孫瀟，于樹濤，孫玉江，張孝忠，張國(guó)梁，宋俊霖

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室，山東青島 266109，2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院；3.萊陽(yáng)市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，山東煙臺(tái) 265200)

赤霉烯酮 (zearalenone，ZEA ) 是由鐮刀菌產(chǎn)生的霉菌毒素，常見于玉米、小麥、燕麥和麥草中，分子式 C18H22O5。ROMER檢測(cè)中心國(guó)內(nèi)畜禽谷物原料與飼料霉菌毒素檢測(cè)報(bào)告顯示[1]，大中型飼料與養(yǎng)殖企業(yè)采集樣品中霉菌毒素的檢出比例為95%，青貯飼料中ZEA檢出率為65%。有報(bào)道表明，動(dòng)物攝入霉菌毒素后可能會(huì)出現(xiàn)腹瀉、腸道出血、繁殖性能降低、發(fā)育異常等癥狀[2]。驢誤食霉菌毒素后會(huì)發(fā)生肝出血、脾淤血、腸道積液等病理現(xiàn)象，嚴(yán)重中毒時(shí)可能會(huì)死亡[3-5]。2019年全國(guó)驢存欄量260.1萬(wàn)頭[6]，產(chǎn)值近千億元。山東省規(guī)?；B(yǎng)驢場(chǎng)存欄量占全省驢存欄總量的80%，同時(shí)占全國(guó)300頭以上規(guī)模養(yǎng)殖場(chǎng)的61%[7]。目前，馬屬動(dòng)物飼草料中霉菌毒素含量尚未出臺(tái)國(guó)家或者地方標(biāo)準(zhǔn)，然而集約化養(yǎng)驢場(chǎng)的飼草料中ZEA等霉菌毒素含量過高已經(jīng)成為損害驢繁殖性能的重要原因之一[8-9]。但是，到目前為止此類問題并未引起廣泛和足夠的重視。因此，探究ZEA等霉菌毒素妨害驢繁殖性能的主要途徑與作用機(jī)制可制定飼草料中該毒素限量的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，為促進(jìn)家畜高效繁殖和健康養(yǎng)驢提供理論支持。

PI3K (胞內(nèi)磷脂酰肌醇激酶，Phosphatidylinositide 3-kinases)參與調(diào)節(jié)了細(xì)胞凋亡、轉(zhuǎn)錄等多種細(xì)胞內(nèi)生物過程[10]。PI3K的主要下游效應(yīng)子是Akt (絲氨酸/蘇氨酸特異性蛋白激酶，又稱 PKB，protein kinase B)，PI3K被激活與磷酸化后引起Akt活化來(lái)調(diào)節(jié)生物過程[11]。Hossini等[12]報(bào)道了PI3K/Akt途徑異常能夠誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的凋亡。Koh等[13]研究了PI3K/Akt通路參與了細(xì)胞的增殖、分化和遷移，細(xì)胞內(nèi)營(yíng)養(yǎng)因子可以激活PI3K途徑，進(jìn)而促進(jìn)了Akt1的磷酸化，導(dǎo)致細(xì)胞增殖。因此，PI3K-Akt信號(hào)分子在細(xì)胞凋亡與增殖等多種生物過程中發(fā)揮了至關(guān)重要的作用。

支持細(xì)胞(sertolicells，SCs)在家畜睪丸曲細(xì)精管中具有營(yíng)養(yǎng)、支持、分泌、吞噬等多種功能，是血-睪屏障的重要組成部分之一[14-16]。支持細(xì)胞能夠分泌多種因子保證精子發(fā)生正常進(jìn)行[17]，其異常發(fā)育或受損后將會(huì)對(duì)精子發(fā)生產(chǎn)生較為嚴(yán)重的影響[6]。目前為止，國(guó)內(nèi)外有關(guān)ZEA暴露引起馬屬動(dòng)物繁殖障礙的研究通常是從毒素暴露后影響動(dòng)物的攝食或流產(chǎn)等現(xiàn)象去解釋，而毒素直接作用的靶器官如睪丸，卵巢或子宮等蛋白、基因表達(dá)差異卻鮮有報(bào)道，且ZEA等霉菌毒素的毒性作用機(jī)制尚不完全清楚[18-21]。本研究通過采用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(RNA-seq)方法分析評(píng)估了10 μmol·L-1和30 μmol·L-1ZEA在體外培養(yǎng)的驢睪丸支持細(xì)胞毒性作用，探討ZEA通過PI3K-Akt信號(hào)通路誘導(dǎo)驢支持細(xì)胞炎癥與細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制，試驗(yàn)結(jié)果將為研究霉菌毒素?fù)p害驢睪丸發(fā)育的機(jī)制和制定馬屬動(dòng)物飼草料中ZEA等霉菌毒素的限量標(biāo)準(zhǔn)提供一定的理論借鑒。

