李基旭 樸 文 金永善 金光俊 崔青龍 宋振海 樸光明 金龍浩 李永男 付 鵬

(1.延邊朝鮮族自治州疾病預(yù)防控制中心，吉林延吉 133001；2.琿春市疾病預(yù)防控制中心，吉林琿春 133300； 3.圖們市疾病預(yù)防控制中心，吉林圖們 133100；4.龍井市疾病預(yù)防控制中心，吉林龍井 133400； 5.和龍市疾病預(yù)防控制中心，吉林和龍 133500)

東方泰勒蟲Theileriaorientalisi舊稱瑟氏泰勒蟲Theileriasergenti，寄生于動(dòng)物紅細(xì)胞或淋巴細(xì)胞內(nèi)，可以引起牛東方泰勒蟲病，嚴(yán)重時(shí)引起牛急性死亡(楊艷玲等，2007)。延邊黃牛是吉林省延邊地區(qū)特有的黃牛品種，是我國(guó)五大地方良種牛之一，已被國(guó)家農(nóng)業(yè)部列為重點(diǎn)保護(hù)和開發(fā)品種。但一直以來，當(dāng)?shù)剌^高的牛東方泰勒蟲感染率(李紅旺等，2017)給當(dāng)?shù)仞B(yǎng)牛產(chǎn)業(yè)發(fā)展帶來較大風(fēng)險(xiǎn)。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，牛東方泰勒蟲病由蜱傳播，具有明顯的季節(jié)性，主要感染放牧牛群(張守發(fā)等，1997)。延邊地區(qū)具有豐富的森林、草原資源，當(dāng)?shù)仞B(yǎng)牛戶大都采取了放牧和圈養(yǎng)相結(jié)合的方式。據(jù)筆者調(diào)查，延邊地區(qū)適宜蜱類生長(zhǎng)，蜱類分布非常廣泛，而且具有明顯的種類多樣性和地域分布特征(李基旭等，2017)。該地區(qū)又位于中國(guó)、朝鮮、俄羅斯3國(guó)邊境地帶，邊境線較長(zhǎng)，蜱等媒介生物極易越境遷徙，可能導(dǎo)致牛東方泰勒蟲病等蜱傳疾病跨境傳播和蔓延。為了解延邊地區(qū)邊境縣游離蜱和牛攜帶東方泰勒蟲情況，開展了此次調(diào)查研究。

1 材料與方法

1.1 樣本來源

2019年4—8月在延邊州琿春、圖們、龍井、和龍市用布旗法采集游離蜱，采集生境為大型森林或林場(chǎng)附近草叢。5—6月在延邊州琿春、圖們、龍井市每縣選擇1個(gè)村屯隨機(jī)采集黃牛靜脈血，每只采1 份，每村采10份。

1.2 試劑和引物

核酸提取盒購(gòu)自中國(guó)江蘇碩世生物科技股份有限公司，PCR預(yù)混試劑為PromegaGotaq@Colorless Master Mix,USA。參照Yu等(2011)合成檢測(cè)東方泰勒蟲MPSP (major piroplasm surface protein, MPSP) 基因引物，由中國(guó)上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.3 蜱蟲分類

挑選蟲體完整的蜱，參照文獻(xiàn)(Yamagutietal.，1971; 陸寶麟等，2003)進(jìn)行鑒定。不同蜱種分組，成蜱每組5只(分雌、雄)，若蜱每組1～15只，幼蟲不計(jì)入。

1.4 提取樣本核酸

每組蜱用磷酸鹽緩沖溶液(Phosphate buffer saline, PBS)沖洗3次后，放入1.5 mL離心管中，再加600 μL PBS，使用組織破碎儀進(jìn)行研磨，研磨后6 000 r/min 離心1 min，取上清200 μL， 按提取盒說明書提取核酸(磁珠法)。取牛靜脈血200 μL按提取盒說明書提取核酸(磁珠法)。

