邱宇軒,廖 沙,張?zhí)K玥,杜欣鍵,張 丹,梁 峰

目前潰瘍性結(jié)腸炎(UC)的治療藥物主要包括類固醇、免疫調(diào)節(jié)劑等，但臨床療效參差不齊，部分患者后期需要手術(shù)干預(yù)[1-2]。因此UC治療新藥的研發(fā)和應(yīng)用具有重要意義。吲哚丙酸(IPA)是色氨酸經(jīng)過腸道菌群代謝后的產(chǎn)物，研究發(fā)現(xiàn)其在抗癌[3]、預(yù)防糖尿病[4-6]、減輕中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)[7]、預(yù)防輻射損傷[8]等方面均有作用。但IPA是否有防治UC的作用尚不清楚。核轉(zhuǎn)錄因子κB(NF-κB)在UC的發(fā)病過程中起關(guān)鍵作用，活化的NF-κB能促進下游炎性細胞因子基因的轉(zhuǎn)錄，進一步放大炎癥級聯(lián)效應(yīng)。本研究采用葡聚糖硫酸鈉(DSS)構(gòu)建急性UC小鼠模型，通過小鼠疾病活動指數(shù)(DAI)、結(jié)腸組織病理評分、血清炎性指標、結(jié)腸組織炎性因子測定，探討IPA對急性UC小鼠的防治作用；并通過檢測NF-κB信號通路中關(guān)鍵分子NF-κB p65及磷酸化NF-κB p65(p-NF-κB p65)蛋白表達情況，探究IPA是否通過抑制NF-κB p65磷酸化而發(fā)揮對急性UC小鼠的保護作用。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物：SPF級6～8周雄性C57BL/6小鼠60只[北京維通利華公司，實驗動物許可證號：SCXK(京)2016-0006]，體質(zhì)量18～21 g。適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d,保證小鼠自由飲食、飲水，飼養(yǎng)環(huán)境溫度(23±1)℃，相對濕度為50%～60%。

1.1.2主要試劑與儀器:IPA(美國sigma公司)，DSS(上海源葉科技有限公司)，髓過氧化物酶(MPO)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-6(IL-6)、白細胞介素-1β(IL-1β)酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(美國 abcam公司)，BCA蛋白濃度測定試劑盒、兔抗GAPDH單克隆抗體、兔抗NF-κB單克隆抗體、兔抗p-NF-κB單克隆抗體、兔二抗(美國Cell Signaling Technology公司)。

1.2實驗方法

1.2.1小鼠分組與處理:將小鼠隨機分為對照組、DSS模型組(自由飲用3%DSS溶液7 d)和低、中、高劑量IPA組，每組12只。不同劑量IPA組(10、20、40 mg/kg)于DSS造模前2 d開始每日按各組劑量灌胃，直至處死小鼠。各組小鼠均在DSS造模第7日處死。

1.2.2一般情況和DAI:每日定時觀察小鼠精神狀態(tài)、體質(zhì)量變化、糞便性狀及便血情況等，根據(jù)體質(zhì)量下降、大便性狀和便血狀況評定DAI,見表1。

表1 疾病活動指數(shù)評分標準

1.2.3結(jié)腸長度:處死小鼠后，打開腹腔，分離結(jié)腸系膜，獲得盲腸至肛門全長，測量肛門至盲腸末端的長度。

1.2.4病理學(xué)評分:處死小鼠后，在距離肛門2 cm處取長約1 cm的結(jié)腸組織放于10%甲醛溶液中固定，石蠟包埋后行HE染色，光鏡下觀察并參照文獻[9]行病理學(xué)評分。病理學(xué)評分為炎性浸潤評分和組織損傷評分之和，炎性浸潤評分：未見大量炎性細胞浸潤計為0分，炎性細胞浸潤局限于黏膜層計為1分，炎性細胞浸潤黏膜下層計為2分，炎性細胞浸潤腸壁全層計為3分；組織損傷評分：腸壁形態(tài)正常計為0分，散在的黏膜層損傷計為1分，黏膜層局灶性潰瘍計為2分，廣泛黏膜層損傷、深達黏膜下層計為3分。

1.2.5ELISA檢測血清MPO：取各組小鼠外周血，根據(jù)ELISA試劑盒說明書測定MPO含量。

1.2.6ELISA檢測結(jié)腸組織TNF-α、IL-1β、IL-6及MPO：制備各組小鼠結(jié)腸組織勻漿，通過BCA法測定各樣本蛋白總量，再用對應(yīng)的ELISA試劑盒測定各蛋白因子含量。

1.2.7Western blot法檢測NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白表達：取各組小鼠結(jié)腸組織，加入蛋白裂解液，12 000×g離心20 min取上清液，采用BCA法測定蛋白濃度。10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳后，將蛋白轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜，室溫封閉1 h，一抗4 ℃孵育過夜，TBST洗膜3次，置于二抗中室溫孵育1 h。增強化學(xué)發(fā)光法顯影后，采用Eblot凝膠成像系統(tǒng)照相并分析。

