吳玉潔,姜 侃,張 威,于 雪,4,汶 瑛,4,劉光琇,陳 拓

(1.中國科學院西北生態(tài)環(huán)境資源研究院 冰凍圈科學國家重點實驗室，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅省極端環(huán)境微生物資源與工程重點實驗室，甘肅 蘭州 730000；3.中國科學院西北生態(tài)環(huán)境資源研究院 沙漠與沙漠化重點實驗室，甘肅 蘭州 730000；4.中國科學院大學,北京 100049；5.甘肅農(nóng)業(yè)大學 農(nóng)學院，甘肅 蘭州 730000)

天然產(chǎn)物(Natural products)作為如今非常重要的化合物家族，由于其普遍具有生物活性而被廣泛研究[1]，尤其是一些具有抗菌、抗腫瘤和抗病毒活性的化合物已經(jīng)廣泛應用于人類醫(yī)藥和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過程。其中有超過8萬種活性天然產(chǎn)物是由鏈霉菌產(chǎn)生的[2-4]。由鏈霉菌產(chǎn)生的抗生素主要有非核糖體肽(NRPs)、聚酮類(PKS)、NRPS-PKS雜合化合物、氨基糖苷類(aminoglycoside)、氨基香豆素(aminocoumarin)、酰基內(nèi)酯(acyl-lactone)、醌類化合物(quinone)、磷酸糖脂(phosphglydolipied)和核苷類化合物(nucleoside)。其中核苷類抗生素(nucleoside antibiotics)是由核苷或核酸衍生而來的一類抗生素，目前所發(fā)現(xiàn)的核苷類抗生素幾乎全部來源于微生物[5]。它們在結(jié)構(gòu)上具有相似性——核苷基團，而其他基團結(jié)構(gòu)則非常多樣，這就使得核苷類抗生素能夠參與多種細胞基礎(chǔ)代謝過程。因此核苷類抗生素具有非常廣泛的生物學活性。根據(jù)其生物學活性可分為抗細菌活性、抗真菌活性和抗病毒活性三大類[6]。由于核苷類抗生素廣譜的生物學活性、復雜多變的生物合成途徑及調(diào)控機制，使得核苷類抗生素的研究受到了廣泛關(guān)注，所以對于核苷類抗生素及其生物合成的研究是非常重要的。本研究所采用的柴達木沙漠鏈霉菌(Streptomycesqaidamensis)S10T是一株分離自柴達木盆地的鏈霉菌新種。甘肅省極端環(huán)境微生物資源與工程重點實驗室在前期研究中發(fā)現(xiàn)菌株S10T的發(fā)酵液粗提物對于抗甲氧西林的金黃色葡萄球菌(MRSA)具有抑菌活性[7]，并且對革蘭陽性、革蘭陰性菌和真菌具有廣譜的抗菌活性，因此開展菌株S10T產(chǎn)生的活性天然產(chǎn)物具有非常重要的研究價值。本研究利用大孔吸附樹脂從菌株S10T中提取活性天然產(chǎn)物，篩選了具有良好吸附及解吸性能的大孔吸附樹脂，對粗提物進行了初步分離，并鑒定了分離得到的化合物結(jié)構(gòu)。大孔吸附樹脂由于其網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)和較大的比表面積使得其兼具吸附性和分子排阻效應，通過選擇不同極性和不同孔徑的樹脂即可達到分離純化的目的，具有更強的分離特異性[8]。且大孔吸附樹脂具有吸附速度快，不受無機鹽和強離子等影響，因此廣泛應用于天然產(chǎn)物的分離[9]。通過對菌株S10T中活性天然產(chǎn)物分離方法的探究，為進一步開發(fā)該菌株產(chǎn)生的多種具有新穎結(jié)構(gòu)或活性的化合物，為利用大孔吸附樹脂從鏈霉菌中發(fā)掘活性天然產(chǎn)物提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗菌株 抑菌測定指示菌：金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)、蠟樣芽胞桿菌(Bacilluscereus)、蘇云金芽胞桿菌(Bacillusthuringiensis)、大腸埃希菌(Escherichiacoli)、乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)、藤黃微球菌(Micrococcusluteus)、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)，以上供試菌由甘肅省極端環(huán)境微生物資源與工程重點實驗室提供；實驗菌株柴達木沙漠鏈霉菌(Streptomycesqaidamensis) S10T，由甘肅省極端環(huán)境微生物資源與工程重點實驗室分離得到。