1.5 檢測(cè)東方泰勒蟲MPSP基因

擴(kuò)增體系為上下游引物10 μmol/L各1 μL，DNA模板5 μL，使用PCR預(yù)混試劑配制25 μL體系。反應(yīng)條件為95 ℃ 2 min，1個(gè)循環(huán)；95 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min，1個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，使用德國(guó)凱杰公司(Qiagen)的毛細(xì)管電泳系統(tǒng)(QIAxcel screen Gel)檢測(cè)特異條帶。

1.6 基因測(cè)序和遺傳進(jìn)化分析

將陽性擴(kuò)增產(chǎn)物送往中國(guó)上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，并使用DNAStar軟件進(jìn)行基因序列拼接和校正，與NCBI的DNA序列數(shù)據(jù)庫(kù)中默認(rèn)序列進(jìn)行一致性分析，并用Mega 5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，牛巴貝蟲Babesiabovis和犬新孢子蟲Neosporacaninum表面蛋白基因序列作為外群。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

使用Excel 2007 表格進(jìn)行數(shù)據(jù)錄入。蜱病原感染情況計(jì)算最低感染率(minimum infection rate per 100 ticks，MIR)=陽性組數(shù)/蜱蟲數(shù)×100%。牛病原感染情況計(jì)算陽性率。采用Pearson卡方檢驗(yàn)、Fisher確切概率法。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 蜱種構(gòu)成及分布

共采集游離蜱1 183只，其中成蜱459只，若蜱724只。森林革蜱Dermacentorsilvarum占8.45%(100/1 183)；嗜群血蜱Haemaphysalisconcinna占10.65% (126/1 183)；日本血蜱Hae.japonica占17.33%(205/1 183)；長(zhǎng)角血蜱Hae.longicornis占54.18%(641/1 183)；全溝硬蜱Ixodespersulcatus占9.38%(111/1 183)(表1)。

表1 延邊地區(qū)4縣蜱種分布

2.2 蜱東方泰勒蟲MPSP基因檢測(cè)結(jié)果

把1 183只游離蜱共分成172組。經(jīng)東方泰勒蟲MPSP基因檢測(cè)，蜱東方泰勒蟲最低感染率(MIR)為1.52%。只有在長(zhǎng)角血蜱組中檢測(cè)到陽性結(jié)果，其最低感染率(MIR)為2.88%(表2，圖1)。經(jīng)統(tǒng)計(jì)，不同蜱種最低感染率存在差異，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=41.644，P<0.05)。(表2)。

圖1 部分蜱樣品組東方泰勒蟲MPSP基因擴(kuò)增結(jié)果

表2 延邊地區(qū)4縣游離蜱東方泰勒蟲檢測(cè)情況

2.3 牛靜脈血東方泰勒蟲MPSP基因檢測(cè)結(jié)果

共采集30份牛靜脈血，10份陽性，陽性率為33.33%，均由圖們市牛血樣品中檢測(cè)到(圖2)。

圖2 牛靜脈血樣品東方泰勒蟲MPSP基因擴(kuò)增結(jié)果

2.4 東方泰勒蟲MPSP基因同源性與系統(tǒng)進(jìn)化分析

從蜱類東方泰勒蟲MPSP基因擴(kuò)增產(chǎn)物中隨機(jī)選擇1份樣品進(jìn)行雙向測(cè)序得到的基因序列(GenBank登錄號(hào)：MN982295)與NCBI GenBank基因庫(kù)中的牛瑟氏泰勒蟲(東方泰勒蟲)MPSP基因序列(DQ078264)同源性達(dá)到了99.54% ；從牛血陽性樣品中隨機(jī)選擇進(jìn)行雙向測(cè)序得到的基因序列(GenBank登錄號(hào)：MN982296)與NCBI GenBank基因庫(kù)中東方泰勒蟲MPSP基因序列(KY392971)同源性為99.88%。經(jīng)系統(tǒng)進(jìn)化分析，蜱源和牛源東方泰勒蟲MPSP基因序列處于同一分枝(圖3)。

