蔡瑜婷 楊小禎 陳春梅 王焌翔 余思宸 黃恩炯 張靈玲, 關(guān) 雄**

(1.福建農(nóng)林大學生物農(nóng)藥與化學生物學教育部重點實驗室，福州 350002；2.福建農(nóng)林大學生命科學學院，福州 350002；3.福建醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院，福州 350122，4. 福州國際旅行衛(wèi)生保健中心，福州 350001)

埃及伊蚊Aedesaegypti屬雙翅目昆蟲，主要在白天與傍晚活動，棲息于避風幽暗處，如水缸底、床底、墻角等(謝暉等, 2011)。該蚊在叮咬騷擾人類的同時也傳播登革熱、寨卡病毒病、基孔肯雅熱、黃熱病等重要傳染病(丁魯民, 1999)。目前利用生防微生物對埃及伊蚊進行消殺是阻斷蚊媒傳染病進一步傳播的重要途徑之一。而埃及伊蚊自身的免疫能力在其抵御病原入侵方面發(fā)揮了一定作用。

昆蟲免疫為非專一性的天然免疫，由細胞免疫和體液免疫組成。體液免疫主要包括凝結(jié)反應(yīng)、黑化反應(yīng)、Toll途徑(由真菌和大部分革蘭氏陽性菌激活)和Imd途徑(由革蘭氏陰性菌激活)，誘導產(chǎn)生抗菌肽并將其釋放到血淋巴中，同時包括溶菌酶作用及酚氧化酶原(PPO)級聯(lián)反應(yīng)等(寧媛媛等, 2009)。當受到外來病原侵染時，昆蟲天然免疫會識別外來異物，隨后引發(fā)、激活細胞外級聯(lián)反應(yīng)，啟動Toll或Imd信號轉(zhuǎn)導途徑而誘導不同抗菌肽的產(chǎn)生。通過模式生物黑腹果蠅(Hoffman, 2003)的免疫研究，發(fā)現(xiàn)其對異己物的識別主要是由不同模式識別受體(PRPs)來實現(xiàn)的。其中肽聚糖識別蛋白(peptidoglycan recognition proteins，PGRPs)是昆蟲免疫中重要的識別受體，能識別出細菌細胞壁中的肽聚糖(peptidoglycan，PGN)，從而激活體液免疫中的 Toll 途徑和 Imd 途徑，誘導抗菌肽產(chǎn)生。PGRPs具有一個能與PGN結(jié)合的保守結(jié)構(gòu)域，大約由165個氨基酸組成，稱為PGRP結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域與T7的溶菌酶高度同源。T7溶菌酶具有酰胺酶活性，能夠裂解 PGN，因此，PGRPs根據(jù)其是否具有酰胺酶活性被劃分為兩類。另外，根據(jù)PGRPs的分子量大小可分為PGRP-L和PGRP-S兩種類型。PGRP-L為長型(分子量>90 kDa)，是跨膜蛋白、胞內(nèi)蛋白或胞外蛋白，基因較復雜；PGRP-S為短型(分子量約20 ～ 25 kDa)，是小分子的分泌型蛋白，基因較簡單(Werneretal., 2000；呂成偉等, 2002)。

目前已對5種重要入侵昆蟲(紅棕象甲Rhynchophorusferrugineus、煙粉虱Bemisiatabac、意大利蜜蜂Apismelliferalingustica、日本龜蠟蚧Ceroplastesjaponicus和舞毒蛾Lymantriadispar)的免疫機制展開研究(曾令瑜等，2019)。有關(guān)紅棕象甲免疫機制的研究主要定位于RfRelish編碼基因和RfPGRP-LB蛋白(肖蓉等，2021)；以黑腹果蠅(Basbousetal.，2011)為研究對象，發(fā)現(xiàn)其PGRP具有激活Toll和Imd信號途徑、誘導抗菌肽產(chǎn)生和促進吞噬作用的功能；以煙草天蛾為研究對象，發(fā)現(xiàn)其PGRP具有激活酚氧化酶原產(chǎn)生黑化反應(yīng)的功能(徐亞玲等，2010)。此外，在黑腹果蠅等其他昆蟲中也有PGRP對其免疫應(yīng)答功能的相關(guān)報道，但是對埃及伊蚊中不同種類PGRP功能的了解還相對較少(楊青泰，2018；姜欣伶，2020)。因此，本實驗以埃及伊蚊為研究對象，通過克隆與測序分析其肽聚糖識別蛋白基因，了解其序列特征，并通過表達、純化，為進一步開展埃及伊蚊的免疫機制研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 埃及伊蚊

