(yīng)性折疊成發(fā)夾、假節(jié)、凸環(huán)和G2四分體等穩(wěn)定的三維空間結(jié)構(gòu)，這些結(jié)構(gòu)以及空間構(gòu)象的多樣性是與靶物質(zhì)緊密結(jié)合的基礎(chǔ)。與抗體相比，適配體對(duì)目標(biāo)分子表現(xiàn)出更好的親和力和特異性；具有可逆變性、穩(wěn)定性、更好的經(jīng)濟(jì)效益、易于修飾等。基于上述優(yōu)點(diǎn)，適配體常被作為生物傳感器的組成部分，例如，Youn等用DNaseI輔助循環(huán)酶信號(hào)放大方法結(jié)合適配體及氧化石墨烯復(fù)合物，設(shè)計(jì)了一種基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移的抗生素適配體傳感器。Huang Rongrong等提出了一種基于適配體與靶標(biāo)結(jié)合構(gòu)象變化的熒光適配體傳感器定量檢測(cè)乙型肝炎病毒e抗原的方法，以標(biāo)記熒光基團(tuán)的適配體作為分子識(shí)別元件，設(shè)計(jì)與其互補(bǔ)的單鏈DNA（single-stranded DNA，ssDNA）通過競(jìng)爭(zhēng)法實(shí)現(xiàn)對(duì)慢性乙型肝炎的診斷。Zhang Hui等基于適配體的特異性識(shí)別功能與納米粒子的拉曼增強(qiáng)光譜構(gòu)建了同時(shí)檢測(cè)沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的生物傳感器。

本研究開發(fā)了一種基于核酸適配體和納米金光學(xué)特性的生物傳感器用于鼠傷寒沙門氏菌的可視化比色檢測(cè)。采用適配體（5′-CTGACAGATTAAAAGTGGTTG GGCAACTTCTGCTTGCGAA）對(duì)鼠傷寒沙門氏菌進(jìn)行定量，該適配體對(duì)鼠傷寒沙門氏菌親和力較好，值為4.41×10mol/L。檢測(cè)原理如圖1所示，首先，沙門氏菌適配體和與其序列互補(bǔ)的捕獲探針（capture probe，CP）通過堿基互補(bǔ)配對(duì)原則雜交制備而成雙鏈DNA（double-stranded DNA，dsDNA）復(fù)合物。當(dāng)待測(cè)分析物中含有鼠傷寒沙門氏菌時(shí)，適配體與鼠傷寒沙門氏菌發(fā)生特異性結(jié)合，從而釋放出單鏈CP并吸附在納米金表面，避免了納米金粒子在鹽誘導(dǎo)作用下的聚集，此時(shí)納米金顆粒溶液保持酒紅色；而當(dāng)待測(cè)分析物中不含沙門氏菌時(shí)，由于dsDNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)剛性較好，對(duì)納米金顆粒吸附性能較差，導(dǎo)致其在鹽的誘導(dǎo)下發(fā)生團(tuán)聚，此時(shí)納米金溶液顏色由紅變紫。該顏色變化過程，無需額外儀器輔助，裸眼即可實(shí)現(xiàn)靶物質(zhì)的快速檢測(cè)，并通過進(jìn)一步分析，實(shí)現(xiàn)對(duì)沙門氏菌的定量檢測(cè)。

圖1 基于納米金比色法適配體傳感器檢測(cè)原理圖Fig. 1 Working principle of Au nanoparticle-based colorimetric aptasensor