圖3 基于蜱源和牛源東方泰勒蟲MPSP基因片段構(gòu)建的遺傳進(jìn)化樹

3 討論

東方泰勒蟲病在我國(guó)流行廣泛，對(duì)畜牧業(yè)的影響很大，引起牛高熱、貧血、出血、黃疽、體表淋巴結(jié)腫大等臨床癥狀，嚴(yán)重時(shí)可以引起牛急性死亡(張守發(fā)等，1997)。東方泰勒蟲病在吉林東部山區(qū)和西部平原地區(qū)均有流行，延邊地區(qū)牛感染東方泰勒蟲現(xiàn)象非常嚴(yán)重(李紅旺等，2017)。東方泰勒蟲病在我國(guó)的貴州、甘肅、陜西、青海、河北、遼寧等地區(qū)也有流行。目前認(rèn)為，蜱是牛東方泰勒蟲病的傳播媒介(李鳴等，2016)。為確認(rèn)延邊州邊境地區(qū)牛東方泰勒蟲病的可能感染來源，進(jìn)一步證實(shí)蜱的傳播媒介作用，本研究采取對(duì)蜱類和牛分別檢測(cè)東方泰勒蟲的方法，并通過基因序列比對(duì)，對(duì)牛東方泰勒蟲病可能感染來源進(jìn)行了分析。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，牛東方泰勒蟲 MPSP 基因已作為流行病學(xué)調(diào)查和系統(tǒng)發(fā)育學(xué)研究的標(biāo)志性蛋白基因(Inoueetal.，2001)，因此，本研究選擇該基因作為目標(biāo)基因。結(jié)果表明，本研究在本地區(qū)長(zhǎng)角血蜱和黃牛中均檢測(cè)到了東方泰勒蟲MPSP基因片段，且兩個(gè)基因序列同源性較高，遺傳關(guān)系較近 。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，長(zhǎng)角血蜱常寄生在家養(yǎng)動(dòng)物，可以傳播多種病原體，對(duì)家畜以及人類健康影響較大(Jiangetal.，2018)。據(jù)本次調(diào)查，長(zhǎng)角血蜱主要分布在延邊地區(qū)琿春市和圖們市，為琿春市的優(yōu)勢(shì)種。雖然本研究未在琿春市牛血液樣品中檢測(cè)到東方泰勒蟲(可能樣本量少)，但一些學(xué)者已經(jīng)證實(shí)琿春市牛的東方泰勒蟲感染率較高(李紅旺等，2017)。結(jié)合本研究在長(zhǎng)角血蜱樣本中檢測(cè)到東方泰勒蟲的情況，我們首先從流行病學(xué)角度推斷長(zhǎng)角血蜱可以成為牛東方泰勒蟲病的傳播媒介。通過基因序列溯源分析，我們可以進(jìn)一步推斷牛體內(nèi)的東方泰勒蟲可能來源于長(zhǎng)角血蜱。因此，我們認(rèn)為長(zhǎng)角血蜱可能是牛東方泰勒蟲病的傳染源或傳染途徑之一 ，同時(shí)可以確認(rèn)長(zhǎng)角血蜱在傳播牛東方泰勒蟲病的過程中可能會(huì)起到重要的媒介作用。這與一些學(xué)者認(rèn)為長(zhǎng)角血蜱是東方泰勒蟲的主要傳播媒介(高旭等，2005)的觀點(diǎn)相符。本研究還發(fā)現(xiàn)，同樣具有長(zhǎng)角血蜱分布的圖們市牛東方泰勒蟲感染率較高，雖未在圖們市長(zhǎng)角血蜱中檢測(cè)到東方泰勒蟲(可能與樣品數(shù)量少有關(guān))，但我們可以推斷牛東方泰勒蟲感染率可能與長(zhǎng)角血蜱分布相關(guān)。當(dāng)然，下一步還需要通過增加樣本量等方式進(jìn)行更深入的研究。本研究還應(yīng)該繼續(xù)采取檢測(cè)基因多樣化、獨(dú)立樣本檢測(cè)等方式進(jìn)一步提高其研究結(jié)果的可靠性。