劉立春，張立勝，張秋文，劉素媛，張新杰

據(jù)流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)，目前感染性角膜炎已成為我國(guó)角膜盲的首要誘因，其中真菌性角膜炎(FK)發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，部分地區(qū)發(fā)病率已躍居感染性角膜炎的首位，分析與糖尿病等全身慢性疾病增多以及抗生素、免疫抑制劑、糖皮質(zhì)激素的廣泛使用等有關(guān)[1]。FK主要由致病真菌引起，其病原體可通過(guò)釋放大量基質(zhì)金屬蛋白酶和蛋白水解酶刺激角膜基質(zhì)膠原纖維，誘導(dǎo)角膜潰瘍，而菌體抗原特性可引發(fā)角膜炎癥反應(yīng)，單純抗真菌藥物治療難以將患者炎癥反應(yīng)徹底消除[2]。因此，探究FK病原學(xué)特點(diǎn)及藥物耐藥性，對(duì)了解該病發(fā)病機(jī)制及選擇合適治療藥物至關(guān)重要?，F(xiàn)臨床已發(fā)現(xiàn)百余種真菌可誘發(fā)角膜感染，而地域、氣候、發(fā)病誘因等多種因素均會(huì)影響此類病原菌分布，導(dǎo)致各地區(qū)FK患者病原菌分布差異明顯[3]。目前鏈格孢菌、鐮刀菌、曲霉菌是我國(guó)FK患者的主要病原體，我國(guó)不同病原體中交替的鏈格孢菌感染人數(shù)呈逐年上升趨勢(shì)，但其所致特異性機(jī)制現(xiàn)尚未明確[4]。研究顯示，鏈格孢菌對(duì)大部分抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物較為敏感，所致角膜潰瘍癥狀較輕，施以有效的抗菌藥物后通常預(yù)后較好[5]。然而，目前臨床多側(cè)重于分析FK致病菌種類及藥物敏感性，尚無(wú)系統(tǒng)性研究報(bào)道病原菌屬與FK患者預(yù)后的關(guān)系。因此，本研究就不同病原菌屬與FK患者預(yù)后的關(guān)系進(jìn)行分析，以期為臨床治療該病提供新思路，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2018年1月—2019年12月我院收治的FK 120例(120只眼)為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)：符合《感染性角膜病臨床診療專家共識(shí)(2011年)》[6]中的FK診斷標(biāo)準(zhǔn)，角膜刮片培養(yǎng)、角膜共聚焦顯微鏡檢查和裂隙燈顯微鏡檢查均提示FK，真菌培養(yǎng)陽(yáng)性；無(wú)抗真菌藥物治療史；自愿簽署相關(guān)知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：角膜穿通傷者；細(xì)菌感染或棘阿米巴感染者；全身性多重感染或嚴(yán)重感染者；惡性腫瘤者；精神障礙者；有眼底病變者；有角膜移植手術(shù)史者；因肝腎功能不全或藥物過(guò)敏等原因無(wú)法行藥物治療者；治療依從性較差者；不能按時(shí)隨訪者。根據(jù)感染病原菌屬將FK 120例分為A組(病原菌屬為鏈格孢屬)20例、B組(病原菌屬為曲霉菌屬)28例、C組(病原菌屬為鐮刀菌屬)57例和D組(病原菌屬為其他菌屬)15例。4組一般資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。見(jiàn)表1。

表1 4組真菌性角膜炎患者一般資料比較

1.2病原菌培養(yǎng)與鑒定方法 采用奧布卡因(山東博士倫福瑞達(dá)制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H20051411)4 g/L行角膜表面麻醉，在角膜潰瘍病灶邊緣留取病灶刮取標(biāo)本并接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(上海圻明生物科技有限公司)，置于相對(duì)濕度40%、溫度28 ℃下的恒溫恒濕培養(yǎng)箱(姜堰市新康醫(yī)療器械有限公司)中培養(yǎng)3～10 d，后分離陽(yáng)性標(biāo)本中菌落至馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平皿(上海圻明生物科技有限公司)。絲狀真菌菌落采取小培養(yǎng)法種屬鑒定，以小培養(yǎng)后光鏡下發(fā)現(xiàn)菌絲和孢子特征、肉眼菌落特征為鑒定依據(jù)；酵母樣真菌采用生化反應(yīng)鑒定法，利用法國(guó)生物梅里埃公司API 20C AUX酵母菌鑒定試劑盒鑒定。