1 材料與方法

1.1 主要藥品與試劑

赤霉烯酮(Z2125)、牛血清蛋白(BSA)、AnnexinV-FITC/7-AAD凋亡檢測(cè)試劑盒(APOAC)均購(gòu)自Sigma-Aldrich?公司(美國(guó))；青-鏈霉素(雙抗)混合液(PS,P1400)、DMSO(D8371)、非必需氨基酸(NEAA,N1250)、丙酮酸鈉(SP,SP0100)、膠原酶Ⅳ(C8160)、透明質(zhì)酸酶(H8030)、DNA酶Ⅰ(D8071)均購(gòu)自Solarbio?公司(北京)；FBS(ST30-3302)購(gòu)自PAN?公司(巴伐利亞)；胰酶(SH30042.01)、DMEM/HIGHGLUCOSE(SH300 22.01)購(gòu)自Hyclone?公司(北京)；TUNEL(A113)凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司；InvitrogenTRIzol(15596026)購(gòu)自Thermo Fisher Scientific?公司(美國(guó))。細(xì)胞免疫熒光抗體信息見表1。

表1 抗體信息表Table 1 The information of the antibodies

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 驢睪丸收集與睪丸支持細(xì)胞培養(yǎng)處理

取新鮮屠宰的驢(Equusasinus)睪丸，迅速放置于37 ℃含體積分?jǐn)?shù)5%青-鏈霉素生理鹽水的保溫杯中，1 h以內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。使用含體積分?jǐn)?shù)1%青-鏈霉素的磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffer saline,PBS) 清洗驢睪丸，去除多余脂肪與結(jié)締組織。清洗后的組織放入無(wú)水乙醇中浸泡10～20 s，使用PBS沖洗3遍，睪丸樣品置于無(wú)菌操作臺(tái)上，除去白膜，將剩余睪丸實(shí)質(zhì)剪碎至2～3 mm3小塊，去除可見血管和結(jié)締組織，用含雙抗的PBS沖洗后移入50 mL離心管中，加入2～3倍體積膠原酶IV(約2 mL)與0.2 mL·L-1透明質(zhì)酸酶(約2 mL)消化液，用1 mL移液器輕輕吹打混勻，37 ℃消化10～15 min，每隔3～5 min觀察曲細(xì)精管分散狀況；之后將睪丸組織與消化液轉(zhuǎn)移至50 mL離心管，加入相同體積不含F(xiàn)BS的DMEM培養(yǎng)基，1 200 r·min-1離心5 min，棄上清；分別加入2 mL 37 ℃ 預(yù)熱的0.25 mL·L-1胰酶與10 μg·mL-1DNA酶 I的消化液，37 ℃培養(yǎng)箱消化5～8 min，其間每隔1 min 200 r·min-1震蕩一次；加入等體積含體積分?jǐn)?shù)1% FBS的DMEM培養(yǎng)基終止消化；過200目和300目高壓滅菌的細(xì)胞篩過濾得細(xì)胞懸液；細(xì)胞懸液1 200 r·min-1離心5 min，加入10 mL含1% FBS的DMEM培養(yǎng)基在體積分?jǐn)?shù)5 % CO2、37 ℃的條件下培養(yǎng)6～8 h，然后更換全液。試驗(yàn)中采用10 μmol·L-1和30 μmol·L-1ZEA連續(xù)72 h體外培養(yǎng)并處理支持細(xì)胞。

