孫子豪，郝柏慧，王成龍，王彩霞

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)植物醫(yī)學(xué)學(xué)院/青島市果蔬病蟲(chóng)害精準(zhǔn)防控工程研究中心/山東省植物病蟲(chóng)害綜合防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東青島 266109;2.青島鑫潤(rùn)生物科技有限公司,山東青島 266717)

黃瓜(Cucumissativus)是我國(guó)重要的葫蘆科作物，目前我國(guó)已成為世界上黃瓜生產(chǎn)面積最大、總產(chǎn)量最高的國(guó)家[1]。黃瓜種子萌發(fā)過(guò)程中存在易霉變,難萌發(fā)，發(fā)芽率低，多弱苗等問(wèn)題，嚴(yán)重影響黃瓜的產(chǎn)量和品質(zhì)。育苗技術(shù)中培育壯苗的關(guān)鍵是種子播前預(yù)處理，目前主要通過(guò)物理方法、化學(xué)試劑和植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑浸種等方式對(duì)種子進(jìn)行播前處理，以提高種子發(fā)芽率，促進(jìn)種子提前萌發(fā)和胚根生長(zhǎng)[2-4]。

2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(2,6-di-tert-butyl-4-methylphenol,BHT)是一種優(yōu)良的非污染性抗氧化劑，具有淬滅單線(xiàn)態(tài)氧、清除自由基的功能，在食品加工、石油化工、塑料包裝材料等產(chǎn)業(yè)中被廣泛應(yīng)用[5]。在農(nóng)業(yè)上，關(guān)于BHT的研究多集中在其抑菌作用和誘導(dǎo)植物抗病性方面。馬林等[6]研究發(fā)現(xiàn)BHT是內(nèi)生放線(xiàn)菌婁徹氏鏈霉菌(Streptomycesrochei)的主要代謝產(chǎn)物之一，關(guān)曄晴等[7]報(bào)道BHT對(duì)多種植物病原真菌如梨黑斑病菌(Alternariaalternata)、灰葡萄孢(Botrytiscinerea)等具有顯著抑制作用。最近研究發(fā)現(xiàn)BHT能夠誘導(dǎo)提高植物抗病性，通過(guò)提高蘋(píng)果果實(shí)內(nèi)防御相關(guān)酶活性和抗氧化能力等，增加對(duì)蘋(píng)果輪紋病、灰霉病等的抗性[8-10]。目前，對(duì)于BHT的促生作用及機(jī)制等研究尚未見(jiàn)報(bào)道。

種子貯藏、萌發(fā)階段往往伴隨著活性氧的產(chǎn)生和積累，其大量積累會(huì)對(duì)種子的萌發(fā)及生長(zhǎng)發(fā)育造成損傷，而抗氧化酶是植物體內(nèi)活性氧清除過(guò)程中的重要參與者。本研究以黃瓜種子為試材，用不同濃度BHT溶液處理種子進(jìn)行發(fā)芽試驗(yàn)，旨在明確BHT對(duì)種子萌發(fā)的促生作用，并篩選出最適濃度；同時(shí)，通過(guò)測(cè)定種子萌發(fā)過(guò)程中抗氧化酶活性和總抗氧化能力(total antioxidant capacity,T-AOC)的時(shí)序變化，分析BHT對(duì)黃瓜種子萌發(fā)過(guò)程中的促生機(jī)制，以期為BHT在植物育苗生產(chǎn)中的開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于2020年10月至2021年7月在青島農(nóng)業(yè)大學(xué)果樹(shù)病害流行與綜合防控實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。供試黃瓜品種為‘中農(nóng)116號(hào)’，購(gòu)自中蔬種業(yè)科技(北京)有限公司；BHT購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、過(guò)氧化物酶(peroxidase,POD)和過(guò)氧化氫酶(catalase,CAT)活性及總抗氧化能力測(cè)定試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 BHT溶液制備

