崔翰博，褚月頡，蘇明，關(guān)懌，任永麗

（天津市中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院，天津 300120）

糖尿病大血管并發(fā)癥（DMC）是因糖代謝等異常導(dǎo)致的發(fā)生于動脈血管的動脈粥樣硬化性病變，其病理可見泡沫細胞形成、動脈內(nèi)膜增厚、粥樣硬化斑塊形成，甚至動脈血管閉塞等。常見的危險因素包括年齡、性別、高血壓、吸煙、體質(zhì)量指數(shù)、病程、血脂等因素[1]。最新的流行病調(diào)查顯示中國成年人糖尿病發(fā)病率已達11．2%[2]，而僅是屬于糖尿病大血管病變的心血管病變就占到糖尿病患者65%的死亡原因[3]。因此預(yù)防其大血管并發(fā)癥的發(fā)生和發(fā)展具有重要意義。

補脾胃瀉陰火升陽湯出自李東垣《脾胃論》，是甘溫除熱法代表方劑之一。甘溫除熱法指采用味甘性溫的藥物來治療某些虛性熱證（即陰火）的治法。通過臨床觀察和實踐專家們認為糖尿病及其并發(fā)癥的形成和發(fā)展與陰火具有密切聯(lián)系，治療中以本方化裁干預(yù)，發(fā)現(xiàn)其在協(xié)助穩(wěn)定血糖的同時對糖尿病大血管并發(fā)癥也具有較好的預(yù)防作用。本研究通過觀察補脾胃瀉陰火升陽湯對腸道菌群、氧化三甲胺（TMAO）及相關(guān)血管損傷標(biāo)記物等的影響，初步探索糖尿病大血管并發(fā)癥的形成與陰火損傷的可能關(guān)聯(lián)，探討甘溫除熱法對糖尿病血管并發(fā)癥可能的保護機制。

1 材料與儀器

1.1 動物及分組 雄性Hartley豚鼠（300～400 g）36只，6周齡，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。室溫（22±2）℃，保持安靜?？紤]到預(yù)實驗中豚鼠糖尿病模型病死率較高，在分組時增加模型組與干預(yù)組樣本量。按照隨機數(shù)字表法分為空白組6只、模型組14只、干預(yù)組16只。

1.2 主要試劑 鏈尿佐菌素（STZ）Solarbio-301A025；酶聯(lián)免疫吸附法試劑盒豚鼠TMAO（貨號：TAE-833g）、脂多糖（LPS，貨號：TAE-261g）、腫瘤壞死因子（TNF）-α（貨號：TAE-569g）、細胞間黏附分子（ICAM）-1（貨號：TAE-362g）、血管細胞黏附分子（VCAM）-1（貨號：TAE-576g），以上均購自天津安諾瑞康生物技術(shù)有限公司。腸道菌群檢測委托北京諾禾致源生物信息科技有限公司檢測。

1.3 主要儀器 酶標(biāo)儀：北京普朗科技有限公司，型號：DNM-9602；純水儀：寧波丹斯博，型號：CANSH；恒溫箱：上海一恒，型號：DHP9121B。

2 實驗方法

2.1 模型制備 包括動脈粥樣硬化造模和糖尿病造模。

2.1.1 動脈粥樣硬化造模 對“模型組”和“干預(yù)組”飼喂高脂飲食以誘導(dǎo)動脈粥樣硬化。在適應(yīng)性喂養(yǎng)5 d后進行，持續(xù)至實驗結(jié)束。高脂餐配方：2%膽固醇，0．3%膽酸鈉，10%豬油，87．7%普通豚鼠飼料。

2.1.2 糖尿病造模 飼喂高脂飲食1周后對“模型組”和“干預(yù)組”采用中小劑量多次腹腔注射STZ誘導(dǎo)其產(chǎn)生糖尿病。STZ注射濃度45～150 mg/kg（采用檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，調(diào)整 pH 至 4．2～4．6，STZ濃度為10 mg/mL）；空白組腹腔注射相同標(biāo)準(zhǔn)體積的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液?？紤]到預(yù)實驗中豚鼠死亡率較高，以及空腹時低血糖帶來的死亡率。1周后復(fù)測隨機血糖（RBG）高于7．8 mmol/L的樣本為合格。對不合格樣本予以重復(fù)造模，1周后重復(fù)1次，3次仍不能成模樣本予以剔除。

