李建梅，孫靜宜，馬英橋，趙 月

隨著分子生物學發(fā)展，從分子機制了解腫瘤的發(fā)生、分化、增殖、浸潤等成為目前腫瘤基礎研究的熱點[1]。miR-328可減少細胞黏附、遷移及聚集，可調(diào)控毛細血管結構形成[2]。以往有研究發(fā)現(xiàn)，miR-328在多種腫瘤包括乳腺癌中表達明顯下調(diào)，提示miR-328為乳腺癌抑制性微小RNA[3]。腫瘤細胞轉移是因宿主和腫瘤之間一系列特異作用所致。整合素在腫瘤細胞與細胞外基質(zhì)間出現(xiàn)的一系列相互作用中發(fā)揮著重要作用，整合素細胞外基質(zhì)分子的細胞黏附受體可與細胞外基質(zhì)蛋白相互作用，從而介導腫瘤細胞轉移[4]。有生物信息學分析發(fā)現(xiàn)，蛋白整合素α5(ITGα5)是miR-328的靶點，而ITGα5水平升高對PI3K/AKT通路的激活也有重要作用[5]。因此我們推測，miR-328可能通過靶向ITGα5調(diào)節(jié)PI3K/AKT通路活性，對乳腺癌干細胞的分化、形成和轉移具有重要影響。本研究旨在探索miR-328、ITGα5在乳腺癌中的表達及與臨床病理特征、預后的關系，以期為乳腺癌的靶向治療提供新的策略。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2016年3月—2020年3月我院收治的乳腺癌317例，年齡≥60歲149例，<60歲168例；淋巴結轉移：有148例，無169例；TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期172例，Ⅲ～Ⅳ期145例；腫瘤直徑：≥2 cm 185例，<2 cm 132例；雌激素受體(ER)陽性160例，孕激素受體(PR)陽性174例。納入標準：均經(jīng)病理檢查證實為乳腺癌患者；在術前均未進行放療或化療；患者及家屬均簽署知情同意書；臨床資料完整。排除標準：存在血液系統(tǒng)或免疫系統(tǒng)疾病者；合并心、肝、腎等嚴重原發(fā)性疾病者；合并其他部位腫瘤者。

1.2miR-328、ITGα5檢查方法 miR-328：入院后抽取患者靜脈血液2 ml，使用密度梯度離心法分離患者外周血單個核細胞，用于提取RNA，并使用特異引物對miRNA進行逆轉錄，隨后使用熒光定量PCR反應檢測。ITGα5檢查：取病理標本，使用4%甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋，行4 μm厚連續(xù)切片，用于免疫組織化學SP染色和HE染色。由美國Cymbus Biotechnology公司提供ITGα5檢測試劑盒。具體實驗步驟根據(jù)試劑盒說明書進行。切片染色均使用PBS代替一抗作為陰性對照，陽性對照為染色陽性切片。結果判定：由2名經(jīng)驗豐富病理科醫(yī)生在雙盲情況下對結果進行判定，ITGα5陽性表達為細胞膜或胞質(zhì)內(nèi)有棕色顆粒。在高倍鏡(×400)下隨機選擇5個視野對切片進行觀察，每個視野200個細胞，一共計數(shù)1000個細胞。根據(jù)腫瘤細胞著色情況進行判定：Ⅰ為無反應或微弱反應、Ⅱ為棕色、Ⅲ為深棕色，計算染色情況為Ⅱ、Ⅲ的5個高倍鏡視野中陽性染色細胞的百分率，Ⅰ及陽性細胞數(shù)≤75%為低表達，>75%則為高表達[6]。

1.3觀察指標 對比癌組織及癌旁正常組織(距腫瘤切緣≥0.5 cm)中miR-328、ITGα5表達水平。分析miR-328與乳腺癌臨床病理特征的關系。分析ITGα5與乳腺癌臨床病理特征的關系及miR-328、ITGα5與乳腺癌預后的關系。

2 結果

2.1患者1年后生存情況 317例1年后生存285例，死亡32例，病死率為10.09%。

2.2不同組織中miR-328、ITGα5表達水平比較 癌組織及癌旁正常組織miR-328表達水平分別為5.124±1.159和6.854±1.718。癌組織miR-328表達水平低于癌旁正常組織(P<0.01)。癌組織及癌旁正常組織ITGα5高表達分別為175例(55.21%)和83例(26.18%)。癌組織ITGα5高表達率高于癌旁正常組織(P<0.01)。