將BHT用甲醇溶解配制成1.0 mol·L-1的母液后，以無(wú)菌水稀釋為0、0.1、0.2、0.5、1.0和2.0 mmol·L-1BHT溶液備用。

1.2.2 黃瓜種子消毒和催芽培養(yǎng)

挑選大小及飽滿(mǎn)程度一致、種皮完整的黃瓜種子，用75%酒精浸泡30 s進(jìn)行表面消毒，用無(wú)菌水沖洗干凈后用吸水紙吸干種子表面水分。將表面消毒的黃瓜種子用1.2.1配制的不同濃度的BHT溶液共6個(gè)處理浸種8 h，其中無(wú)菌水(0 mmol·L-1BHT)為對(duì)照，每個(gè)處理30粒種子，3次重復(fù)。將浸種處理后的種子，用無(wú)菌水沖洗表面殘留藥劑，并用吸水紙吸干種子表面水分后置于鋪有無(wú)菌吸水紙的培養(yǎng)皿中，于25 ℃培養(yǎng)箱中保濕暗培養(yǎng)。

1.2.3 種子萌發(fā)和胚根生長(zhǎng)指標(biāo)的測(cè)定

以胚根長(zhǎng)度達(dá)到種子全長(zhǎng)的一半為發(fā)芽。每天統(tǒng)計(jì)發(fā)芽數(shù)、測(cè)量種子胚根長(zhǎng)度，第2天計(jì)算發(fā)芽勢(shì)，第3天計(jì)算發(fā)芽率，第5天計(jì)算發(fā)芽指數(shù)，第7天用吸水紙吸干黃瓜幼苗表面水分，稱(chēng)量其鮮質(zhì)量(30株幼苗)。并用烘干法[11]測(cè)量其干質(zhì)量(30株幼苗)：在105 ℃下殺青30 min，75 ℃烘干至恒重后稱(chēng)其干質(zhì)量。

發(fā)芽指標(biāo)用以下公式計(jì)算：

發(fā)芽率(%)=N2/N1×100 (N1表示供試種子數(shù)，N2表示發(fā)芽種子數(shù))；

發(fā)芽勢(shì)(%)=N3/N1×100 (N3表示48 h發(fā)芽種子數(shù))；

發(fā)芽指數(shù)(GI)=∑Gt/Dt(Gt表示浸種后t日的發(fā)芽數(shù)，Dt表示相應(yīng)的發(fā)芽日數(shù))

1.2.4 黃瓜種子抗氧化酶活性和總抗氧化能力測(cè)定

以上述試驗(yàn)篩選出的最適濃度BHT溶液浸種處理黃瓜種子8 h，以無(wú)菌水浸種處理做對(duì)照。浸種完成后用無(wú)菌水沖洗黃瓜種子3遍，將其置于培養(yǎng)皿中保濕。于25 ℃恒溫培養(yǎng)后0、12、24、48、72、96、120 h取樣，每個(gè)處理10株，3次重復(fù)，樣品用液氮速凍后于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

將樣品用液氮研磨后，按1 g材料加入5 mL 0.1 mol·L-1的磷酸緩沖液(pH 7.4)比例混勻，于4 ℃，12 000 r·min-1離心10 min，所得上清液為粗酶提取液。分別以愈創(chuàng)木酚法、鉬酸銨法和羥胺法測(cè)定POD、CAT和SOD的活性，T-AOC采用比色法測(cè)定,具體步驟參考南京建成生物工程研究所試劑盒說(shuō)明書(shū)。酶活性和總抗氧化能力以每克植物組織鮮質(zhì)量的酶單位數(shù)表示(U·g-1)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 21.0和Excel 2010軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析、顯著檢驗(yàn)并作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度BHT對(duì)黃瓜種子萌發(fā)的影響