1.3抗真菌藥物敏感試驗(yàn)方法 選擇Rosco紙片擴(kuò)散法行抗真菌藥物敏感試驗(yàn)。挑取真菌菌落置于生理鹽水中并制成均勻菌液(麥?zhǔn)蠞岫?.5～1.0)。后將菌液均勻涂布于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平皿，貼上Neo-Sensitab抗真菌藥物敏感試驗(yàn)紙片(丹麥ROSCO公司)后檢測(cè)。以伊曲康唑、氟康唑、那他霉素、兩性霉素B為試驗(yàn)藥物。在相對(duì)濕度40%、溫度28 ℃環(huán)境下培養(yǎng)24～48 h后行抑菌環(huán)(真菌生長(zhǎng)被完全抑制的環(huán)形區(qū)域)直徑測(cè)量，按照直徑大小判定耐藥、中介或敏感，具體判定標(biāo)準(zhǔn)[7]見(jiàn)表2。

表2 不同抗真菌藥物敏感試驗(yàn)判定標(biāo)準(zhǔn)

1.4治療方法 入院后所有患者給予那他霉素滴眼液(北京銀建藥業(yè)有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H20083650)滴眼，每次1滴，每小時(shí)1次；伊曲康唑膠囊(成都倍特藥業(yè)有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H20010767)0.2 g每日1次口服。待抗真菌藥物敏感試驗(yàn)結(jié)果出來(lái)后按照患者具體情況調(diào)整用藥。藥物療效欠佳時(shí)根據(jù)具體情況行手術(shù)治療，中央和旁中央中淺層角膜潰瘍者給予板層角膜移植術(shù)，旁中央淺層角膜潰瘍者給予病灶切除聯(lián)合羊膜移植術(shù)，周邊中淺層角膜潰瘍者給予病灶切除聯(lián)合結(jié)膜瓣覆蓋術(shù)，角膜潰瘍穿孔或后彈力層膨出者給予穿透性角膜移植術(shù)，近全角膜或全角膜膿性潰瘍并伴有嚴(yán)重并發(fā)癥者給予眼內(nèi)容物剜除術(shù)。

1.5觀察指標(biāo) ①觀察FK患者病原菌屬分布情況。②分析FK患者主要病原菌屬對(duì)藥物的耐藥率。③探討不同病原菌屬與FK患者預(yù)后的關(guān)系。按照治療方式將FK患者預(yù)后分為4個(gè)等級(jí)，Ⅰ級(jí)為藥物治愈，Ⅱ級(jí)為采用板層角膜移植術(shù)、病灶切除聯(lián)合羊膜移植術(shù)、病灶切除聯(lián)合結(jié)膜瓣覆蓋術(shù)治療，Ⅲ級(jí)為采用穿透性角膜移植術(shù)治療，Ⅳ級(jí)為采用眼內(nèi)容物剜除術(shù)治療。④比較4組藥物治愈患者用藥時(shí)間和停藥后4周患眼最佳矯正視力。藥物治療后角膜潰瘍處愈合，角膜共聚焦顯微鏡檢查示無(wú)真菌菌絲，停藥后4周內(nèi)無(wú)復(fù)發(fā)，即為藥物治愈[8]。

2 結(jié)果

2.1病原菌屬分布情況 120例FK共培養(yǎng)出127株真菌，其中鐮刀菌屬最多占44.88%，其次為曲霉菌屬(25.98%)、鏈格孢屬(15.75%)。見(jiàn)表3。