2.2 藥物制備及干預(yù)方法 補脾胃瀉陰火升陽湯組成及用量如下：黃芪20 g，黨參15 g，柴胡20 g，升麻 12 g，麩炒蒼術(shù) 15 g，羌活 15 g，黃芩 10 g，黃連10 g，石膏15 g，甘草15 g。以上各味藥物飲用水浸泡30 min，煎煮兩次，每次30 min，得藥汁后以65℃水浴濃縮至 200 mL（相當(dāng)于 0．735 g 生藥/mL），經(jīng)動物體表面積折算豚鼠等效劑量為13 mL/（kg·d）。

“干預(yù)組”采用中藥湯劑每日1次灌胃，“模型組”及“空白組”采用等劑量生理鹽水灌胃。中藥干預(yù)從適應(yīng)性喂養(yǎng)結(jié)束后開始，持續(xù)7周。

2.3 樣本采集 干預(yù)第7周末，動物空腹6 h后麻醉，立即開腹下腔靜脈取血，制備血清備檢；處死動物后手術(shù)切取主動脈弓，立即浸入固定液，以備制片（HE染色切片交由易生源檢測技術(shù)服務(wù)有限公司）。切開結(jié)腸收集糞便樣本于無菌糞便盒中，提取總DNA后送檢16S rDNA擴增子測序。

2.4 腸道菌群檢測及分析 PCR擴增后基于Illumina Nova測序平臺測序，構(gòu)建PCR-free文庫，然后進行雙末端（Paired-End）測序。通過對Reads拼接，測得每樣本tags總量，將質(zhì)控后獲得的有效數(shù)據(jù)以97%的一致性（Identity）將序列聚類成為分類單位（OTUs），然后對OTUs序列與Silva138數(shù)據(jù)庫進行物種注釋。根據(jù)所有樣本在屬水平的物種注釋及豐度信息，選取豐度排名前35的屬，根據(jù)其在每個樣本中的豐度信息，從物種和樣本兩個層面進行聚類，繪制成熱圖，便于發(fā)現(xiàn)哪些物種在哪些樣本中聚集較多或含量較低。

2.5 統(tǒng)計學(xué)分析 數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19．0統(tǒng)計軟件處理，各組數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SN-K檢驗，P＜0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 實驗結(jié)果

除去死亡脫落和剔除未成模動物后，空白組6只，模型組8只、干預(yù)組9只。對以上樣本進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計。

3.1 對空腹血糖（FBG）、隨機血糖、總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）水平的影響 與空白組比較，干預(yù)組FBG 顯著升高（P＜0．01）；模型組 FBG 與空白組比較無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0．05）；與空白組比較，模型組與干預(yù)組 RBG 水平明顯升高（P＜0．01）；3組間 TC、TG 水平無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0．05）。見表1。

表1 對DMC豚鼠血糖、血脂的影響Tab.1 Effects on blood glucose and blood lipid of DMC guinea pigs

3.2 對 TMAO、LPS、TNF-α、ICAM-1、VCAM-1 水平的影響 與空白組、干預(yù)組比較，模型組TMAO水平明顯升高（P＜0．01）；空白組與干預(yù)組間 TMAO水平無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0．05）。與空白組比較，模型組LPS、VCAM-1 水平明顯升高（P＜0．05）。但在空白組與干預(yù)組間、模型組與干預(yù)組間均無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0．05）。3組間TNF-α、ICAM-1水平無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0．05）。見表2。

表2 對DMC豚鼠的TMAO、LPS、TNF-α、ICAM-1、VCAM-1影響Tab.2Effects on TMAO，LPS，TNF-α，ICAM-1，VCAM-1 of DMC guinea pigs

3.3 對腸道菌群的影響 通過對Reads拼接，平均每樣品測得101 622條tags，經(jīng)過質(zhì)量控制平均得到100849條有效數(shù)據(jù)，質(zhì)控有效數(shù)據(jù)量達63 826，質(zhì)控有效率達62．84%。以97%的一致性（Identity）將序列聚類成為OTUs，共得到4 807個OTUs，然后對OTUs序列與Silva138數(shù)據(jù)庫進行物種注釋。注釋結(jié)果中，共有1 477（30．73%）個OTU注釋到屬水平。

在門水平上，占據(jù)主導(dǎo)地位的主要包括Bacteroidota（擬桿菌門）、Firmicutes（厚壁菌門）、Proteobacteria（變形菌門）；在綱水平上主導(dǎo)的為Bacteroidia（擬桿菌綱）、Clostridia（梭狀芽孢桿菌綱）、Gammaproteobacteria（γ亞群變形菌綱）；在目水平上的優(yōu)勢物種為Bacteroidales（擬桿菌目）、Clostridia_UCG-014（梭狀芽孢桿菌目）、Oscillospirales（顫螺菌目）；在科水平上的優(yōu)勢物種為 Muribaculaceae、Lachnospiraceae（毛螺菌科）、Ruminococcaceae（瘤胃菌科）；在屬水平上的優(yōu)勢物種為 Ruminococcus（瘤胃球菌屬）、Parasutterella（副薩特氏菌屬）、Akkermansia（阿克曼菌屬）；優(yōu)勢種為Bifidobacterium_magnum（雙歧桿菌）、Bacteroides_dorei（多雷擬桿菌）、Bacteroides_acidifaciens（產(chǎn)酸芽孢桿菌）。