由表1可見(jiàn)，相比對(duì)照，各濃度BHT浸種處理對(duì)黃瓜種子萌發(fā)均有不同程度的促進(jìn)作用。不同濃度BHT均可提高黃瓜種子發(fā)芽勢(shì)，但各濃度間無(wú)顯著差異，相比對(duì)照發(fā)芽勢(shì)提高20.00%～30.91%。0.1～2.0 mmol·L-1的BHT均可提高黃瓜種子發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)，其中BHT濃度為1.0 mmol·L-1時(shí)促進(jìn)效果最顯著，相比對(duì)照，發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)分別提高19.45%和13.66%。

表1 不同濃度BHT溶液處理后黃瓜種子萌發(fā)指標(biāo)的變化Table 1 Changes of germination indexes of cucumber seeds treated with different concentrations of BHT solution

2.2 不同濃度BHT對(duì)黃瓜種子胚根和幼苗生長(zhǎng)的影響

由圖1和表2可知，BHT浸種處理對(duì)黃瓜種子的胚根生長(zhǎng)有明顯的促進(jìn)作用，各濃度處理均可提高黃瓜種子的胚根長(zhǎng)度，其中1.0 mmol·L-1BHT處理對(duì)胚根的促生效果最顯著，培養(yǎng)3 d時(shí)胚根長(zhǎng)度達(dá)3.70 cm，比對(duì)照提高36.03%(表2)。BHT處理可顯著提高黃瓜幼苗的鮮質(zhì)量，但不同濃度BHT對(duì)幼苗鮮質(zhì)量的影響無(wú)明顯差異；此外，各濃度BHT處理均可顯著增加黃瓜幼苗干質(zhì)量，其中1.0 mmol·L-1BHT的處理效果最顯著，濃度增加或降低，對(duì)幼苗干質(zhì)量的促進(jìn)作用均降低。因此，在后續(xù)研究中選擇1.0 mmol·L-1BHT進(jìn)行黃瓜種子抗氧化酶活性和總抗氧化能力指標(biāo)測(cè)定。

表2 不同濃度BHT溶液處理后黃瓜種子胚根長(zhǎng)和幼苗重量的變化Table 2 Changes of radicle length and seedling weight of cucumber seeds treated with different concentrations of BHT solution

圖1 不同濃度BHT溶液對(duì)黃瓜種子胚根生長(zhǎng)的促進(jìn)效果Fig.1 Promoting effects of different concentrations of BHT solution on radicle growth of cucumber seeds

2.3 BHT處理對(duì)黃瓜種子抗氧化酶活性和總抗氧化能力的影響

黃瓜種子萌發(fā)期間，測(cè)定了1.0 mmol·L-1BHT處理對(duì)3種抗氧化酶活性和總抗氧化能力變化趨勢(shì)的影響(圖2)。隨處理后時(shí)間的增加，SOD活性呈現(xiàn)先升高后降低再升高的趨勢(shì)，各時(shí)間點(diǎn)處理和對(duì)照無(wú)顯著差異(圖2A)。由圖2B可知，黃瓜種子萌發(fā)過(guò)程中，POD活性升高后逐漸趨于穩(wěn)定，BHT處理后12 h，POD活性顯著高于對(duì)照，但其他時(shí)間點(diǎn)BHT處理酶活性與對(duì)照均無(wú)明顯差異。CAT活性整體呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，與對(duì)照相比，BHT處理黃瓜種子后24 h，其CAT活性開(kāi)始顯著升高，于處理后72 h到達(dá)峰值(492.92 U·g-1)，隨后于96 h活性急劇下降，但BHT處理CAT活性仍顯著高于對(duì)照(圖2C)。黃瓜種子處理后0～24 h，總抗氧化能力快速降低，且BHT處理和對(duì)照無(wú)明顯差異，隨后總抗氧化能力緩慢升高，處理后72 h、96 h和120 h，BHT處理總抗氧化能力顯著高于對(duì)照，分別提高58.43%、69.44%、75.79%(圖2D)。

圖2 1.0 mmol·L-1 BHT處理后不同時(shí)間黃瓜種子抗氧化酶活性和總抗氧化能力的變化Fig.2 Changes of antioxidant enzyme activities and total antioxidant capacity of cucumber seeds at different time after 1.0 mmol·L-1 BHT treatment注：*表示BHT處理和對(duì)照差異顯著(P<0.05)。