1.1.2 培養(yǎng)基 ①LB培養(yǎng)基；②MS培養(yǎng)基：黃豆粉 20 g，加入自來水800 mL，煮沸2 h后過濾得濾液，加入甘露醇 20 g，瓊脂 20 g，加自來水至1 000 mL；③ISP-2培養(yǎng)基；④高氏一號培養(yǎng)基。

1.1.3 主要試劑與儀器設(shè)備 無水乙醇、甲醇等有機溶劑均為國產(chǎn)分析純；色譜級甲醇和乙腈均購自邁瑞達科技有限公司；氘代試劑購自美國劍橋同位素實驗室(CIL)；大孔吸附樹脂XAD-7HP、XAD-16、AB-8和HP-20，反向硅膠填料購自北京慧德易科技有限責任公司；卡那霉素、TTC(氯化三苯四氮唑)購自索萊寶生物科技有限公司；葡聚糖凝膠LH-20購自美國GE Healthcare。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(RV10，德國艾卡儀器設(shè)備有限公司)；Heal Force臺式高速冷凍離心機(23R，力康生物醫(yī)療科技控股有限公司)；高效液相色譜儀(EClassical 3100，大連依利特分析儀器有限公司)；超高分辨率質(zhì)譜儀(TSQ Alitis，賽默飛世爾科技有限公司)；400 MHz核磁共振波譜儀(AVANCE NEO，布魯克科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 靜態(tài)吸附試驗 ①活性物質(zhì)濃縮：菌株S10T使用高氏一號培養(yǎng)基經(jīng)過7 d發(fā)酵后所得的菌液離心除去菌絲體后所得上清即為發(fā)酵液，發(fā)酵液使用等體積乙酸乙酯萃取后重新溶解，濃縮至活性物質(zhì)濃度為10 mg/mL，該濃縮發(fā)酵液供后續(xù)實驗使用。②樹脂篩選實驗：在4個500 mL三角瓶中分別加入10 g預處理好的XAD-7HP、XAD-16、AB-8和HP-20樹脂[10]，加入100 mL濃縮發(fā)酵液，靜態(tài)吸附0.5 h后，取出吸附后剩余濃縮發(fā)酵液進行抗菌物質(zhì)濃度測定。③不同pH值對吸附能力的影響：分別稱取5 g處理好的AB-8濕樹脂5份于5個500 mL三角瓶中，量取100 mL濃縮發(fā)酵液，分別將pH調(diào)為1、3、6、9、12，吸附2 h后，取吸附后剩余濃縮發(fā)酵液進行活性物質(zhì)含量的測定，并計算吸附效率。④AB-8樹脂靜態(tài)飽和吸附量測定：分別稱取2 g處理好的AB-8濕樹脂于500 mL三角瓶中，再加入100 mL濃縮發(fā)酵液，分別吸附0.5、1、2、4、6、8、12、24 h，取出吸附后剩余濃縮發(fā)酵液測定其殘余活性物質(zhì)含量。⑤洗脫液濃度選擇：分別稱取5 g處理好的AB-8濕樹脂于12個500 mL三角瓶中，加入100 mL發(fā)酵液，吸附2 h后，濾紙過濾除去吸附后的剩余濃縮發(fā)酵液，分別測定其中抗菌活性物質(zhì)含量。過濾后濕樹脂分別用0、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%和100%(體積分數(shù))的甲醇洗脫，分別測定洗脫液中活性物質(zhì)含量。