1.2.2 驢睪丸支持細(xì)胞純度鑒定

本研究通過對(duì)支持細(xì)胞特異表達(dá)的SOX 9蛋白，進(jìn)行細(xì)胞免疫熒光染色的方法鑒定支持細(xì)胞的分離純度[22]。采用Image J軟件進(jìn)行計(jì)數(shù)和統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.3 TUNEL檢測(cè)

收集ZEA處理后的支持細(xì)胞，使用4 mL·L-1多聚甲醛溶液常溫下固定30～40 min，取細(xì)胞懸液于多聚賴氨酸處理的載玻片上，涂抹均勻后于42 ℃熱臺(tái)上烘烤2 h左右。PBS洗2～3次，每次5 min。使用1 mL·L-1Triton X-100透化10 min。PBS洗3次，每次5 min，置于濕盒中保持濕潤(rùn)。按照試劑盒說明書對(duì)樣品進(jìn)行TUNEL標(biāo)記，之后使用Hoechst 33342染細(xì)胞核，最后每個(gè)樣品滴加100 μL抗熒光淬滅封片劑，蓋上蓋玻片，4 ℃干燥避光保存。波長(zhǎng)620 nm熒光觀察BrightRed紅色熒光，波長(zhǎng)460 nm熒光觀察Hoechst 33342藍(lán)色熒光。

1.2.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡

收集ZEA處理后的支持細(xì)胞，加入4 ℃的PBS后混勻，300 r·min-1離心5 min后棄上清，1×Binding Buffer重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液密度為1 × 106個(gè)·mL-1。設(shè)置陰性對(duì)照組、單染對(duì)照組、對(duì)照組和試驗(yàn)處理組。每組取100 μL細(xì)胞懸液，加入5 μL的7-AAD和Annexin V-FITC，輕輕吹打混勻，25 ℃避光孵育15 min。最終加入400 μL 1×Binding Buffer終止反應(yīng)，上機(jī)檢測(cè)。

1.2.5 RNA提取和轉(zhuǎn)錄組分析

每個(gè)樣本使用1 mL Invitrogen TRIzol裂解收集大約1×107個(gè)細(xì)胞，7 500 r·min-14 ℃離心5 min。上下顛倒混勻后室溫放置10 min。12 000 r·min-14 ℃離心10 min，棄上清。加1 mL體積分?jǐn)?shù)75 % DEPC水配置酒精。短暫渦旋后7 500 r·min-14 ℃離心5 min，棄上清，風(fēng)干10 min。加30 μL DEPC水溶解RNA。RNA測(cè)序由Novogene使用Hiseq 4000平臺(tái)進(jìn)行，每組至少3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.2.6 差異表達(dá)基因的數(shù)據(jù)預(yù)處理和鑒定

測(cè)序數(shù)據(jù)分為對(duì)照組(CTRL)、10 μmol·L-1處理組(低濃度處理組)、30 μmol·L-1處理組(高濃度處理組)，使用NovoMagic平臺(tái)對(duì)支持細(xì)胞進(jìn)行分析、富集并篩選差異表達(dá)基因(differential expression genes，DEGs)。使用DEseq2軟件檢測(cè)差異表達(dá)基因，設(shè)置參數(shù)為| log 2 FoldChange|>1，P<0.05。使用NovoMagic平臺(tái)對(duì)DEGs進(jìn)行差異表達(dá)分析和功能富集分析。

1.2.7 細(xì)胞免疫熒光染色

收集驢支持細(xì)胞，體積分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛溶液固定1 h。吹打混勻細(xì)胞懸液滴加在多聚賴氨酸處理過的載玻片上，于42 ℃熱臺(tái)上烤1.5 h。PBS洗3次，每次4 min。PBST溶液透明10 min，PBS洗1遍。在細(xì)胞區(qū)域滴加等體積封閉液，室溫封閉1 h。細(xì)胞樣品區(qū)域加50 μL一抗(使用封閉液稀釋)，濕盒內(nèi)4 ℃過夜孵育。隨后將樣品置于室溫30 min進(jìn)行復(fù)溫。用含體積分?jǐn)?shù)1% BSA的PBS洗3次，每次3 min。滴加100 μL二抗，37 ℃避光孵育1 h。PBS洗3次，每次5 min。使用10 μg·mL-1Hoechst 33342染核2 min，PBS洗1遍。滴加抗熒光衰減封片劑，蓋蓋玻片，4 ℃干盒中避光保存。使用Image J軟件進(jìn)行陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)。熒光二抗為：山羊抗兔AlexaFluor594-IgG和山羊抗兔AlexaFluor488-IgG。以上試驗(yàn)3次重復(fù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