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鼠傷寒沙門氏菌（，ATCC 19585）、非目標(biāo)菌為大腸桿菌（，ATCC 43889）、副溶血性弧菌（，ATCC17802）、金黃色葡萄球菌（，ATCC 25923）、李斯特菌（，ATCC 19115）均購(gòu)于美國(guó)菌種保藏中心（American Type Culture Collection，ATCC）；四氯金酸水合物（HAuCl·HO） 百靈威科技公司；8600-10醛基磁珠 美國(guó)Polysciences公司；胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基；LB肉湯培養(yǎng)基；營(yíng)養(yǎng)瓊脂；亞硫酸鉍瓊脂培養(yǎng)基；Tris-HCl緩沖鹽溶液（pH 7.4）；乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）；乙二胺四乙酸二鈉鹽二水（EDTA-2Na 2HO）；磷酸鹽緩沖液（20×PBS，pH 7.4～7.6）、雜交緩沖液1（25 mmol/L Tris-HCl、10 mmol/L EDTA-2Na，pH 8.8）、氯化鈉（NaCl）、雜交緩沖液2（10 mmol/L Tris-HCl、1 mmol/L EDTA，pH 8）、吐溫20、瓊脂糖III、4S Red Plus核酸染色劑、電泳緩沖液（50×TAE、pH 8.4）和其他常規(guī)試劑以及DNA序列均購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司，純化方法為HPLC，DNA具體序列見表1。實(shí)驗(yàn)用水通過Milli-Q系統(tǒng)（美國(guó)密理博公司）凈化。

表1 實(shí)驗(yàn)中所用的DNA序列Table 1 DNA sequences used in this study

1.2 儀器與設(shè)備

HCM100-Pro恒溫振蕩金屬浴 大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器（北京）有限公司；5417R小型臺(tái)式冷凍型離心機(jī)德國(guó)Eppendorf公司；TALOS F200X場(chǎng)發(fā)射透射電子顯微鏡 賽默飛世爾科技公司；Hema9600型聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀珠海黑馬醫(yī)療儀器有限公司；LQ-5103A型電子天平上?，幮码娮涌萍加邢薰?；Lab dancer振蕩器 大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器（北京）股份公司；Synergy2 SLFPTAD多功能酶標(biāo)儀 美國(guó)伯騰儀器有限公司；BSC-1100IIA2-X生物安全柜 山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司；FS5一體化穩(wěn)態(tài)瞬態(tài)熒光光譜儀 英國(guó)愛丁堡儀器公司；瓊脂糖凝膠成像分析系統(tǒng) 美國(guó)伯樂Bio-Rad公司；EOS 50D數(shù)字照相機(jī) 日本佳能公司。

1.3 方法

1.3.1 鼠傷寒沙門氏菌菌液的準(zhǔn)備

取凍存的鼠傷寒沙門氏菌種子液在亞硫酸鉍瓊脂培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)48 h，挑取單個(gè)菌落接種至胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基中，搖床振蕩培養(yǎng)過夜（200 r/min、37 ℃、16 h）。將過夜培養(yǎng)的菌液用無菌Tris緩沖鹽溶液（Tris buffered saline，TBS）離心洗滌3 次（8 000 r/min、5 min），棄上清液重懸在緩沖液中，經(jīng)稀釋至合適的倍數(shù)后涂布于亞硫酸鉍瓊脂培養(yǎng)基中計(jì)數(shù)（37 ℃、48 h）。最終用TBS稀釋至合適濃度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 納米金的制備

1)跟蹤微課程學(xué)習(xí)情況。通過將微課程上傳至教學(xué)平臺(tái)，不定時(shí)監(jiān)測(cè)學(xué)生的點(diǎn)擊學(xué)習(xí)情況。將點(diǎn)播次數(shù)較多的微課程通常是學(xué)生普遍認(rèn)為的難點(diǎn)，教師在課堂中統(tǒng)一講解解惑。

參考經(jīng)典的Frens方法，取1 mL 1%氯金酸溶液和49 mL去離子水同時(shí)加入圓底燒瓶中混勻，同時(shí)組裝好冷凝管，油浴加熱直到沸騰，再配制1%檸檬酸三鈉溶液，取3.5 mL加入至圓底燒瓶中攪拌混勻，反應(yīng)20 min后停止加熱，用磁力攪拌器攪拌圓底燒瓶?jī)?nèi)的物體至制備完成，用50 mL離心管分裝置于4 ℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 Mbs@CP的組裝

取20 μL醛基化磁珠，磁響應(yīng)后移除上清液，加入36 μL 1×PBS（10 mmol/L NaHPO、1.75 mmol/L KHPO、0.14 mol/L NaCl、2.65 mmol/L KCl，pH 7.2～7.6）和4 μL 100 μmol/L的氨基修飾的CP，37 ℃孵育12 h磁分離后，用100 μL 1×PBS洗滌3 次，用100 μL 0.5%酪蛋白溶液室溫封閉1 h，磁分離后將沉淀重懸在100 μL 1×PBS中并放置4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 熒光法驗(yàn)證適配體與靶標(biāo)的親和力