1.2.2 活性天然產(chǎn)物分離及鑒定 ①天然產(chǎn)物分離：使用200目正向硅膠分離洗脫液，再分別使用石油醚與乙酸乙酯、氯仿與甲醇不同比例梯度洗脫，合并相同組分。打孔法[11]對分離得到的組分進行抑菌活性檢測，對于有抑菌活性的組分再以不同比例的甲醇與水為洗脫液反相硅膠進行分離。最后將進一步分離得到的活性物質(zhì)組分經(jīng)葡聚糖凝膠LH-20分離，分別使用100%、70%、30%的甲醇和純水作為洗脫劑，梯度洗脫，TLC分析后將相同的組分合并。②結(jié)構(gòu)鑒定：將分離提純的化合物用氘代DMSO溶解后，核磁共振儀測定其1H和13C同位素峰。甲醇溶解的化合物使用高分辨質(zhì)譜測定其質(zhì)核比及相對分子質(zhì)量。③色譜條件：色譜柱為ODS-18(4.6 mm×150 mm，5 μm)；流動相為V乙腈∶V1‰TFA水溶液=75∶25，等梯度洗脫；檢測波長為254 nm；流速0.8 mL/min；柱溫35 ℃；進樣量20 μL。

1.2.3 抑菌活性檢測方法 發(fā)酵液及化合物抑菌活性的檢測使用氯化三苯四氮唑(TTC)顯色法[12]。精確稱取TTC 1 g，用100 mL蒸餾水溶解，配制成1%(質(zhì)量分數(shù))溶液，0.22 μm的無菌濾器過濾除菌后避光保存?zhèn)溆谩z測抑菌活性時再將1% TTC溶液使用培養(yǎng)基稀釋100倍加入96孔板中，同時加入樣品和供試菌液(TTC、樣品和供試菌液的量可根據(jù)不同菌株進行調(diào)整，但總量保持在200 μL)。TTC作為細菌呼吸的氫受體加入培養(yǎng)基中，當細菌生長時，細菌在脫氫酶的作用下，無色的TTC生成不溶于水的紅色三苯甲腙。根據(jù)顏色變化能夠準確且直觀地判斷細菌是否生長。

1.2.4 計算方法 樹脂吸附量Q(mg/g)、吸附效率q(mg/(g·h))按下列公式計算：Q(mg/g)=(ρ0ν0-ρ1ν1)/m，q(mg/(g·h))=Q/Δt。式中：ρ0ν0為濃縮發(fā)酵液質(zhì)量濃度(mg/mL)和體積(mL)；ρ1ν1為吸附后剩余濃縮發(fā)酵液質(zhì)量濃度(mg/mL)和體積(mL)；m為處理好的濕樹脂質(zhì)量(g)；Δt為吸附時間(h)[13]。

2 結(jié)果與分析

2.1 靜態(tài)分析

2.1.1 樹脂篩選 樹脂篩選試驗中，當吸附時間相同(0.5 h)時，AB-8樹脂的吸附效率高于其他樹脂(圖1A)，對比四種大孔吸附樹脂的性能(表1)發(fā)現(xiàn)，這可能是由于AB-8樹脂相對XAD-16和HP20，屬于弱極性樹脂[14]，在吸附過程中不僅能夠吸附帶有極性基團的非極性化合物也能夠吸附極性化合物。而與極性相似的XAD-7HP相比，AB-8則具有更大的比表面積和更小的孔徑，使得在單位時間內(nèi)AB-8樹脂的吸附量更大，所以后續(xù)試驗選擇使用AB-8樹脂作為試驗樹脂。

表1 四種大孔吸附樹脂性能比較Table 1 General properties of four microporous resins

2.1.2 不同pH對AB-8樹脂吸附效率的影響 AB-8樹脂在不同pH條件下對菌株S10T濃縮發(fā)酵液的吸附效率影響試驗表明，濃縮發(fā)酵液的不同pH值對于樹脂吸附效率的影響并沒有明顯差異。但pH值為9時，吸附效率最高，說明AB-8適宜在弱堿性條件下對菌株S10T濃縮發(fā)酵液中的活性產(chǎn)物進行吸附。因此在后續(xù)化合物提取試驗中，需將發(fā)酵液的pH值調(diào)為9(圖1B)。