本研究使用GraphPad Prism 9軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，對(duì)照組和處理組之間的差異分析使用雙尾t檢驗(yàn)的方法，若P<0.05時(shí)，認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，用*表示，若P<0.01時(shí)，認(rèn)為有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，用**表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 體外分離培養(yǎng)驢支持細(xì)胞純度檢測(cè)結(jié)果

為檢測(cè)分離培養(yǎng)驢支持細(xì)胞的純度，本鑒定方法為利用細(xì)胞免疫熒光染色測(cè)定支持細(xì)胞特異蛋白SOX 9的表達(dá)[22-23]。統(tǒng)計(jì)SOX 9陽(yáng)性數(shù)與細(xì)胞核染色 Hoechst 33342數(shù)量的比率(圖1B)，最終計(jì)算驢支持細(xì)胞占培養(yǎng)細(xì)胞總數(shù)的比例。結(jié)果顯示，SOX 9蛋白在分離培養(yǎng)的驢睪丸支持細(xì)胞內(nèi)均呈現(xiàn)正常定位 (圖1A)，陰性對(duì)照 (驢成纖維細(xì)胞) 觀察到熒光信號(hào) (圖1A)。結(jié)果顯示了支持細(xì)胞的分離純度。

2.2 ZEA處理導(dǎo)致驢支持細(xì)胞的凋亡增加

體外培養(yǎng)的驢支持細(xì)胞使用10 μmol·L-1和30 μmol·L-1濃度ZEA連續(xù)處理72 h (圖1C)。TUNEL檢測(cè)結(jié)果顯示:ZEA暴露可能導(dǎo)致驢支持細(xì)胞顯著凋亡 (圖2A、2B)。TUNEL陽(yáng)性率為：對(duì)照組為5.17%±0.72%；10 μmol·L-1ZEA處理組為14.77%±0.91%；30 μmol·L-1ZEA處理組為23.59%±1.15%，結(jié)果與ZEA處理濃度的升高呈正相關(guān)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示：ZEA連續(xù)處理72 h后，10 μmol·L-1ZEA處理組凋亡率可達(dá)8.06%±0.06%，30 μmol·L-1處理組凋亡率達(dá)到14.22%±0.09% (圖2C)。以上結(jié)果表明ZEA可能誘導(dǎo)驢支持細(xì)胞凋亡。

A.TUNEL (紅)和Hocehst 33342 (藍(lán))染色檢測(cè)結(jié)果，標(biāo)尺：50 μm；B.TUNEL陽(yáng)性率統(tǒng)計(jì)圖；C.流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果。圖2 10 μmol·L-1和30 μmol·L-1 ZEA誘導(dǎo)驢支持細(xì)胞72 h TUNEL、流式凋亡檢測(cè)結(jié)果Fig.2 The results of TUNEL and flow cytometry apoptosis detection of E. asinus sertoli cells treated by 10 μmol·L-1 and 30 μmol·L-1 ZEA for 72 h

2.3 ZEA暴露改變了驢支持細(xì)胞基因表達(dá)模式

RNA-seq結(jié)果(圖3A)顯示：與對(duì)照組相比較，在10 μmol·L-1處理組檢測(cè)到803個(gè)差異表達(dá)基因，其中上調(diào)差異表達(dá)基因共391個(gè)，下調(diào)差異表達(dá)基因共412個(gè)；30 μmol·L-1處理組檢測(cè)到5 947個(gè)差異表達(dá)基因，其中上調(diào)差異表達(dá)基因共2 816個(gè)，下調(diào)差異表達(dá)基因共3 131個(gè)。與10 μmol·L-1ZEA處理組相比較，在30 μmol·L-1ZEA處理組中共檢測(cè)到5 218個(gè)差異表達(dá)基因，其中上調(diào)差異表達(dá)基因共2 407個(gè)，下調(diào)差異表達(dá)基因共2 811個(gè)(圖3B)。VENN分析結(jié)果顯示30 μmol·L-1ZEA處理組差異基因與10 μmol·L-1ZEA處理組差異基因存在顯著差異(圖3C)。因此，30 μmol·L-1ZEA處理組與10 μmol·L-1ZEA處理組支持細(xì)胞基因表達(dá)模式差異顯著。