埃及伊蚊由軍事醫(yī)學研究院微生物流行病研究所惠贈，?？谄废?Ae.aegypti，Haikou strain)在本實驗室穩(wěn)定傳代40代以上。

1.2 菌株、質(zhì)粒

大腸桿菌(Escherichiacoli)JM109菌株、BL21表達菌株和pCold-GST載體均購自TaKaRa公司。

1.3 主要試劑和儀器

質(zhì)粒小提試劑盒、IN-Fusion HD Cloning Kit、預染分子質(zhì)量蛋白標準、Protein Marker、一抗GST-tag monochonal antibiody和二抗AP標記山羊抗小鼠IgG(H+L)均購于日本Takara公司，BCIP/NBT堿性磷酸酯酶顯色試劑盒購于碧云天公司，LB(Tyrptone、Yeast Extract、NaCl、瓊脂條)，IPTG，PBS，GST洗脫緩沖液(50 mmol/L Tris-HCl，谷胱甘肽，5 mmol/L NaOH)，LSB，30%丙烯酰胺，1.5 mol/L Tris-HCl，1.0 mol/L Tris-HCl，TEMED，考馬斯亮藍R250，脫色液(乙酸，甲醇)，BSA，Bradford溶液，PVDF膜，轉(zhuǎn)膜buffer(Gly、Tris，SDS，甲醇)，封閉液(脫脂奶粉，PBS)，PBST(PBS，吐溫20)。超微量分光光度計Q5000(Quawell，美國)，Glutathione Sepharose 4B填料(GE，美國)，層析柱(碧云天，中國)。

1.4 RNA提取和cDNA合成

收集5只埃及伊蚊成蟲，按TRIzolTMReagent RNA提取試劑盒提取埃及伊蚊RNA。利用超微量分光光度計Q5000和凝膠電泳檢測RNA。以提取的RNA作為模版，參照ImProm-IITMReverse Transcription System試劑盒合成cDNA，放至-20 ℃保存。

1.5 埃及伊蚊PGRP-S2基因的克隆與測序

根據(jù)埃及伊蚊PGRP-S2(AAEL007039)的CDS序列設(shè)計特異性引物(PGRP-S2-F: G G T A C C C T C G A G G G A T C C A T G C A G T G C C C A C G T A T C G T C AC，PGRP-S2-R: C TG C A G G T C G A C A A G C T T T T A A G G A T T T G G G T T G A A AC)。以提取的埃及伊蚊cDNA為模板，擴增PGRP-S2全長基因，PCR反應(yīng)程序設(shè)置為：98 ℃ 30 s，35個循環(huán)(98 ℃ 5 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 20 s/kb)，72 ℃ 2 min，4 ℃終止。PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳檢驗后，回收純化，并委托鉑尚生物技術(shù)(上海)有限公司進行測序。

1.6 埃及伊蚊PGRP-S2蛋白生物信息學分析

利用ORFfinder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)分析埃及伊蚊PGRP-S2的閱讀框。利用 CDD(https: / /www. ncbi. nlm. nih. gov/Structure/cdd/docs/cdd_search. html)預測埃及伊蚊PGRP-S2 的保守結(jié)構(gòu)域。并選用部分昆蟲，包括白紋伊蚊Aedesalbopictus、岡比亞按蚊Anophelesgambiae、阿拉伯按蚊Anophelesarabiensis、淡色庫蚊Culexpipienspallens、致倦庫蚊Culexquinquefasciatus、地中海實蠅Ceratitiscapitata、意大利蜂Apismellifera、家蠶Bombyxmori、果蠅Drosophilamelanogaster、家蠅Muscadomestica、斜紋夜蛾Spodopteralitura、小菜蛾P(guān)lutellaxylostella、蚱蠶Anthereapernyi、桔小實蠅Bactroceradorsalis、棉鈴蟲Helicoverpaarmigera、粘蟲Mythimnaseparata等，根據(jù)供試昆蟲的PGRP基因序列信息(Yoshidaetal.，1996；Yang，2015；任美佳，2019；郝志霞，2020；杜少萱等，2020)，利用 MEGA7.0進行序列比對分析并構(gòu)建埃及伊蚊PGRP-S2和其他昆蟲 PGRPs 的系統(tǒng)發(fā)育樹(貝葉斯法，1 000次重復)。