表3 真菌性角膜炎患者病原菌屬分布情況

2.2主要病原菌屬藥物耐藥率分析 鏈格孢屬、曲霉菌屬、鐮刀菌屬對(duì)氟康唑和伊曲康唑耐藥率均較高，對(duì)那他霉素和兩性霉素B耐藥率均較低。見(jiàn)表4。

表4 真菌性角膜炎患者主要病原菌屬藥物耐藥率分析

2.3不同病原菌屬與FK患者預(yù)后關(guān)系 B、C組預(yù)后水平較A、D組差(P<0.05)，B、C組之間和A、D組之間預(yù)后水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表5。

表5 不同病原菌屬與FK患者預(yù)后的關(guān)系[例(%)]

2.44組藥物治愈患者用藥時(shí)間和停藥后4周患眼最佳矯正視力比較 藥物治愈患者用藥時(shí)間C組明顯長(zhǎng)于A、B、D組(P<0.05)，A、B、D組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；藥物治愈患者停藥后4周患眼最佳矯正視力A組高于B、C、D組(P<0.05)，B、C、D組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表6。

表6 4組藥物治愈FK患者用藥時(shí)間和停藥后4周患眼最佳矯正視力比較

3 討論

FK是一種致盲率極高的感染性角膜病，若角膜炎癥無(wú)法控制，極有可能出現(xiàn)角膜穿孔，甚至發(fā)生眼內(nèi)容物脫出、繼發(fā)性眼內(nèi)炎等嚴(yán)重并發(fā)癥而必須行眼球摘除術(shù)或眼內(nèi)容物剜除術(shù)[9]。而FK致病菌屬繁多，菌譜隨地域、時(shí)間變化也會(huì)發(fā)生改變，并且不同病原菌屬毒力各異，對(duì)抗真菌藥物的敏感性也不盡相同，患者臨床表現(xiàn)差異明顯，如鏈格孢屬感染者臨床體征較輕，曲霉菌屬、鐮刀菌屬感染者臨床體征較為嚴(yán)重[10-11]。盡管目前臨床上分析FK病原學(xué)特點(diǎn)及藥物敏感性的報(bào)道較多，但是不同病原菌屬與FK患者預(yù)后的關(guān)系相關(guān)研究較少，故本研究對(duì)此進(jìn)行初步探討。

本研究結(jié)果顯示，120例FK共培養(yǎng)出127株真菌，其中鐮刀菌屬最多占44.88%，其次為曲霉菌屬占25.98%、鏈格孢屬占15.75%，這一結(jié)論與TANANUVAT等[12]報(bào)道相似。張陽(yáng)等[13]報(bào)道我國(guó)FK患者病原菌屬以鐮刀菌屬為主，其次為曲霉菌屬和鏈格孢屬，支持本研究結(jié)論。聞興慧[14]也發(fā)現(xiàn)鐮刀菌屬是我國(guó)FK患者首要致病菌，其次為曲霉菌屬，與本研究結(jié)果相似。但胡衛(wèi)萍等[15]認(rèn)為我國(guó)FK患者曲霉菌屬占比高于鐮刀菌屬和鏈格孢屬，與本研究結(jié)論不一致，推測(cè)與FK病原菌屬分布存在顯著地域性差異有關(guān)。本研究FK患者中鏈格孢屬感染占比也較高，推測(cè)與本研究入選患者中從事戶外農(nóng)業(yè)生產(chǎn)人員較多有關(guān)。由于此類患者容易出現(xiàn)直接植物性外傷，誘發(fā)鏈格孢屬感染，故從事戶外農(nóng)業(yè)生產(chǎn)者應(yīng)強(qiáng)化眼部保護(hù)，以降低植物性外傷所致FK發(fā)生率。此外，本研究結(jié)果顯示，鏈格孢屬、曲霉菌屬、鐮刀菌屬對(duì)氟康唑和伊曲康唑的耐藥率均較高，對(duì)那他霉素和兩性霉素B的耐藥率均較低，與CHONGKAE等[16]報(bào)道結(jié)論吻合。提示不同病原菌屬FK患者對(duì)抗真菌藥物的敏感性存在差異，臨床應(yīng)根據(jù)藥物敏感試驗(yàn)結(jié)果給予針對(duì)性抗菌藥物治療。分析上述致病菌對(duì)氟康唑的耐藥率均較高的原因，可能與氟康唑?qū)εR床眼科常見(jiàn)病原菌天然耐藥有關(guān)。