首先用磁珠連接的捕獲探針Mbs@CP（10 μL）與適配體（Apt）（10 μL）在雜交緩沖液中混合，90 ℃孵育5 min，冷卻至室溫完成雜交，洗滌棄掉上清液（未雜交上的Apt），再重懸在20 μL 1×PBS中制備Mbs@dsDNA，分別加入30 μL濃度梯度的鼠傷寒沙門氏菌溶液（10～1×10CFU/mL），30 μL 2×TBS（50 mmol/L Tris-HCl、0.28 mol/L NaCl、6 mmol/L KCl，pH 7.2～7.6）作為空白對(duì)照，37 ℃孵育完成識(shí)別與適配體的釋放。反應(yīng)結(jié)束后取上清液分別加入20 μL 2×TBS和20 μL 10×SYBR Green I混勻避光孵育30 min，完成孵育后用20 μL比色皿收集液體進(jìn)行熒光信號(hào)強(qiáng)度測(cè)定，設(shè)置激發(fā)光波長(zhǎng)為497 nm，縫隙寬度為3 nm，發(fā)射光波長(zhǎng)為525 nm，縫隙寬度為2 nm。

1.3.5 可行性驗(yàn)證

用該比色傳感體系同時(shí)檢測(cè)含鼠傷寒沙門氏菌的樣品和空白樣品，以驗(yàn)證該適配體傳感器的可行性。首先取2 個(gè)PCR離心管標(biāo)記為空白組（管1）、實(shí)驗(yàn)組（管2），同時(shí)加入5 μL CP（2 μmol/L）和5 μL Apt（2 μmol/L）振蕩混勻，在PCR儀中設(shè)置90 ℃雜交5 min，再取出離心管放置室溫冷卻完成雜交過程?？瞻捉M中加入10 μL TBS，實(shí)驗(yàn)組中加入10 μL鼠傷寒沙門氏菌溶液（1×10CFU/mL），于37 ℃孵育完成識(shí)別與適配體的釋放，取出后分別加入50 μL AuNPs（23 nmol/L）溶液混勻，最后加入7 μL NaCl溶液（0.2 mol/L）混勻靜置10 min。

1.3.6 體系靈敏度檢測(cè)

每管取10 μL 4 ℃?zhèn)溆玫膁sDNA，分別加入10 μL濃度梯度的鼠傷寒沙門氏菌溶液，10 μL 2×TBS作為空白對(duì)照，37 ℃振蕩孵育20 min完成識(shí)別與適配體的釋放，再各加入50 μL AuNPs（9.2 nmol/L）溶液混勻于37 ℃孵育20 min。反應(yīng)結(jié)束后分別加入7 μL NaCl溶液（0.2 mol/L）混勻靜置2 min，收集顯色溶液于96 孔板中用酶標(biāo)儀測(cè)定吸收光譜。

1.3.7 特異性分析

取5 個(gè)PCR離心管，分別加入10 μL 4 ℃?zhèn)溆玫膁sDNA，以及準(zhǔn)備好的其他4 種常見的非目標(biāo)致病菌菌液（大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、李斯特菌、副溶血性弧菌，1×10CFU/mL，10 μL）和鼠傷寒沙門氏菌菌液（1×10CFU/mL，10 μL），混勻后于37 ℃水浴中孵育完成適配體的識(shí)別與釋放，再各加入50 μL AuNPs（9.2 nmol/L）溶液振蕩混勻后于37 ℃水浴中孵育20 min，取出后分別加入10 μL NaCl溶液（0.2 mol/L）混勻靜置2 min，收集顯色溶液于96 孔板中用酶標(biāo)儀測(cè)定吸收光譜。