2.1.3 AB-8樹脂靜態(tài)飽和吸附量 AB-8樹脂飽和吸附量的測定結(jié)果見表2。測定結(jié)果表明，AB-8樹脂吸附菌株S10T濃縮發(fā)酵液4 h后，剩余濃縮發(fā)酵液中抗菌活性物質(zhì)的含量基本達到平衡狀態(tài)，表明4 h后大孔吸附樹脂的吸附能力已經(jīng)飽和，樹脂的吸附量為138 mg/g。AB-8對菌株S10T濃縮發(fā)酵液的靜態(tài)飽和吸附動力曲線及吸附效率曲線見圖1C。

表2 AB-8靜態(tài)飽和吸附試驗結(jié)果Table 2 Result of the AB-8 static saturation adsorption

2.1.4 最佳甲醇洗脫濃度試驗 設(shè)置0～100%11個梯度，使用30%～100%(體積分數(shù)，下同)的甲醇洗脫均有較好的洗脫效果(圖1D)，抗菌試驗結(jié)果表明0～10%的洗脫液不具有抑菌活性。在后續(xù)分離試驗中，可用10%的甲醇洗脫雜質(zhì)，70%的甲醇作為洗脫液濃縮抗菌活性物質(zhì)用于后期分離。

圖1 大孔吸附樹脂對發(fā)酵液靜態(tài)吸附結(jié)果Fig.1 Results of static adsorption of fermentation broth by macroporous adsorption resinA：大孔樹脂篩選結(jié)果；B：不同pH對AB-8樹脂吸附效率的影響；C：AB-8樹脂靜態(tài)飽和吸附動力學及吸附效率曲線；D：不同比例甲醇洗脫試驗結(jié)果A:Screening results of macroporous resin;B:The effect of different pH on the adsorption efficiency of AB-8;C:AB-8 resin static saturated adsorption kinetics curve;D:Different ratio of methanol elution results

2.2 活性化合物分離

2.2.1 活性化合物分離結(jié)果 初步使用200目正向硅膠，共分離得到了20個流份，分別為Fr.1～Fr.20。采用5種測活菌株金黃色萄葡球菌(Staphylococcusaureus)、蘇云金芽胞桿菌(Bacillusthuringiensis)、藤黃微球菌(Micrococcusluteus)、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)和大腸埃希菌(Escherichiacoli)檢測了Fr.1～Fr.20的抑菌活性，其中除Fr.8、Fr.12和Fr.19外，其他流份都具有抑菌活性(圖2)。使用反相硅膠和葡聚糖凝膠對Fr.13和Fr.14進行下一步分離得到一個純的化合物，該化合物為白色粉末狀固體，易溶于甲醇和DMSO等有機溶劑。HPLC檢測該化合物保留時間為2.86 min(圖3A)，具有較高的純度，峰面積占比為93.12%。

圖2 Fr.1～Fr.20抑菌活性檢測結(jié)果Fig.2 Fr.1-Fr.20 antibacterial activity test results圖中深灰色為無抑菌活性，淺灰色為有抑菌活性；MeOH為甲醇，作為陰性對照；KM為卡那霉素(質(zhì)量濃度10 mg/mL)作為陽性對照Dark gray indicates no antibacterial activity；and light gray indicates antibacterial activity；MeOH was methanol,used as a negative control；and KM was kanamycin used as positive control with concentration 10 mg/mL

2.2.2 活性化合物結(jié)構(gòu)鑒定 使用LC-HR-MS對該化合物的分子量進行了表征，該化合物質(zhì)核比為268.103 0(圖3B)，計算質(zhì)核比為268.104 6，其誤差值為5.97×10-6。結(jié)合1H-NMR和13C-NMR，得到了該化合物的結(jié)構(gòu)(圖3C)，根據(jù)文獻調(diào)研發(fā)現(xiàn)該化合物為阿糖腺苷(9-beta-D-Arabinofuranosyladenine,Ara-a,Vidarabine)，是第一個得到美國食品藥品管理局(FDA)認證的核苷類抗生素。1H-NMR和13C-NMR結(jié)果如下：1H-NMR (400 MHz,DMSO-d6) δ 8.35 (s,1H),8.14 (s,1H),7.42 (s,2H),5.83 (s,1H),5.40 (s,2H),5.19 (s,1H),4.59 (s,1H),4.14 (s,1H),3.98 (s,1H),3.67 (s,1H),3.56 (s,1H),3.27 (s,14H),2.52 (s,4H)。13C-NMR (101 MHz,DMSO-d6) δ156.64,152.85,149.54,140.38,119.83。