1.7 表達載體pCold-GST-PGRP-S2的構(gòu)建

根據(jù)IN-Fusion HD Cloning Kit說明書，將埃及伊蚊PGRP-S2的回收產(chǎn)物與BamH Ⅰ和Hind Ⅲ雙酶切的線性化pColdTMGST載體進行無縫克隆連接，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌JM109，篩選具有氨芐青霉素抗性的單克隆菌落，陽性克隆子用PCR以及BamH Ⅰ和Hind Ⅲ單雙酶切驗證，并送至鉑尚生物技術(shù)(上海)有限公司進行測序。測序驗證正確后，將質(zhì)粒熱擊轉(zhuǎn)化進BL21表達感受態(tài)細胞。

1.8 誘導表達

將單克隆菌株接種至含100 μg/mL Amp的5 mL LB試管中，37 ℃、200 r/min過夜活化。吸取1 mL菌液轉(zhuǎn)接于含100 μg/mL Amp的100 mL LB培養(yǎng)液中，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)至菌體OD600為0.6～0.8，在冰上放置30 min后，加入終濃度為0.8 mmol/L的IPTG(異丙基-β-D-硫代半乳糖苷)，15 ℃，200 r/min低溫誘導24 h。誘導結(jié)束離心收集菌體，用20 mL GST結(jié)合緩沖液(10 mmol/L PBS，pH7.5)重懸沉淀后再次離心，洗去菌體中的培養(yǎng)基。放置在冰上進行超聲波破碎，破碎后離心，用0.22 μmol/L濾膜將上清液過濾到新的離心管，即為可溶蛋白。

1.9 可溶蛋白PGRP-S2純化

取1 mL Glutathione Sepharose 4B填料加入親和層析柱。對目的可溶蛋白進行相應(yīng)親和層析純化。利用2 mL GST洗脫緩沖液(50 mmol/L Tris HCI, 300 mmol/L KCl,1 mmol/L DTT, 10 mmol/L Glutathione, pH7.5)洗脫蛋白，4 ℃靜置30 min,收集流出液。

1.10 重組蛋白的Western Blot檢測

取純化蛋白進行SDS-PAGE電泳，在恒壓100 V、200 mA的條件下進行凝膠轉(zhuǎn)膜，大約1.5 h；結(jié)束后用含5%脫脂奶粉的封閉液，37 ℃ 下將膜封閉2 h，用含吐溫-20的磷酸緩沖液(PBST)洗膜3次；將膜放于封閉液稀釋過的一抗(GST-tag monochonal antibody)中，室溫搖床孵育2 h，PBST洗滌3次，再放于封閉液稀釋過的二抗(AP標記山羊抗小鼠lgG)中，室溫搖床孵育2 h，PBST洗滌4次；將膜轉(zhuǎn)移到暗盒中，加入AP顯色液，進行顯色反應(yīng)，直至膜上出現(xiàn)清晰的條帶。

2 結(jié)果

2.1 埃及伊蚊PGRP-S2基因克隆及序列分析

設(shè)計埃及伊蚊PGRP-S2特異性引物，通過RT-PCR擴增，獲得一條500 bp的條帶，與預期大小一致(圖1-A)。將PCR產(chǎn)物回收并與連接線性化pColdTMGST載體連接后成功轉(zhuǎn)化于E.coliBL21表達菌株，用BamHⅠ單酶切獲得1條5 500 bp的條帶，用BamHⅠ和HindⅢ雙酶切則分別獲得1條5 000 bp的載體大小以及500 bp大小的目的基因條帶(圖1-B)。后經(jīng)sanger測序確定質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖1 PGRP-S2基因克隆電泳圖

2.2 埃及伊蚊PGRP-S2基因序列分析

提取并測定PCR及單雙酶切驗證正確的陽性克隆子質(zhì)粒，獲得埃及伊蚊PGRP-S2基因全長序列。通過測序分析，發(fā)現(xiàn)該序列的開放閱讀框長510 bp，可編碼170個氨基酸。CDD結(jié)構(gòu)域預測顯示該序列具有典型的PGRP超家族保守結(jié)構(gòu)域與酰胺酶結(jié)構(gòu)域(圖2)。選取埃及伊蚊PGRP-S2氨基酸序列及其他昆蟲PGRPs,使用 MEGA7.0軟件的鄰比對法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果發(fā)現(xiàn)埃及伊蚊AePGRP-S2與其他兩種埃及伊蚊的PGRPs聚類在同一分支上，說明二者親緣關(guān)系最近(圖3)。