1.3.8 實(shí)際樣品分析

通過高速離心分離牛奶樣品（10 000 r/min，20 min），去除上層脂肪和下層沉淀，吸取中間液體用超濾膜進(jìn)行過濾處理，最后將過濾所得的溶液稀釋1 倍備用。通過添加鼠傷寒沙門氏菌菌液制備不同濃度梯度的樣品溶液（1×10～1×10CFU/mL）并放置4 ℃?zhèn)溆?，用該適配體傳感器檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)溶液的方法對(duì)牛奶樣品溶液進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 適配體與靶標(biāo)的親和力驗(yàn)證

適配體與靶標(biāo)之間的高效識(shí)別是構(gòu)建適配體生物傳感器的基礎(chǔ)，因此首先通過熒光法驗(yàn)證該Apt與鼠傷寒沙門氏菌的親和力。如圖2A所示，利用堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，制備Apt與氨基化捕獲探針NH-CP的dsDNA復(fù)合物。該dsDNA復(fù)合物在室溫下通過其標(biāo)記的氨基與磁珠表面的醛基即可形成較為穩(wěn)定的席夫堿結(jié)構(gòu)。當(dāng)檢測(cè)體系中存在鼠傷寒沙門氏菌時(shí)，Apt與鼠傷寒沙門氏菌發(fā)生特異性識(shí)別并被釋放至溶液的上清液中，收集上清液并加入熒光染料SYBR Green I。Apt與沙門氏菌結(jié)合后，自身序列含有配對(duì)堿基從而形成部分DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)，SYBR Green I嵌入其中后熒光大大增強(qiáng)。通過測(cè)定上清液中SYBR Green I的熒光強(qiáng)度變化，考察該適配體與鼠傷寒沙門氏菌的結(jié)合性能。如圖2B所示，隨著鼠傷寒沙門氏菌濃度（1×10～1×10CFU/mL）增加，熒光信號(hào)逐漸增強(qiáng)，且相對(duì)熒光強(qiáng)度（-）/逐漸升高（圖2C）。其中，代表空白組熒光信號(hào)值，代表實(shí)驗(yàn)組熒光信號(hào)值。結(jié)果表明，該適配體與不同濃度鼠傷寒沙門氏菌的響應(yīng)關(guān)系良好，表明兩者具有良好的親和性能，可應(yīng)用于構(gòu)建適配體生物傳感器。

圖2 熒光法驗(yàn)證靶標(biāo)與適配體親和力原理（A）、不同濃度鼠傷寒沙門氏菌熒光光譜（0～1×107 CFU/mL）（B）和相對(duì)熒光強(qiáng)度與鼠傷寒沙門氏菌濃度關(guān)系（C）圖Fig. 2 Schematic diagram of affinity between target and aptamer by fluorescence method (A), fluorescence spectra of S. typhimurium at different concentrations ( 0–1 × 107 CFU/mL) (B), and relationship between relative fluorescence intensity and S. typhimurium concentration(C)

2.2 比色傳感策略的可行性驗(yàn)證

基于適配體的納米金比色法用于鼠傷寒沙門氏菌快速檢測(cè)的可行性驗(yàn)證，結(jié)果如圖3A所示，管1為空白對(duì)照組，檢測(cè)體系中不含沙門氏菌；管2為實(shí)驗(yàn)組，檢測(cè)體系中含有沙門氏菌。裸眼觀察到管1相比管2，納米金顏色明顯偏紫，說明管1中納米金聚集，管2中納米金分散良好。分別對(duì)兩管中膠體金狀態(tài)進(jìn)一步通過透射電子顯微鏡進(jìn)行表征。空白組的納米金顆粒大部分聚集成團(tuán)（圖3B），而實(shí)驗(yàn)組中納米金與其相比，在視野里則較為分散（圖3C）。該結(jié)果證實(shí)表明該比色傳感策略可應(yīng)用于鼠傷寒沙門氏菌的快速檢測(cè)。

圖3 比色法驗(yàn)證適配體傳感器可行性（A）及空白組（B）、實(shí)驗(yàn)組（C）納米金透射電子顯微鏡表征Fig. 3 Colorimetric validation of the aptasensor’s feasibility (A), and transmission electron micrographs of Au nanoparticles in blank (B) and experimental groups (C)