圖3 阿糖腺苷質(zhì)核比及結(jié)構(gòu)Fig.3 The m/z and structure of vidarabineA：阿糖腺苷HPLC圖譜；B：阿糖腺苷質(zhì)核比；C：阿糖腺苷結(jié)構(gòu)A：The HPLC spectrum of vidarabine;B:The m/z of vidarabine,C:The structure of vidarabine

3 討 論

本研究采用大孔樹脂吸附、正向硅膠、反相硅膠和葡聚糖凝膠逐步分離的方法，從柴達木沙漠鏈霉菌S10T中分離得到了阿糖腺苷。目前核苷類抗生素仍然依靠化學合成方法，在立體異構(gòu)的化合物合成時通常需要較為苛刻的反應條件，如需要重金屬試劑參與反應或需要較高的反應能量[15]，存在選擇性差、中間產(chǎn)物多和流程復雜等局限性[16-18]，因此從鏈霉菌中直接分離的方法對于發(fā)現(xiàn)核苷類抗生素仍然是必要的。

阿糖腺苷是一種核苷類抗生素，具有抑制多種病毒DNA聚合酶的活性，是一種有效的抗病毒藥物。阿糖腺苷首次發(fā)現(xiàn)于海綿中[19]，隨后Satoshi Omura等在鏈霉菌中也分離得到了阿糖腺苷，并發(fā)現(xiàn)其對刺膽草、馬地丁和藜麥具有較強的除草活性[20]。除此之外，阿糖腺苷最主要的生物活性為抗病毒活性，它能夠轉(zhuǎn)化為腺嘌呤三磷酸腺苷來抑制病毒DNA聚合酶。據(jù)Kamiyama等[21]報道，阿糖腺苷具有抑制阿昔洛韋抗性HSV(單純皰疹病毒)和VZV(水痘帶狀皰疹病毒)的活性。但是阿糖腺苷的抑菌活性未見報道，本研究也對該化合物進行了抑菌活性檢測，幾種測試菌測活結(jié)果顯示，該化合物并不具有抑菌活性。

Suhadolnik等[22]對阿糖腺苷在Streptomycesantibioticus中的生物合成進行了闡述。Wu等[23]發(fā)現(xiàn)在S.antibioticus中，阿糖腺苷與另一種治療血液腫瘤的藥物噴司他丁(pentostatin)由同一個生物合成基因簇負責合成。在菌株S10T中，通過對基因簇中的各個蛋白質(zhì)序列進行比對發(fā)現(xiàn)，這些基因并非成簇存在，且PenF與菌株S10T中的蛋白序列不存在相似性(表3)，因此在菌株S10T中可能存在與S.antibioticus不同的生物合成途徑。

表3 S. antibioticus中阿糖腺苷合成相關(guān)基因與菌株S10T中相關(guān)基因相似性對比Table 3 The relactive biosysthesis gene of Ara-A analyze between S.antibioticus and S10T

目前對于阿糖腺苷生物合成的研究報道僅S.antibioticus一株鏈霉菌，未見其他生物合成途徑的報道。本研究同時還分析了菌株S10T的次級代謝產(chǎn)物LC-HR-MS譜，從中并未找到噴司他丁的相對分子質(zhì)量，這說明菌株S10T僅能合成阿糖腺苷而不合成噴司他丁。因此可以證實菌株S10T中確實存在著與報道完全不同的阿糖腺苷合成途徑。

本研究從柴達木沙漠鏈霉菌S10T分離的化合物組分中發(fā)現(xiàn)，除阿糖腺苷外，其他組分對金黃色葡萄球菌和藤黃微球菌均具有抑菌活性，與陽性對照卡那霉素相比具有更高的抑菌效價。這也說明柴達木沙漠鏈霉菌S10T具有非常強大的抑菌活性產(chǎn)物合成能力，相關(guān)的生物活性還有待挖掘，以期能夠發(fā)現(xiàn)更多的活性天然產(chǎn)物。