圖2 埃及伊蚊PGRP-S2保守區(qū)域分析

圖3 埃及伊蚊PGRP-S2與其他昆蟲肽聚糖識別蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 重組蛋白的表達與純化

將PGRP-S2基因重組到pCold-GST載體上，并轉(zhuǎn)化到E.coliBL21(DE3)。提取并通過SDS-PAGE檢測總蛋白，發(fā)現(xiàn)IPTG誘導后在46 kDa處有一條特異蛋白，與預期一致(圖4-A)。為進一步確證該蛋白的表達，根據(jù)表達載體的GST標簽選用GST抗體通過Western blot進行檢測，發(fā)現(xiàn)GST標簽26 kDa和PGRP-S2蛋白46 kDa可被特異性檢出(圖4-B)，說明該蛋白已成功表達，且表達PGRP-S2蛋白可溶(圖4-A，B)。

圖4 SDS-PAGE 檢測純化的重組PGRP-S2蛋白

3 討論

先天免疫是昆蟲抵抗寄生蟲入侵和外界微生物感染的重要途徑。昆蟲先天免疫主要依靠病原菌的病原體相關(guān)分子模式(PAMPs)與宿主的模式識別受體(PRRs)，這些病原體相關(guān)分子模式(PAMPs)包括脂多糖、肽聚糖、脂磷壁等(任美佳，2019)，而PGRPs能夠識別微生物細胞壁上的肽聚糖，在昆蟲免疫中具有重要作用。第一個關(guān)于PGRP的報道來自于家蠶血淋巴的純化，分子量為19 kDa(Yoshidaetal.，1996)。后來陸續(xù)有多個PGRP家族成員被鑒定，根據(jù)5’端非翻譯區(qū)和轉(zhuǎn)錄長度，被分為長型與短型。研究發(fā)現(xiàn)，家蠶中的BmPGRP蛋白具有激活抗菌肽基因表達的作用(Yang，2015)，家蠅中的MdPGRP-LE受到干擾會降低幼蟲體內(nèi)分氧化物酶活性(郝志霞，2020)，小菜蛾的PGRP-S2蛋白具有與細菌結(jié)合識別功能(杜少萱等，2020)。埃及伊蚊也可通過自身的肽聚糖識別蛋白來識別入侵微生物的PGN，從而啟動免疫機制，提高蟲體抵御這些微生物的能力。

為進一步了解埃及伊蚊PGRP基因序列特征，本研究克隆得到埃及伊蚊AePGRP-S2基因，通過基因序列分析(圖2)發(fā)現(xiàn)該基因具有典型的PGRP超家族保守結(jié)構(gòu)域與酰胺酶結(jié)構(gòu)域。該結(jié)構(gòu)域與Ⅱ型N-乙酰-L丙氨酸酰胺酶活性位點高度相似，AePGRP-S2蛋白極有可能具有殺菌活性。但有些具有酰胺酶結(jié)構(gòu)域的PGRP蛋白沒有直接的抗菌活性，但是在與細菌結(jié)合后，進一步激活Toll通路，從而引起抗菌肽的表達(Mellrothetal.，2006，羅嫚等，2016)。因此，AePGRP-S2蛋白的酰胺酶活性及作用機制還需進一步深入探討。為進一步了解埃及伊蚊的與其他昆蟲的親緣關(guān)系，將埃及伊蚊AePGRP-S2基因與其他昆蟲的S型PGRPs基因構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹(圖3)，結(jié)果顯示AePGRP-S2與埃及伊蚊的其他兩種PGRPs親緣關(guān)系較高，說明二者在功能上具有一定的保守性。為進一步了解該基因的功能，本研究還體外異源表達了PGRP-S2，通過SDS-PAGE及Western Blot分析，發(fā)現(xiàn)該蛋白大小46 kDa。然而，PGRP-S2如何精細調(diào)控埃及伊蚊的免疫反應(yīng)機制還不確定，本研究對于該蛋白的序列特性的了解及表達蛋白產(chǎn)物的獲得為下一步工作開展該蛋白在埃及伊蚊體內(nèi)的免疫機能研究提供了重要理論基礎(chǔ)與實驗材料。