2.3 dsDNA復(fù)合物的制備優(yōu)化

ssDNA與dsDNA與納米金之間的不同吸附力是納米金比色策略的基礎(chǔ)，因此確保檢測(cè)體系中含有更多dsDNA復(fù)合物是提升該傳感方法性能的關(guān)鍵因素之一。因此，以雜交緩沖液、雜交溫度及時(shí)間作為影響因素，優(yōu)化dsDNA復(fù)合物的制備。

選擇并對(duì)比兩種雜交緩沖液：緩沖液1（25 mmol/L Tris-HCl、10 mmol/L EDTA-2Na，pH 8.8）和緩沖液2（10 mmol/L Tris-HCl、1 mmol/L EDTA，pH 8）用于dsDNA的制備。通過瓊脂糖凝膠電泳圖對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行表征。如圖4A所示，泳道1和泳道2分別是CP與Apt的條帶，泳道3和泳道4分別是緩沖液1和緩沖液2所得產(chǎn)物。與泳道4相比，泳道3中條帶更亮。因此，選定緩沖液1用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖4 2 種不同雜交緩沖液（A）和不同溫度（B）條件下制備dsDNA瓊脂糖凝膠電泳表征Fig. 4 Agarose gel electropherograms of dsDNA prepared in two different hybridization buffers (A) and at different temperatures (B)

在4 種不同的雜交溫度及時(shí)間下，分別為37 ℃孵育1 h、45 ℃孵育1 h、60 ℃孵育1 h、90 ℃孵育5 min，再冷卻至室溫放置1 h，制備dsDNA復(fù)合物。結(jié)果如圖4B所示，4 個(gè)泳道都出現(xiàn)dsDNA條帶，并且泳道4與泳道1～3的條帶相比，其dsDNA的條帶更加明顯。這可能是因?yàn)楦邷叵?，DNA序列本身的二級(jí)結(jié)構(gòu)均被打開，利于兩者的充分雜交。因此，選擇90 ℃、5 min再室溫、1 h作為雜交溫度和時(shí)間用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.4 適配體比色傳感策略對(duì)鼠傷寒沙門氏菌的響應(yīng)性能分析結(jié)果

在優(yōu)化的條件下，設(shè)置一組具有濃度梯度的鼠傷寒沙門氏菌菌液（10～10CFU/mL）驗(yàn)證該比色適配體傳感器的檢測(cè)性能。直徑為（13±2）nm的納米金粒子在520 nm左右波長(zhǎng)處吸收可見光，顏色呈現(xiàn)紅色膠體溶液狀；而當(dāng)納米金聚集后，干擾其局域表面等離子體共振，使得紫外-可見吸收光譜發(fā)生紅移至620 nm附近，并且膠體金溶液因聚集程度不同而呈現(xiàn)紫色、藍(lán)色或灰色懸液。觀察納米金顏色和測(cè)定溶液紫外-可見吸收光譜的變化可用于分析該傳感器對(duì)沙門氏菌的檢測(cè)響應(yīng)性能。實(shí)驗(yàn)中，分別測(cè)定波長(zhǎng)520 nm和620 nm處的吸光度，用/表征納米金顆粒的團(tuán)聚程度。如圖5A所示，在一定濃度范圍內(nèi)，隨著鼠傷寒沙門氏菌濃度增大，納米金顆粒的團(tuán)聚程度逐漸減弱即分散性越來越好，與此相對(duì)應(yīng)的是，裸眼觀察到體系顏色逐漸由藍(lán)紫變?yōu)榫萍t（插圖）。當(dāng)鼠傷寒沙門氏菌在一定濃度范圍（10～10CFU/mL）內(nèi)，納米金的團(tuán)聚程度與其濃度的對(duì)數(shù)值呈現(xiàn)良好的線性響應(yīng)（圖5B），線性方程為=-0.129 98+1.244 11（=0.992 62）。基于LOD=3/，計(jì)算可得檢出限為124 CFU/mL。另外，通過將該方法與與其他檢測(cè)方法相比（表2）發(fā)現(xiàn)，該適配體傳感器檢測(cè)靈敏度高、樣品消耗量小、操作簡(jiǎn)便、成本低廉、易于觀察檢測(cè)結(jié)果，更具現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)優(yōu)勢(shì)。