A.ZEA 處理驢支持細(xì)胞差異表達(dá)基因火山圖；B.柱狀圖表示差異表達(dá)基因數(shù)目，紅色表示上調(diào)，綠色表示下調(diào)；C.VENN圖顯示對(duì)照組與ZEA處理組之間的差異基因個(gè)數(shù)。圖3 ZEA處理影響驢支持細(xì)胞基因表達(dá)模式Fig.3 The effect of ZEA treatment on gene expression of E. asinus sertoli cells

2.4 差異表達(dá)基因功能富集分析

為分析ZEA不同處理組差異表達(dá)基因的功能，分別將10 μmol·L-1ZEA 與30 μmol·L-1ZEA處理組中的差異表達(dá)基因進(jìn)行Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)信號(hào)通路富集分析，設(shè)置P<0.05的標(biāo)準(zhǔn)篩選差異表達(dá)基因顯著性高的信號(hào)通路(圖4)。結(jié)果顯示：10 μmol·L-1ZEA 處理影響的生物進(jìn)程有cell cycle(細(xì)胞周期)、p53信號(hào)通路等 (圖4A)，30 μmol·L-1ZEA處理影響的生物進(jìn)程有PI3K-Akt信號(hào)通路、MAPK(絲裂原活化蛋白激酶)信號(hào)通路、Ras信號(hào)通路、Apoptosis(程序性細(xì)胞死亡)以及TNF(腫瘤壞死因子)信號(hào)通路等 (圖4B)。下調(diào)的信號(hào)通路包括PI3K-Akt信號(hào)通路 (P=0.001 458 6，計(jì)數(shù)：22)、類固醇合成途徑 (P=0.007 337 7，計(jì)數(shù)：10)、細(xì)胞周期 (P=0.006 938 9，計(jì)數(shù)：21)等信號(hào)通路。

A.10 μmol·L-1 ZEA處理組DEGs KEGG信號(hào)通路富集分析氣泡圖；B.30 μmol·L-1 ZEA處理組DEGs KEGG信號(hào)通路富集分析氣泡圖。圖4 對(duì) 10 μmol·L-1 ZEA 與 30 μmol·L-1 ZEA處理組驢支持細(xì)胞差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG信號(hào)通路富集分析結(jié)果Fig.4 The results of KEGG signal pathway enrichment analysis on the differential genes expression of E. asinus sertoli cells in 10 μmol·L-1 and 30 μmol·L-1 ZEA treatment group

2.5 ZEA誘導(dǎo)驢支持細(xì)胞炎癥反應(yīng)并影響類固醇激素受體基因表達(dá)

對(duì)差異基因數(shù)據(jù)進(jìn)一步分析，結(jié)果顯示：白介素-10受體因子A (IL 10 RA) 在ZEA處理組中表達(dá)量與對(duì)照組相比顯著升高；差異基因雌激素受體1 (ESR1) ZEA處理組中表達(dá)量與對(duì)照組相比顯著升高。為了驗(yàn)證該分析結(jié)果，我們使用細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)ZEA處理后的驢支持細(xì)胞中炎癥反應(yīng)與類固醇激素受體相關(guān)差異基因蛋白表達(dá)量的變化。結(jié)果表明，ZEA處理組顯著提高了支持細(xì)胞白介素-10受體因子A (IL 10 RA) 蛋白的相對(duì)表達(dá)水平(圖5)。細(xì)胞免疫熒光結(jié)果顯示，支持細(xì)胞中ESR 1蛋白表達(dá)趨勢(shì)與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)相一致 (圖6)。