2 結(jié)果

2.1各組小鼠DAI、結(jié)腸長度及結(jié)腸組織病理學(xué)評分比較 與對照組比較，DSS模型組DAI、結(jié)腸組織病理學(xué)評分明顯升高，結(jié)腸長度明顯縮短(P<0.01)；與DSS模型組比較，中、高劑量IPA組小鼠DAI降低，IPA各劑量組結(jié)腸長度均增加、結(jié)腸組織病理學(xué)評分降低(P<0.05，P<0.01)。見表2。

表2 各組小鼠DAI、結(jié)腸長度和病理學(xué)評分的影響

2.2各組小鼠結(jié)腸組織病理學(xué)表現(xiàn) 對照組結(jié)腸組織各層結(jié)構(gòu)完整，基本無炎性細胞浸潤。與對照組比較，DSS模型組在結(jié)腸組織各層均有大量炎性細胞浸潤，主要為中性粒細胞和淋巴細胞，大部分黏膜結(jié)構(gòu)消失，管壁結(jié)構(gòu)不完整。與DSS模型組比較，IPA各劑量組炎性細胞浸潤主要局限在黏膜層，上皮細胞大部分完整。見圖1。

圖1 各組小鼠結(jié)腸組織病理學(xué)表現(xiàn)(HE×100)

2.3各組小鼠血清MPO水平比較 血清MPO水平對照組為(160.91±23.08)pg/ml，DSS模型組為(350.82±22.53)pg/ml，低劑量IPA組為(288.11±36.49)pg/ml，中劑量IPA組為(252.33±56.31)pg/ml，高劑量IPA組為(267.55±44.15)pg/ml。DSS模型組MPO水平較對照組顯著升高(P<0.05)。與DSS模型組比較，IPA各劑量組血清MPO水平均降低(P<0.05)。

2.4各組小鼠結(jié)腸組織TNF-α、IL-1β、IL-6及MPO水平比較 DSS模型組結(jié)腸組織TNF-α、IL-1β、IL-6及MPO水平較對照組顯著升高(P<0.01)。與DSS模型組比較，IPA各劑量組結(jié)腸組織TNF-α、IL-1β、IL-6及MPO水平均降低(P<0.05，P<0.01)。見表3。

表3 各組小鼠結(jié)腸組織TNF-α、IL-1β、IL-6及MPO水平比較

2.5各組小鼠結(jié)腸組織NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白含量比較 與對照組比較，DSS模型組p-NF-κB p65/NF-κB p65比值顯著升高(P<0.01);與DSS模型組比較，IPA各劑量組p-NF-κB p65/NF-κB p65比值均顯著降低(P<0.05)。見圖2。

圖2 Western blot檢測各組小鼠結(jié)腸組織NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白表達

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)IPA干預(yù)可降低DSS誘導(dǎo)急性UC小鼠模型DAI評分，說明IPA對急性UC小鼠的臨床癥狀有明顯改善作用。DSS造模成功后，小鼠結(jié)腸組織中TNF-α、IL-6、IL-1β水平均明顯升高。IL-1β是早期炎癥反應(yīng)標志物，能進一步引起IL-6、TNF-α等多種炎性因子產(chǎn)生[10]。大量TNF-α破壞細胞緊密連接，增加腸道上皮通透性，促進炎性腸病的發(fā)展[11]。而IL-6是單核巨噬細胞所產(chǎn)生的重要促炎細胞因子，可促進中性粒細胞向炎性部位浸潤，并使下游轉(zhuǎn)錄激活因子3磷酸化，引起組織局部免疫功能失調(diào)[12]。本研究IPA各劑量組結(jié)腸組織中TNF-α、IL-6、IL-1β表達水平明顯降低，表明IPA可以通過抑制促炎細胞因子表達從而減輕結(jié)腸的炎癥反應(yīng)。MPO主要由中性粒細胞產(chǎn)生，可間接反映組織炎癥嚴重程度[13]。本研究發(fā)現(xiàn)IPA能夠降低DSS造模后小鼠血清及結(jié)腸組織MPO水平，說明IPA能一定程度減輕UC的局部和全身炎癥反應(yīng)。

從病理結(jié)果來看，DSS造模后小鼠結(jié)腸黏膜層完整性被破壞，部分腸道腺體消失，同時伴隨以中性粒細胞和淋巴細胞為主的大量炎性細胞浸潤，并可見隱窩膿腫出現(xiàn)。而當IPA干預(yù)后，小鼠結(jié)腸黏膜層結(jié)構(gòu)基本恢復(fù)完整，炎性細胞浸潤明顯減少，與MPO減少的結(jié)果相一致，同時杯狀細胞較DSS造模組明顯增加。

NF-κB是參與炎癥反應(yīng)相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的核轉(zhuǎn)錄因子，p65和p50亞單位組成的異二聚體是其發(fā)揮作用的常見形式。p-NF-κB p65具有顯著的促炎特性，可促進多種炎性因子基因的轉(zhuǎn)錄，在UC發(fā)病中起關(guān)鍵作用。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，IPA干預(yù)后p-NF-κB p65比例減低，表明IPA可抑制NF-κB信號通路中NF-κB p65的磷酸化，發(fā)揮其對UC的保護作用。

綜上，IPA可降低DSS誘導(dǎo)急性UC小鼠結(jié)腸組織中炎性細胞因子含量，減少DSS造成的組織損傷，作用機制可能與抑制NF-κB p65磷酸化有關(guān)。