圖5 適配體傳感器檢測(cè)不同濃度鼠傷寒沙門氏菌表征圖（A）和納米金團(tuán)聚程度與鼠傷寒沙門氏菌濃度的線性響應(yīng)圖（B）Fig. 5 Results of aptasensor detection of S. typhimurium at different concentrations (A) and linear relationship between aggregation degree of Au nanoparticles and S. typhimurium concentration (B)

表2 檢測(cè)鼠傷寒沙門氏菌不同方法的性能比較Table 2 Performance comparison of different methods for the detection of S. typhimurium

2.5 特異性分析結(jié)果

特異性的識(shí)別對(duì)于評(píng)估分析實(shí)際樣品至關(guān)重要。用該核酸適配體傳感器檢測(cè)鼠傷寒沙門氏菌（1×10CFU/mL）與其他4 種常見的致病菌（大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、李斯特菌、副溶血性弧菌，1×10CFU/mL），驗(yàn)證本方法對(duì)鼠傷寒沙門氏菌的檢測(cè)特異性。如圖6所示，管1～4都為對(duì)照菌，管5為鼠傷寒沙門氏菌。管5與其他4 管相比呈現(xiàn)明顯酒紅色，表明納米金顆粒分散性較好，且顏色對(duì)比明顯，表明該適配體傳感器對(duì)鼠傷寒沙門氏菌具有良好的檢測(cè)特異性。

圖6 適配體傳感器的特異性分析Fig. 6 Specificity analysis of the aptasensor

2.6 牛奶中沙門氏菌檢測(cè)性能分析結(jié)果

為測(cè)試該適配體傳感器的實(shí)際應(yīng)用性能，采用本方法檢測(cè)牛奶樣品中的鼠傷寒沙門氏菌。通過在牛奶中添加不同量的鼠傷寒沙門氏菌菌液制備不同濃度的鼠傷寒沙門氏菌牛奶加標(biāo)樣品。根據(jù)優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件，對(duì)牛奶樣品進(jìn)行預(yù)處理和檢測(cè)，重復(fù)3 次。如表3所示，測(cè)得鼠傷寒沙門氏菌的回收率為92.0%～116.4%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差低于5%，表明本方法具有很好的準(zhǔn)確性和特異性，可用于牛奶等相關(guān)實(shí)際樣品中鼠傷寒沙門氏菌的檢測(cè)。

表3 牛奶樣品中鼠傷寒沙門氏菌的檢測(cè)Table 3 Recoveries of S. typhimurium in spiked milk samples

1×102 1.163×102 116.4 1.1 1×104 1.003×104 100.3 1.8 1×106 1.059×106 105.9 3.1 1×108 9.196×108 92.0 4.7

3 結(jié) 論

發(fā)展了一種基于核酸適配體的納米金比色傳感策略用于鼠傷寒沙門氏菌的可視化快速檢測(cè)，通過對(duì)該方法的可行性、檢測(cè)性能（檢出限為124 CFU/mL）、特異性以及實(shí)際樣品的檢測(cè)性能等方面的驗(yàn)證，該適配體傳感器具有以下優(yōu)勢(shì)：1）利用納米金顏色特征作為檢測(cè)信號(hào)，不需要連接復(fù)雜的信號(hào)轉(zhuǎn)換器，實(shí)驗(yàn)流程簡(jiǎn)單，操作簡(jiǎn)便，可應(yīng)用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)；2）該適配體傳感器的特異性好，對(duì)非目標(biāo)菌不產(chǎn)生比色信號(hào)，可應(yīng)用于實(shí)際樣品檢測(cè)，并且能較大程度地避免二次污染產(chǎn)生的干擾信號(hào)；3）良好的通用性，只需改變適配體序列，即可實(shí)現(xiàn)不同食品安全污染物的檢測(cè)?？傊?，該適配體傳感器檢測(cè)結(jié)果直觀，通過顏色對(duì)比即可實(shí)現(xiàn)對(duì)鼠傷寒沙門氏菌的定性、定量檢測(cè)，檢測(cè)成本低、快速便捷，在食品安全快速檢測(cè)方面具有潛在的應(yīng)用前景。