2.3miR-328與乳腺癌臨床病理特征的關系 miR-328在淋巴結轉移、腫瘤直徑方面比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，在年齡、TNM分期及ER、PR表達方面比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 miR-328與乳腺癌臨床病理特征的關系

2.4ITGα5高表達與乳腺癌臨床病理特征的關系 ITGα5高表達在淋巴結轉移、TNM分期方面比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，在年齡、腫瘤直徑及ER、PR表達方面比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 ITGα5高表達與乳腺癌臨床病理特征的關系(例)

2.5乳腺癌患者預后危險因素分析 經(jīng)多因素Logistic回歸分析可知，淋巴結轉移、miR-328低表達、ITGα5高表達為乳腺癌患者預后的獨立危險因素(P<0.01)。見表3。

表3 乳腺癌患者預后危險因素分析

3 討論

腫瘤干細胞的功能受多種因素調(diào)控，如基因和表觀遺傳改變等。近年來，miRNAs作為一種非編碼短鏈RNA，在腫瘤干細胞中的作用日趨凸顯[7]。miRNAs也是乳腺癌的重要調(diào)節(jié)因子，miRNAs表達改變與乳腺癌的發(fā)生密切相關[8]。miR-328對肝細胞癌變和慢性髓系白血病有抑制作用，通過將miRNA進行列陣分析發(fā)現(xiàn)，miR-328對靶基因ABCG2和MMP-16具有直接的作用，可影響mRNA水平及SP細胞蛋白表達，從而達到抑制癌癥發(fā)生及進展的目的[9]。以往研究發(fā)現(xiàn)，miR-328對膠質(zhì)母細胞瘤內(nèi)的U87增殖有抑制作用，可延長患者生存期，也是膠質(zhì)母細胞瘤預后評估的有效指標[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-328在乳腺癌組織中表達水平低于癌旁正常組織，且腫瘤直徑越大、有淋巴結轉移的乳腺癌患者miR-328表達水平越低，且是乳腺癌患者預后的獨立危險因素，提示miR-328是乳腺癌的保護基因，其表達水平越低，患者預后情況越差，與既往文獻結果相符[11]。

ITGα5是整合素家族的重要成員，可與整合素β1(ITGβ1)結合形成二聚體，是基質(zhì)重要成分纖連蛋白的受體。腫瘤細胞表達的亞基經(jīng)過與宿主間質(zhì)細胞纖連蛋白結合后可影響腫瘤細胞的轉移和侵襲狀態(tài)[12]。有研究顯示，ITGα5高表達為肺癌患者預后的危險因素，在淋巴結轉移、TNM分期越高、預后不良患者中表達明顯上調(diào)，提示腫瘤細胞經(jīng)整合素介導，通過改變細胞外基質(zhì)黏附能力從而間接或直接調(diào)控腫瘤細胞的侵襲能力，從側面證明ITGα5與腫瘤細胞增殖和轉移密切相關[13]。ZHU等[14]從DNA、蛋白水平證明ITGα5有促進腫瘤細胞轉移和增殖的作用。本研究發(fā)現(xiàn)，ITGα5在乳腺癌組織中高表達，在癌旁正常組織中低表達，可能是因為基因調(diào)節(jié)機制[15]；且進一步分析ITGα5表達情況與乳腺癌患者臨床病理特征間的關系發(fā)現(xiàn)，ITGα5表達情況與乳腺癌患者淋巴結轉移、TNM分期有關，淋巴結轉移者、TNM分期越高者ITGα5表達水平越高，提示通過調(diào)節(jié)ITGα5表達可影響腫瘤細胞轉移。

生物信息學分析發(fā)現(xiàn)ITGα5是miR-328的靶點，而ITGα5水平升高對PI3K/AKT通路激活也有重要作用[16]。我們推測，miR-328-5p可能通過靶向ITGα5調(diào)節(jié)PI3K/AKT通路活性，對乳腺癌干細胞的分化、形成和轉移具有重要影響[17]。通過預后危險因素分析可知，淋巴結轉移、miR-328低表達、ITGα5高表達為乳腺癌患者預后的獨立危險因素，提示miR-328、ITGα5可作為乳腺癌惡性程度、預后評估的重要參考指標[18]。

綜上所述，miR-328為乳腺癌保護基因，在乳腺癌中表達下調(diào)，ITGα5表達上調(diào)，二者與患者臨床病理特征及預后密切相關。術后關注乳腺癌患者miR-328、ITGα5表達情況可有助于評估腫瘤生物學行為，對患者術后復發(fā)、預后評估及治療方案選擇有重要的參考價值。