本研究結(jié)果顯示，B、C組預(yù)后水平較A、D組差，提示不同病原菌屬會(huì)影響FK患者預(yù)后。曲霉菌屬感染通過(guò)釋放毒素、機(jī)械性損傷等機(jī)制可引發(fā)角膜組織損傷，并且可通過(guò)產(chǎn)生降解膠原纖維的酶類溶解并破壞角膜組織，釋放抑制機(jī)體免疫物質(zhì)，逃避機(jī)體免疫殺傷，故此類患者預(yù)后不理想。鐮刀菌屬感染同樣可通過(guò)釋放毒素與直接機(jī)械性損傷引發(fā)角膜組織破壞，同時(shí)入侵到角膜組織的菌絲還可能誘發(fā)菌絲細(xì)胞壁增厚、菌絲內(nèi)套菌絲情況，致使致病力和耐藥性增強(qiáng)，故臨床治療頗為棘手。而鏈格孢屬致病力較低，對(duì)角膜毒力輕微，所致角膜潰瘍癥狀較輕，通常藥物治療效果頗為理想。但王璐璐等[17]認(rèn)為曲霉菌屬所致FK患者預(yù)后最差，與本研究結(jié)論存在偏倚，推測(cè)與預(yù)后水平分級(jí)不同有關(guān)。

本研究結(jié)果顯示，藥物治愈患者用藥時(shí)間C組明顯長(zhǎng)于A、B、D組，推測(cè)可能是鐮刀菌屬感染出現(xiàn)菌絲細(xì)胞壁增厚情況，使得其具有較強(qiáng)的耐藥性，而那他霉素滴眼液存在水溶性較差、角膜通透性偏低等缺陷，故該類患者用藥時(shí)間明顯延長(zhǎng)。有研究指出，鐮刀菌屬所致FK患者病情進(jìn)展迅速，可出現(xiàn)大面積侵襲感染，這可能也是造成FK患者用藥時(shí)間延長(zhǎng)的重要原因[18]。此外，本研究結(jié)果還顯示，藥物治愈患者停藥后4周患眼最佳矯正視力A組高于B、C、D組，與CHIDAMBARAM等[19]報(bào)道結(jié)論相似。推測(cè)原因?yàn)殒湼矜邔俑腥径嘀聹\表角膜潰瘍，通常藥物療效較好，并且潰瘍愈合后形成的角膜云翳通常較淡，有助于患者視力恢復(fù)。劉欣等[20]也發(fā)現(xiàn)鏈格孢屬所致FK患者臨床體征較輕，一般藥物治療效果較好。

綜上，鏈格孢屬、曲霉菌屬、鐮刀菌屬是FK患者三大常見(jiàn)病原菌屬，對(duì)那他霉素和兩性霉素B耐藥率均較低，其中曲霉菌屬和鐮刀菌屬感染FK患者預(yù)后較差，臨床應(yīng)根據(jù)藥物敏感試驗(yàn)結(jié)果給予針對(duì)性抗菌藥物治療。但本研究也存在一些不足，如納入研究的FK患者例數(shù)偏少，未分析感染嚴(yán)重程度與病原菌屬分布特點(diǎn)之間的關(guān)系，這可能對(duì)研究結(jié)論的普適性有一定影響；對(duì)不同病原菌屬與FK患者預(yù)后相關(guān)的具體原因未能明確，有待今后深入研究。