腸道菌群豐度聚類圖如圖1所示，。在屬水平上，通過heatmap圖可從整體上展示差異物種在各組間的分布情況，該圖不僅能夠展示出某一物種在樣本中的豐度信息，還給出了該物種在組間的顯著性檢驗結(jié)果。結(jié)果顯示：與空白組比較，模型組的Ruminococcus（P＜0．01）、Arthrobacter（節(jié)桿菌屬）、Solirubrobacter（土壤紅桿菌屬）、Ileibacterium、Alistipes（理研菌屬）、Faecalibacterium（糞桿菌屬）豐度顯著降低（P＜0．05）；UCG-005（P＜0．01）、Methanobrevibacter（甲烷短桿菌屬）、achnospiraceae（毛螺菌科）_NK4A136_group、Colidextribacter、Akkermansia豐度顯著增高（P＜0．05）。較模型組，干預(yù)組的 Arthrobacter、Solirubrobacter（P＜0．01）、Lactobacillus（乳酸菌）、Colidextribacter、Papillibacter、Christensenellaceae（克里斯滕森菌科）_R-7_group、Desulfovibrio（脫硫弧菌）豐度顯著降低（P＜0．05）；Faecalibacterium 豐度顯著增高（P＜0．01）。見圖2。

圖1 各組腸道菌群豐度聚類圖Fig.1 Cluster diagram of intestinal flora abundance in each group

圖2 各組腸道菌群豐度heatmap圖Fig.2 Heatmap of intestinal flora abundance in each group

3.4 對主動脈石蠟切片HE染色的影響 空白組內(nèi)膜光滑，平滑肌細胞排列整齊清?。ㄒ妶D3a、3b、3c）。模型組可見平滑肌細胞中散見較多空泡樣變性（圖中橫線標(biāo)示處），在中膜外層和外膜尤為明顯，未見明顯泡沫細胞形成（見圖3d、3e、3f）。干預(yù)組可見少量空泡樣變性，較模型組明顯減少，未見泡沫細胞（見圖3g、3h、3i）。

圖3 各組主動脈弓石蠟切片HE染色（×400）Fig.3 HE staining of paraffin sections of aortic arch in each group（×400）

4 討論

糖尿病屬于中醫(yī)消渴病范疇。消渴病病機為李東垣所提出的“陰火”證范疇，而“脾虛精微不呈、心肺陰虛生火”為其基本病機[4]。《脾胃論》曰：“蓋陰火上沖，則氣高而喘，為煩熱、為頭痛、為渴、為脈洪”?！秲?nèi)外傷辨惑論》曰“致陰火上沖，作蒸蒸燥熱”?？梢娎顤|垣所述煩、渴、燥熱等陰火見癥皆可見于消渴。脾胃受損升降失序為陰火的病機基礎(chǔ)：脾不升清，津液失布，傳化失常而為腹脹、便秘、大便黏膩、便溏腹瀉[5]、舌苔厚膩等癥。消化系統(tǒng)癥狀的聚集預(yù)示著與腸道菌群之間的密切聯(lián)系。消渴病陰火熏灼脈絡(luò)、日久脈絡(luò)損傷進而導(dǎo)致血管并發(fā)癥。李東垣指出“血中伏火”與“陰血伏火”，陰火潛藏在血絡(luò)中，損傷陰液，日久生痰致瘀，形成糖尿病血管并發(fā)癥[6]甚至下肢動脈閉塞[7]。由此筆者提出“陰火致消”與“陰火致變”理論。