A.10 μmol·L-1 和30 μmol·L-1 ZEA處理組細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)IL 10 RA的表達(dá) (綠色)；B.IL 10 RA蛋白陽(yáng)性表達(dá)統(tǒng)計(jì)。圖5 細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)ZEA影響驢支持細(xì)胞IL 10 RA蛋白的表達(dá)Fig.5 The effect of ZEA on IL 10 RA protein expression of E. asinus sertoli cells by ICC

A.10 μmol·L-1 和30 μmol·L-1 ZEA處理組細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)ESR 1的表達(dá) (綠色)；B.ESR 1蛋白陽(yáng)性表達(dá)統(tǒng)計(jì)。圖6 細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)ZEA影響驢支持細(xì)胞ESR 1蛋白的表達(dá)Fig.6 The effect of ZEA on ESR 1 protein expression of E. asinus sertoli cells by ICC

3 討論

我國(guó)是全球唯一具備驢養(yǎng)殖、屠宰、加工及銷售等全產(chǎn)業(yè)鏈國(guó)家[24]。近年來(lái)，驢的功能與作用由役用逐步向肉用、藥用保健等多用途的“活體經(jīng)濟(jì)”方向轉(zhuǎn)型，且驢的飼養(yǎng)逐步向集約化養(yǎng)殖方向轉(zhuǎn)變。飼料中的霉菌毒素特別是ZEA污染已嚴(yán)重影響規(guī)模化飼養(yǎng)中驢的繁殖性能。本研究使用10 μmol·L-1和30 μmol·L-1濃度的ZEA連續(xù)72 h暴露體外培養(yǎng)的驢支持細(xì)胞，利用RNA-seq的手段分析并探討ZEA損害驢支持細(xì)胞發(fā)育并導(dǎo)致其凋亡的機(jī)制，采用TUNEL檢測(cè)、細(xì)胞免疫熒光與流式細(xì)胞檢測(cè)的方式驗(yàn)證了ZEA誘導(dǎo)驢支持細(xì)胞炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制。

流式細(xì)胞檢測(cè)和TUNEL標(biāo)記結(jié)果顯示30 μmol·L-1濃度的ZEA處理顯著高于10 μmol·L-1驢支持細(xì)胞凋亡率，該結(jié)果與廖美芳[25]利用ZEA處理IPEC-J2細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡結(jié)果一致，也與利用ZEA誘導(dǎo)豬巨噬細(xì)胞凋亡的結(jié)果一致[26]。以上結(jié)果說明ZEA支持細(xì)胞發(fā)揮毒性作用具有呈劑量依賴性的特點(diǎn)。PI3K-Akt信號(hào)通路參與了多種生理過程，如細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、運(yùn)動(dòng)和代謝等[27]，還可能與多種類型細(xì)胞的炎癥反應(yīng)與癌變息息相關(guān)[28]。本研究結(jié)果顯示：ZEA處理支持細(xì)胞通過PI3K-Akt信號(hào)通路影響了與細(xì)胞周期相關(guān)的基因表達(dá)：CDK1和CCNB1基因的mRNA表達(dá)量均顯著提高[29]；KEGG富集分析結(jié)果顯示，30 μmol·L-1的ZEA處理組DEGs多富集在Hippo信號(hào)通路，該結(jié)果與Zhang等[30]報(bào)道結(jié)果相符。另有研究表明，ZEA暴露可影響糖酵解過程，進(jìn)而干擾大鼠支持細(xì)胞內(nèi)乳酸合成，并可能影響雄性大鼠的繁殖機(jī)能。本試驗(yàn)結(jié)果表明，ZEA處理后支持細(xì)胞內(nèi)PGK1和PFKM基因mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著提高，這表明ZEA暴露可能導(dǎo)致驢支持細(xì)胞內(nèi)糖酵解進(jìn)程加快，支持細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)與能量代謝發(fā)生異常，進(jìn)而可能促進(jìn)細(xì)胞的炎癥反應(yīng)的發(fā)生或腫瘤的形成。