3 討論與結(jié)論

種子萌發(fā)是植物生長(zhǎng)發(fā)育的關(guān)鍵階段，對(duì)幼苗的形成起著決定性作用[12]，多種化合物都具有促進(jìn)種子萌發(fā)的功能[13-15]。本研究中BHT對(duì)黃瓜種子發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)、胚根長(zhǎng)度和幼苗干鮮質(zhì)量等各指標(biāo)的影響與其濃度密切相關(guān)，最適濃度為1.0 mmol·L-1，BHT濃度過(guò)高或者過(guò)低，促生作用均減弱。李艷等[16]研究發(fā)現(xiàn)銅綠假單胞菌M18的次生代謝產(chǎn)物申嗪霉素在適宜的濃度下對(duì)黃瓜種子發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)和胚根生長(zhǎng)等具有明顯促進(jìn)作用，但隨濃度升高促生作用呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，與本研究結(jié)果一致。

SOD、POD和CAT是植物主要的抗氧化酶，能夠清除植物體內(nèi)H2O2、超氧陰離子、羥基自由基，減少活性氧的積累，從而抵御活性氧對(duì)植物細(xì)胞的傷害[17-18]?？偪寡趸芰χ笜?biāo)能夠很好地體現(xiàn)植物體內(nèi)防御系統(tǒng)抗氧化能力的強(qiáng)弱程度[19]。楊若鵬等[20]研究發(fā)現(xiàn)水楊酸可以通過(guò)提高黃瓜種子的抗氧化酶活性來(lái)緩解干旱脅迫，促進(jìn)幼苗生長(zhǎng)；張秀瑋等[21]發(fā)現(xiàn)硝普鈉可以促進(jìn)小麥、蘿卜、黃瓜等作物種子的生長(zhǎng)，并能顯著提高其抗氧化酶活性，表明抗氧化酶活性升高有利于種子的胚根生長(zhǎng)。本研究發(fā)現(xiàn)在黃瓜種子萌發(fā)期間SOD活性呈現(xiàn)先升高后降低再升高的趨勢(shì)，相比0 h，處理后48～72 h酶活性顯著降低，但BHT處理與對(duì)照SOD活性沒(méi)有顯著差異，該結(jié)果與刺槐和胡楊種子萌發(fā)過(guò)程中SOD酶活性變化趨勢(shì)一致[22-23]。BHT處理可提高POD和CAT活性，尤其在處理后24～120 h，BHT處理CAT酶活性均顯著高于對(duì)照；同時(shí)，BHT處理的總抗氧化能力在處理后72～120 h也均顯著大于對(duì)照。表明BHT可能通過(guò)提高植物體內(nèi)的抗氧化酶活性和總抗氧化能力，清除種子萌發(fā)過(guò)程中產(chǎn)生的自由基和活性氧，維持其平衡，從而促進(jìn)黃瓜種子萌發(fā)和胚根生長(zhǎng)。

綜上所述，適宜濃度的BHT對(duì)黃瓜種子萌發(fā)具有顯著促生作用，推測(cè)其可能在浸種過(guò)程中通過(guò)協(xié)助抗氧化酶清除種子萌發(fā)過(guò)程中產(chǎn)生的活性氧、自由基來(lái)促進(jìn)種子萌發(fā)；并通過(guò)誘導(dǎo)提高胚根生長(zhǎng)時(shí)期的POD、CAT等酶活性和總抗氧化能力來(lái)促進(jìn)胚根生長(zhǎng)。此外，已有研究表明BHT還具有抑菌、誘導(dǎo)植物抗性、不污染環(huán)境等優(yōu)點(diǎn)[7-8]，可見(jiàn)BHT在植物育苗生產(chǎn)中的開(kāi)發(fā)應(yīng)用具有巨大潛力，但種子萌發(fā)是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，因此BHT對(duì)于植物促生作用的調(diào)控機(jī)制還需深入研究。