據(jù)報道，高脂飲食喂養(yǎng)的豚鼠可在8周形成動脈粥樣硬化斑塊[8]，本實驗中僅觀察到空泡樣變性而未見有泡沫細胞形成，可能是受限于造模的時間。同時模型組VCAM-1水平升高，提示存在動脈損傷。干預(yù)組空泡樣變性較模型組減少，VCAM-1水平下降并接近空白組水平，提示動脈損傷相對減輕。研究發(fā)現(xiàn)合并糖尿病的冠心病患者中擬桿菌門豐度較低，而厚壁菌門和變形菌門顯著增高；有益菌或共生菌（如普氏棲糞桿菌和脆弱擬桿菌）明顯減少，機會致病菌（如腸桿菌科、鏈球菌和脫硫弧菌）明顯增多[9]。本實驗中也觀察到了中藥干預(yù)后糞桿菌屬豐度的增高和致病菌脫硫弧菌屬豐度的減低，但中藥干預(yù)組有益菌乳酸菌豐度降低，提示一定程度上改善了腸道菌群結(jié)構(gòu)但與正常菌群仍有所不同。腸道菌群發(fā)生紊亂時可能造成腸壁通透性增加和LPS進入機體環(huán)境并誘發(fā)慢性炎癥和動脈內(nèi)膜的損傷。模型組可見LPS顯著升高，而中藥干預(yù)組LPS水平的降低可能與其調(diào)節(jié)腸道菌群失衡有關(guān)。2型糖尿病患者的腸道菌群紊亂導(dǎo)致TMAO產(chǎn)生增多，預(yù)示著不受傳統(tǒng)危險因素、腎功能和血糖控制關(guān)系影響的較高的主要心臟不良事件（3年主要心臟不良事件風(fēng)險增加3．0倍）和死亡風(fēng)險（5年死亡風(fēng)險增加3．6倍）[10]。通過TMAO處理16周的SAMR1小鼠和 SAMP8小鼠觀察到 SA-β-gal、p53、p21衰老標(biāo)記物的高表達以及血管功能障礙和重構(gòu)，這可能與抑制SIRT1表達和氧化應(yīng)激增加，從而激活p53/p21/Rb通路有關(guān)[11]。因此，TMAO被認為與糖尿病血管并發(fā)癥的發(fā)生密切相關(guān)。本實驗中，模型組TMAO水平顯著升高、腸道菌群較空白組出現(xiàn)顯著差異而通過補脾胃瀉陰火升陽湯干預(yù)后TMAO水平顯著降低至接近正常水平，可能與干預(yù)組較輕的血管病變有關(guān)。紊亂的腸道菌群通過增加TMAO的產(chǎn)生，加速了動脈的損傷[12]。

模型組FBG均值與空白組接近，但離散度很大，因部分個體出現(xiàn)空腹低血糖所致（最低致2．2 mmol/L），提示血糖波動性較大，而中藥干預(yù)后則未見空腹低血糖的情況。近年來，血糖波動也被認為是糖尿病血管損傷的重要原因[13]。因此，該模型血管并發(fā)癥的形成與血糖波動也有一定聯(lián)系。同時也印證了甘溫除熱法對于預(yù)防糖尿病血糖或血糖波動方面潛在的療效[14]。脾胃乃精微運化之樞，陰火證脾胃損傷精微下流可能是產(chǎn)生血糖波動的原因[15]。培補中焦使精微能夠上呈從而避免了低血糖的發(fā)生[16]和減少了血糖波動[17]，延緩了血管并發(fā)癥的進展。此外，模型組血脂（TC、TG）略有升高但并無統(tǒng)計學(xué)差異，提示血脂異?？赡懿⒎窃撃Ｐ蛣用}損傷的原因，同時本方的血管保護作用也并非通過調(diào)節(jié)血脂水平達到的。

陰火證脾胃損傷、濕熱內(nèi)盛的病機或許與腸道菌群失調(diào)狀態(tài)有關(guān)[18]；實驗中觀察到模型組腸道菌群結(jié)構(gòu)顯著變化，而腸道菌群紊亂的臨床表現(xiàn)可能包括舌苔的變化、大便性狀或節(jié)律的改變等，這一點也符合脾胃虛損這一陰火的病機基礎(chǔ)。陰火鴟張，血中伏火熏灼絡(luò)脈，可能與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)低度炎癥有關(guān)[19]；精微耗損與虛熱灼損為其血管并發(fā)癥形成的關(guān)鍵。李東垣謂：“今飲食損胃，勞倦傷脾，脾胃虛則火邪乘之，而生大熱，當(dāng)先于心分補脾之源。蓋土生于火，兼于脾胃中瀉火之亢甚，主生化之源”。方中黃芪、人參補脾胃之傷，化生營氣之源，以濟心肺而熄陰火之燔灼；蒼術(shù)、羌活燥濕，祛“脾胃下流之濕氣”；柴胡、升麻升陽醒脾，助精微清陽上呈心肺；酌以黃芩、黃連、石膏以除陰火之燔灼。補脾胃瀉陰火升陽湯令精微上呈，陰火消熄則不復(fù)灼燒脈絡(luò)，從而延緩了糖尿病血管并發(fā)癥的發(fā)生。