腫瘤的形成與發(fā)展和細(xì)胞周期異常密切相關(guān)[31-32]。ZEA處理后支持細(xì)胞KEGG分析結(jié)果顯示其細(xì)胞周期通路相關(guān)基因的表達(dá)顯著異常 (圖4)。這一結(jié)果說明ZEA可能通過影響細(xì)胞周期通路內(nèi)相關(guān)基因的表達(dá)，導(dǎo)致驢支持細(xì)胞基因表達(dá)模式改變，最終可能增加家畜睪丸癌變的風(fēng)險(xiǎn)。有報(bào)道表明[33]，LIN28A基因是睪丸內(nèi)腫瘤發(fā)生的標(biāo)記基因。另外，GADD45B基因在多種腫瘤中均被檢測(cè)到過表達(dá)，該基因參與調(diào)控細(xì)胞生存，DNA損傷修復(fù)、細(xì)胞周期停滯，并與腫瘤轉(zhuǎn)移現(xiàn)象密切相關(guān)[34]。結(jié)果顯示，ZEA處理后，支持細(xì)胞LIN28A、GADD45B基因的mRNA表達(dá)量均顯著升高，這說明ZEA具有導(dǎo)致支持細(xì)胞發(fā)生癌變風(fēng)險(xiǎn)的可能。KEGG分析結(jié)果得知，ZEA可引起IL17信號(hào)通路、T細(xì)胞受體信號(hào)通路等炎癥相關(guān)信號(hào)通路上調(diào)。此外，KEGG結(jié)果顯示ZEA顯著下調(diào)細(xì)胞代謝及DNA復(fù)制相關(guān)信號(hào)通路 (圖4)，諸如半胱氨酸和蛋氨酸代謝、谷胱甘肽代謝、DNA復(fù)制、同源重組等。這些結(jié)果表明ZEA可能引起驢睪丸支持細(xì)胞的炎癥反應(yīng) (圖5)，并干擾細(xì)胞正常代謝和DNA復(fù)制，但其機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

支持細(xì)胞能夠合成并分泌多種激素[35]。磷酸戊糖途徑在支持細(xì)胞中較為活躍，該途徑可提供膽固醇、類固醇激素等合成所需的能量因子如NADPH+H+[36]。G6PD是該途徑氧化反應(yīng)階段的限速酶，能催化葡萄糖-6-磷酸形成6-磷酸葡萄糖酸-δ-內(nèi)脂，進(jìn)一步使NADP+還原形成NADPH+H+[37]。另外，關(guān)鍵酶DHCR24可進(jìn)一步催化合成膽固醇[38]。KEGG結(jié)果表明，ZEA顯著影響了磷酸戊糖途徑和類固醇生物合成途徑相關(guān)基因的表達(dá)。由此可知，ZEA可能通過PI3K-Akt信號(hào)通路抑制磷酸戊糖途徑，降低NADPH+H+的合成進(jìn)而影響驢支持細(xì)胞類固醇激素的合成，且ZEA處理后支持細(xì)胞ESR1基因的蛋白表達(dá)顯著升高 (圖6)。因此，ZEA可能通過干擾類固醇或受體合成途徑影響睪丸的發(fā)育及家畜的繁殖性能。

總之，本研究首次利用RNA-seq手段分析探究了ZEA暴露改變驢支持細(xì)胞基因表達(dá)模式的毒性作用，該毒性作用具有呈劑量依賴性的特點(diǎn)。此外，ZEA暴露導(dǎo)致支持細(xì)胞凋亡增加，類固醇激素受體表達(dá)異常。且ZEA暴露可能通過影響支持細(xì)胞中凋亡和類固醇激素受體合成等過程關(guān)鍵基因的表達(dá)，直接或間接影響了睪丸發(fā)育和激素受體合成等生物學(xué)過程。30 μmol·L-1ZEA暴露能夠誘導(dǎo)驢支持細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，進(jìn)而可能損害驢睪丸發(fā)育和誘導(dǎo)睪丸病變的潛在危害；另外，相同劑量ZEA暴露下，支持細(xì)胞存在被致癌的可能性。本研究將為國(guó)家或地方制定馬屬動(dòng)物飼草料中ZEA含量標(biāo)準(zhǔn)提供理論借鑒，并對(duì)研究ZEA等霉菌毒素影響家畜睪丸發(fā)育提供新的研究思路。